臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

要約

自動追跡システムFlywalkは、 キイロショウジョウバエにおける臭気誘導挙動の高解像度の定量化のために使用されます。

要約

それらの天然の環境では、このような酢ショウジョウバエを飛ぶ昆虫としては、化学的に異なる臭気物質の膨大な量にさらされています。さらに問題を複雑にし、昆虫の神経系で検出された臭いは、通常、その組成及び濃度比異なり、単一の化合物が、混合物ではありません。これは、神経系によって評価する必要が異なる嗅覚刺激のほとんど無限量につながります。

匂い刺激の態様はハエによりその評価を決定するかを理解するためには、効率的に多くの臭気物質や臭気混合物に向かって臭気誘導挙動を検討することが望ましいです。直接神経活動への行動を相関させるために、動作は、同等の時間枠内や神経生理学実験のように、同一の刺激条件の下で定量化する必要があります。しかし、 ショウジョウバエの神経動物行動学における多くの現在使用されている嗅覚バイオアッセイはステーキむしろあります効率に向かってまたは解決に向けどちらかlized。

Flywalk、自動化された臭気の配信と追跡システムは、効率性と解像度間のギャップを埋めます。これは、臭気パケットが自由に歩いてフライを刺激し、animal'sに動的な挙動反応を決定するために、正確にいつの決意を可能にします。

概要

任意のneuroethological研究の包括的な目標は、単一ニューロンまたは神経回路の活動状態や生物の行動との因果関係を確立することです。この目標神経活動と行動を達成するために、同一の刺激条件の下で監視されるべきであり、これらの刺激条件は、理想的に精査下神経系はの意味を理解するために進化したものと同様である必要があります。それは行動のバイオアッセイに来るとき特に、これらの要件は、歴史的に非常に嗅覚神経動物行動学ショウジョウバエショウジョウバエに厳しいことが証明されています。

ソースから解放されると、臭気プルームは急速に空気の動きが臭い分布¹の主な決定要因であることに起因する乱流拡散に細いフィラメントに別れます。その結果、臭気源に向かって移動する昆虫は、きれいな空気の可変間隔で散在臭気パッケージと断続的な刺激を経験します。両ウォーキングや昆虫飛行- ショウジョウバエ含めて- ^{5 -}臭²の不在下で横風を動かす主にプルームの遭遇時に風上押し寄せると、ナビゲーションのために、この断続的な刺激体制を活用することが実証されています。このようなトラップアッセイなどのショウジョウバエ神経動物行動学で使用される^11、多くの行動のバイオアッセイ^-生理実験における刺激手順のに対し、主に昆虫がきれいな空気または動的刺激系列⁶の延長期間が散在する悪臭のいずれかの提供する単一のパフによって、その自然環境の中で発生する可能性があり、それらの模倣^{15 - 、}オープンフィールドアリーナまたはT迷路は臭気勾配¹²に依存しています。定義により匂い勾配が臭気源からの距離に応じて濃度が可変であるため、しかし、特定の動作は、これらのパラダイムを使用して、正確な臭気濃度に起因することはできません。加えて、勾配匂い勾配が批判臭剤の物理化学的特性に依存します。誤った解釈につながる可能性が^{20、 -}揮発性の高い化合物の勾配は、揮発性の低い化合物によって作成されたものよりも浅いとナビゲーション¹⁶の唯一の手段として、空間内の濃度差を測定することに依存する生物のために追跡するためにも難しくなります特に選択アッセイにおける嗅覚嗜好の。臭気混合物に向けて行動を調査するとき、それは空間内のすべての点で異なるブレンド成分の比率につながるため、再び生理と行動との間に明確な相関関係を排除するため、この効果も非常に有害です。

酢のハエが果物を発酵に凝集する傾向があるが、それらは食料源と産卵サイトに対する彼らのナビゲーションで孤独です。それにもかかわらず、個々の動物をテストするのではなく、多くの行動パラダイムは、 ショウジョウバエ neuroetholoで使用GYは、ハエのコホートの匂い誘導挙動を調べ、魅力はコントロール刺激臭の上を選ぶハエの割合として採点されます。これらのコホート実験はフライ神経動物行動学の理解に大きく貢献してきたし、それらを使用して行われた観察の多くは、シングルフライ実験で確認することができました。しかし、各other's決定^{21に影響を与える}ことができ、極端な場合には臭気の評価は、人口密度²²に応じて回避するために無関心で切り替えることができる飛ぶことが観察されました。さらに、実験のこれらの種類の結果は、多くの場合、神経活動と行動を相関しようとするとことが望ましいであろう、むしろ、それはそれをやっている間にその場で何が行われているか観察するよりも、行動決定のシーケンスの唯一のエンドポイントを提供します。これらのかなり低い解像度のコホート実験は、このようなことができ繋留飛行アリーナやトレッドミルのような高解像度のシングルフライ方法によって対比されます刺激が^20,23,24提示された時点での行動反応を直接観察するため。彼らは非常に効率的であり、個人間のと試行間変動するのであっても比較的低いサンプルサイズで堅牢な結果を提供するため、それにもかかわらず、コホート実験は、まだ普及している部分的に起因する長期間にわたって集団の観察に平均化されます。繋留飛行とトレッドミルは、おそらく刺激提示と時間分解能に関するゴールドスタンダードを提供していますが、使用するアリーナは、単一の動物のために設計されており、それは、したがって、時間のかかるサンプルを得るためには、統計分析のために必要なサイズです。他のいくつかのアプローチが最近十分に定義された刺激レジメンと組み合わせた高解像度行動データの効率的な収集を可能にするように開発されてきました。これらは、臭気プルーム⁵の正確な3次元モデルとの組み合わせで風洞内に複数の酢ハエの教師なし3D追跡を含みます、両側²⁵とFlywalkパラダイム^26からの空気流が供給される選択肢室内の複数の個々のハエを追跡。

Flywalkでは、15個々のハエは、小さなガラス管に配置されており、継続的に赤色光条件下でのオーバーヘッドカメラで監視しました。臭気は20 cmで/秒の連続的な気流に加え、一定の速度でガラス管を通過しています。気流は、臭気デリバリーシステムに入る前に、蒸留水（加湿）を含む250 mlのボトルを通過させることにより加湿され​​ます。 flies'位置はハエがさらにアップ移動したりすることはできません利息（ROI）の正方形領域臭管の長さの大部分を包含する（ただし、チューブ（各側に約5mmの外縁を除く）内に記録されています風下）臭いプレゼンテーション（ 図1A、B）の頃。フライIDがトラッキングシステムtで一定に保たれますそのY-位置（ すなわち 、そのガラス管の制限）に基づいて実験をhroughout。匂い刺激は、最大8単臭気及び^26,29（ 図1B）、そのすべての可能な混合物の提示を可能にする多成分の刺激装置を用いて達成されます。実験の過程は、コンピュータ臭気送達系を調節し、温度と湿度の情報を収集する（コンピュータ1、 図1C）によって制御されます。このコンピュータはまた、継続的に毎秒20フレーム（コンピュータ2）で飛行位置を追跡する別のコンピュータ上のデータロガーを（/ストップ記録を開始）を制御します。位置、臭気バルブの状態（開弁すなわち時点）、臭気ID、匂い刺激サイクルの周囲の温度と湿度をコンピュータ2に臭いにこの方法で情報をログに記録された位置を飛行しているが、これは.csvファイル-ファイルとして同期され、輸出されているフライさらに処理され、カスタム書かれた解析ルーチンを使用して分析することができます。ため、システム全体がコンピュータ制御で、全く人間の介入は