Haute résolution La quantification du comportement Odor-guidée dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilisation de la<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Résumé

Le Flywalk système de suivi automatisé est utilisé pour la haute résolution de quantification comportement d'odeur guidé dans Drosophila melanogaster.

Résumé

Dans leur milieu naturel, les insectes comme la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster sont bombardés avec une énorme quantité de substances odorantes chimiquement distinctes. Pour compliquer encore les choses, les odeurs détectées par le système nerveux des insectes sont généralement pas de composés simples, mais les mélanges dont la composition et les ratios de concentration varier. Ceci conduit à une quantité presque infinie de différents stimuli olfactifs qui doivent être évaluées par le système nerveux.

Pour comprendre quels aspects d'une relance de l'odeur de déterminer son évaluation par la mouche, il est donc souhaitable d'examiner efficacement le comportement des odeurs guidé vers de nombreuses substances odorantes et mélanges d'odeurs. Pour corréler directement le comportement de l'activité neuronale, le comportement doit être quantifiée dans un délai comparable et dans des conditions identiques à celles de relance dans des expériences neurophysiologiques. Cependant, de nombreux essais biologiques olfactifs actuellement utilisés chez la drosophile neuroéthologie sont plutôt spécialisée soit vers l'efficacité ou vers la résolution.

Flywalk, un système de livraison de l'odeur et de suivi automatisé, comble le fossé entre l'efficacité et de la résolution. Il permet de déterminer exactement quand un paquet d'odeur stimulé une mouche marchant librement, et de déterminer les animal's réaction comportementale dynamique.

Introduction

L'objectif primordial de toute recherche neuroethological est d'établir un lien de causalité entre les états d'activité de neurones individuels ou circuits neuronaux et le comportement d'un organisme. Pour atteindre cet objectif de l'activité neuronale et le comportement doit être surveillée dans des conditions identiques de relance et ces conditions de relance devrait idéalement être similaires à ceux du système nerveux sous surveillance évolué pour donner un sens. Particulièrement quand il vient à des essais biologiques du comportement, ces exigences ont historiquement prouvé très exigeant dans Drosophila melanogaster neuroéthologie olfactif.

Une fois libéré de la source, des panaches d'odeur éclatent rapidement, en filaments minces avec la diffusion turbulente causé par le mouvement de l'air étant le principal déterminant de la distribution d'odeur ^1. En conséquence, un insecte naviguer vers une source d'odeur subit une stimulation intermittente avec des paquets d'odeurs avec des intervalles variables entrecoupées d'air propre. Les deuxla marche et les insectes volants - y compris la drosophile - ont été démontrés à exploiter ce régime de stimulation intermittente pour la navigation par vent sur ​​la flambée rencontre panache et principalement déplaçant vent de travers en l'absence d'odeurs ^{2 - 5.} Considérant que les procédures de stimulation dans des expériences physiologiques imiter largement celles d'un insecte peut vivre dans son environnement naturel, soit en fournissant bouffées simples d'odeurs entrecoupées de longues périodes de l'air ou des séquences de stimulation dynamiques ^{6 - 11,} de nombreux essais biologiques comportementaux utilisés dans Drosophila neuroéthologie tels que dosage de piège , arènes en plein champ ou T-labyrinthe reposent sur ​​odeur gradients ^{12 - 15.} Toutefois, en raison des gradients odeurs, par définition, sont variables en fonction de la concentration distance de la source des odeurs, un comportement particulier peut pas être attribuée à une concentration d'odeur précis en utilisant ces paradigmes. En outre, la pente deun gradient d'odeur dépend de façon critique sur les propriétés physico-chimiques de la substance odorante. Un gradient d'un composé très volatil sera moins profonde que celle créée par un composé moins volatile et donc plus difficiles à suivre pour un organisme comptant sur ​​la mesure des différences de concentration dans l'espace comme les seuls moyens de navigation ^{16 - 20,} ce qui peut conduire à une mauvaise interprétation des préférences olfactives notamment dans des essais de choix. Cet effet est également très préjudiciable lors d'enquêtes sur les comportements vers des mélanges d'odeurs car elle conduit à différents rapports de composants de mélange à chaque point de l'espace et donc à nouveau interdit à une corrélation claire entre la physiologie et le comportement.

Alors que des mouches du vinaigre ont tendance à se rassembler dans la fermentation de fruits, ils sont solitaires dans leur navigation vers les sources de nourriture et des sites de ponte. Néanmoins, plutôt que de tester les animaux individuels de nombreux paradigmes comportementaux utilisés chez la drosophile neuroetholoGY examiner le comportement de l'odeur-guidée de cohortes de mouches et de l'attraction est marqué comme la fraction de mouches qui choisissent l'odeur sur une relance de contrôle. Ces expériences de cohorte ont grandement contribué à la compréhension de la mouche neuroéthologie et la plupart des observations faites par leur utilisation pourrait être confirmé dans des expériences unique mouche. Cependant, il a été observé que les mouches peuvent influencer chaque décision other's ²¹ et dans les cas extrêmes, l'évaluation d'une odeur peut passer de l'indifférence à l'évitement selon la densité de la population ^22. En outre, les résultats de ces types d'expériences fournissent souvent uniquement le point de terminaison d'une séquence de décisions comportementales plutôt que d'observer ce qui fait à la volée tout en elle le fait, ce qui serait souhaitable lorsque l'on tente de mettre en corrélation avec le comportement de l'activité neuronale. Ces expériences de cohorte plutôt faible résolution sont contrastés par haute résolution méthodes seule mouche comme les arénas de vol captif et tapis roulants qui permettentpour une observation directe des réponses comportementales au moment où le stimulus est présenté ^20,23,24. Néanmoins, les expériences de la cohorte sont toujours populaires, car ils sont très efficaces et fournissent des résultats robustes, même à comparable tailles bas-échantillons, car la variabilité inter-individuelle et inter-procès sont partiellement en moyenne en raison de l'observation de populations sur des périodes de temps prolongées. Bien vol captif et tapis roulant offrent probablement la norme d'or concernant la présentation du stimulus et résolution temporelle, les arènes utilisés sont conçus pour les animaux simples et il est donc temps pour obtenir des tailles d'échantillon nécessaire pour une analyse statistique. Plusieurs autres approches ont été récemment mis au point qui permettent une acquisition efficace des données comportementales à haute résolution en combinaison avec un régime de relance bien défini. Ceux-ci comprennent sans surveillance suivi 3D de plusieurs mouches du vinaigre dans une soufflerie en combinaison avec un modèle 3D précise de l'odeur panache ⁵ , suivi de plusieurs mouches individuels dans les chambres de choix fournis avec les courants d'air des deux côtés ^{25 et} le paradigme Flywalk ^26.

Dans Flywalk, 15 mouches individuelles sont situées dans de petits tubes de verre et surveillés en permanence par une caméra de tête dans des conditions de lumière rouge. Les odeurs sont ajoutés à un courant d'air continu de 20 cm / sec et voyagent à travers les tubes de verre à une vitesse constante. Le courant d'air est humidifié par passage à travers flacons de 250 ml contenant de l'eau distillée (humidificateurs) avant d'entrer dans le système de distribution d'odeur. Les positions de flies' sont enregistrées dans une région carrée d'intérêt (ROI) qui englobe la majeure partie de la longueur des tubes d'odeurs (à l'exclusion des bords extérieurs des tubes (environ 5 mm de chaque côté), où les mouches peuvent pas se déplacer plus haut ou vent arrière) à l'époque de la présentation de l'odeur (figure 1A, B). Aller identités sont maintenues constantes par le système de suivi tout au long de l'expérience sur la base de leurs positions Y (ie leurs limites d'tube de verre). Stimulation de l'odeur est réalisé en utilisant un dispositif de stimulation multi-composant qui permet la présentation d'un maximum de 8 et de toutes les odeurs simples mélanges de ceux-ci possibles ^26,29 (figure 1B). Le cours d'un essai est commandé par un ordinateur de régulation du système de délivrance et de collecte de l'odeur température et d'humidité de l'information (ordinateur 1, la figure 1C). Cet ordinateur contrôle également un enregistreur de données (démarrage / arrêt de l'enregistrement) sur un deuxième ordinateur qui permet de suivre en permanence les positions de voler à 20 images par seconde (2) informatiques. Fly positions, état ​​de la vanne d'odeur (c.-à-point dans le temps de l'ouverture de la vanne), l'odeur ID, ​​la température et l'humidité autour de cycles de stimulation de l'odeur sont enregistrés sur l'ordinateur 2. De cette façon, des informations sur l'odeur et la mouche positions sont synchronisés et exportés au format .csv fichiers qui peut encore être traitées et analysées en utilisant les routines d'analyse écrite sur mesure. En raisonl'ensemble du système est contrôlé par ordinateur, sans intervention humaine est nécessaire au cours d'une session expérimentale.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

La construction et les détails techniques de Flywalk ont été décrites ailleurs ²⁶ (en cas de problèmes d'établir cette mise en place, de plus amples informations peuvent être obtenues à partir de MK). Ici nous nous concentrons sur des instructions détaillées sur la manipulation du paradigme qui aidera à obtenir des résultats fiables.

1. Fly Manutention

1. Arrière vole en bas de cultures moyennes de densité sur un milieu alimentaire en vertu d'un ²⁷ h 12: légères 12 h: régime sombre à 23-25 ​​° C et 70% d'humidité relative. À cette fin, permettre 20-30 adultes nouvellement émergé vole à reproduire dans un grand flacon alimentaire pendant 1 semaine, puis jetez-mouches adultes et attendre progéniture à émerger.
2. Recueillir 30-40 nouvellement écloses (âge <24 h) les mouches adultes et de leur âge sur la nouvelle dans un flacon contenant le milieu de la nourriture ²⁷ pendant 3-5 jours.
3. Vingt-quatre heures avant le début de l'expérience comportementale: Transférer la totalité 30-40 recueillis antérieurement 3-5 d vieille (voir 2.2) vole vers un nouveau vial contenant un bouchon en mousse de caoutchouc humide ou un mouchoir en papier humide à l'aide d'un aspirateur.
   REMARQUE: Ne pas anesthésier les mouches utilisant le CO _2.

2. Préparation de la configuration Flywalk

1. Utilisez bouteilles de 250 ml que les humidificateurs. Remplissez humidificateurs avec 100 ml d'eau distillée.
2. Préparer flacons d'odeurs.
   1. Préparer 10 ^-3 500 ul des dilutions de l'acétate d'éthyle pur odeurs, le butyrate d'éthyle, l'acétate d'isopentyle et de 2,3-butanedione dans le solvant de l'huile minérale.
   2. Fixez les deux clapets anti-retour de la balle par l'odeur du flacon. Notez que l'enregistrement vannes permettent une circulation d'air unidirectionnelle seulement. Par conséquent, la connexion clapets anti-retour de telle sorte que l'air puisse entrer dans le flacon d'un côté et le laisser sur l'autre côté.
   3. Retirer le couvercle d'un tube de réaction PCR de 200 pi. Pipeter 100 ul de chaque dilution des odeurs dans un tube de réaction séparé et placer les tubes dans des flacons d'odeurs distinctes. Aussi préparer un flacon d'odeur ne contenant que le solvant oi minéralel.
   4. Bien sceller les flacons d'odeurs en les fermant à l'aide des bouchons en acier inoxydable et joints en caoutchouc.
   5. Connecter les 5 flacons d'odeurs (4 odeurs contenant et 1 contenant de l'huile minérale) au système de livraison de l'odeur. Assurez-vous de les connecter dans le sens d'écoulement droite. Une mauvaise connexion ne sera pas seulement de compromettre l'expérience prévue, mais il peut aussi contaminer le système de livraison.
3. Vérifiez pour des fuites en scellant la sortie de la chambre de mélange du dispositif de relance. Assurez-vous que tous les débits d'air avant que le dispositif de relance maintenant tomber progressivement à zéro. Sinon, vérifier les fuites qui peuvent maintenant être identifiées par le sifflement de l'air sortant du système.
4. Soigneusement transférer 15 mouches individuelles aux 15 tubes de verre individuels en utilisant un aspirateur et des tubes de verre à proximité des deux côtés avec les adaptateurs correspondants.
   Remarque: Parce que le système doit être fermé hermétiquement pour des expériences réussies, veiller à ce que les adaptateurs intègrent des tubes de verre hermétiquementet notent que des tubes de verre peuvent se briser lors de cette étape. Prenez soin d'éviter les blessures en portant des gants et des lunettes de protection.
5. Raccorder les tubes de verre à la configuration Flywalk et, à partir de maintenant, attendez au moins 15 min avant de commencer l'expérience pour permettre mouches habituent au nouvel environnement.
6. Après la fixation des tubes de verre: vérifiez la lecture des compteurs de débit en aval numériques sur ordinateur 1 si les 16 débits d'air après les tubes de verre ajouter à la circulation de l'air dans le système. Jetez également un coup sur l'ordinateur 1, si l'humidité est entre 60% et 80%.
7. Conception protocole de relance contrôler la séquence et le calendrier des stimuli d'odeurs présentées aux mouches. Pour obtenir les données décrites par exemple, présents 4 odeurs et le contrôle (de l'huile minérale) isolés et tous ternaire possible et les mélanges quaternaires des odeurs simultanément pour 40 fois chacun. Définir la durée d'impulsion de 500 ms à un intervalle de 90 secondes interstimulus et aléatoire séquence de relance.
8. Allumez le lisource de lutte (LED-cluster; λ = 630). Assurez-vous de fournir assez de lumière pour le suivi efficace sans augmenter la température à l'intérieur des tubes de verre.
9. Mettre en place une région d'intérêt du système de suivi de piste en faisant glisser une trame à travers la zone à surveiller de manière à ce que les 15 tubes de verre sont incluses et environ 5 mm des bords des tubes sont exclus.
10. Mettre en place 14 lignes de séparation parallèles entre les tubes individuels dans le système de suivi en changeant leurs positions Y dans le script correspondant à garder individu vole identifiable tout au long de l'expérience. Assurez-vous de les positionner de telle sorte qu'il y ait toujours un tube de verre entre deux de ces lignes de séparation, car une seule mouche sera suivie entre un ensemble de deux lignes.
11. Assurez-vous de définir les paramètres de l'appareil photo de manière à ce que les mouches sont suivis de façon fiable à travers les tubes de verre. Si les mouches sont perdus sur les bords de la région d'intérêt, augmenter la luminosité ou le gain de poursuite software. Eviter les vibrations mécaniques du système de suivi. Suivre aide de logiciels commerciaux conformément au protocole du fabricant.
12. Début de l'expérience en lançant le protocole de relance. Enregistrez flies' XY coordonnées à 20 fps (images par seconde) et connectez-vous en combinaison avec l'état de la vanne d'odeur dans des fichiers texte.

Analyse des données 3.

REMARQUE: Les étapes suivantes dans l'analyse des données sont automatisées utilisant des routines écrites personnalisées programmées dans R. Parce que ces étapes sont essentielles pour obtenir des résultats significatifs de l'analyse sera néanmoins présenté d'une manière étape-par-étape. Les données brutes pour l'analyse sont .csv fichiers contenant des informations sur l'état synchronisé de la soupape d'odeur, nombre d'impulsions dans l'expérience et la mouche x 15 positions en cm sur un axe des temps commun pour cycle de stimulation d'une odeur. Le code personnalisé pour l'analyse des données peut être fourni sur demande.

1. Ouvrir fichier .csv, trouver le temps-point de ouverture de la soupape signifié par un chaESN dans la colonne représentant l'état de la vanne.
2. Calculer la fonction linéaire de la position de l'odeur de la forme
   f (t) = S * t + i
   où t est le temps dans le cycle de stimulation, s est la vitesse du vent (ici 20 cm / sec) et l'interception i peut être calculée selon le temps point l'odeur pénètre dans les tubes à la position 0 (ouverture de la vanne, plus de retard).
3. Trouver le point de moment où l'odeur et voler position x croisent pour chaque volée et régler ce temps-points à 0. Remarque: De cette façon, les positions de mouches sont alignés à chaque individual's rencontre avec l'odeur.
4. Exclure les mouches assis sur les bords mêmes de la région d'intérêt.
5. Calculer la vitesse à partir de X-positions en divisant le déplacement le long de l'axe x par l'intervalle de temps (100 ms) et répéter la procédure pour chaque cycle de stimulation.
6. Pour obtenir vitesse-temps des cours comme le montre la figure 2E calculer la vitesse moyenne du temps bien sûr pour chaque volée et l'odeur et de ceux l'évolution temporelle moyenne pour une odeur donnée.
7. Pour obtenir déplacement net, comme indiqué dans la figure 3C calculer le déplacement net dans les 4 secondes après l'impulsion de l'odeur pour chaque événement de suivi et après le déplacement net moyen par volée et l'odeur.

Procédure de nettoyage 4.

1. Nettoyer le verre Tubes
   1. Retirer les mouches et les adaptateurs de tubes de verre et profiter des tubes de verre dans un détergent.
   2. Rincer tubes de verre sous l'eau distillée en cours d'exécution et les sécher avec de l'air sous pression.
   3. Des tubes de verre à la chaleur à 200 ° C pendant 8 h.
2. Système de livraison de l'odeur propre
   1. Retirer tous les flacons d'odeur et les tubes de la chambre de mélange centrale.
   2. Retirer les adaptateurs de tubes de la chambre de mélange.
   3. Chambre de mélange propre en le rinçant avec une solution de nettoyage de laboratoire et des solvants (par exemple l'éthanol, l'acétone). Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire.
   4. Chambre de mélange à sec avec de l'air sous pression et chauffer à 200 ° C pendant 8 heures.
3. Nettoyer Odeur Flacons et clapets anti-retour
   1. Retirez le bouchon en acier (joint en caoutchouc de défausse) et clapets anti-retour à partir de flacons d'odeurs et de tremper tous les composants dans une solution de nettoyage de laboratoire.
   2. Soniquer composants dans un bain à ultrasons et les rincer avec de l'eau distillée.
   3. Nettoyez tous les composants sauf clapets avec de l'éthanol et de l'acétone. Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire.
   4. Composants secs avec de l'air sous pression et de la chaleur entre eux à 200 ° C pendant 8 heures.
   5. Clapets de retenue propre à l'intérieur en les rinçant avec de l'acétone et de l'éthanol en utilisant une seringue (considèrent sens de l'écoulement). Effectuez ces étapes sous le capot de laboratoire portant des lunettes de laboratoire. Parce que l'acétone attaque pièces en caoutchouc, immédiatement clapets secs en les rinçant avec de l'air sous pression.
   6. Éliminer les odeurs résiduelles en pulsant de l'air dans les clapets pendant plusieurs jours. Utilisez un incubateur à 60 ° C et un air sec sur 1/1 sec air hors régime pour cette étape de nettoyage.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Étant donné que les mouches sont autorisés à distribuer librement dans leurs tubes de verre entre les impulsions d'odeur et l'impulsion d'odeur se déplace à travers les tubes de verre à une vitesse constante vol rencontrent l'odeur à des moments différents en fonction de leur position-x au moment de la stimulation. En conséquence, les onsets des trajectoires au vent évoqués par une impulsion ms 500 d'une jolie 10 ^-3 dilution de l'acétate d'éthyle sont décalées d'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Bien que le système Flywalk semble assez sophistiqué, à première vue, une fois mis en place et en cours d'exécution, il est facile à utiliser et produit des résultats très robustes. Pour souligner la cohérence des résultats obtenus avec le dosage biologique, on peut dire que les résultats représentatifs présentés ici ont été obtenues presque 2 ans après que certains des résultats présentés dans une étude précédente ²⁹ avec une configuration modifiée à l'aide d'un nouveau l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany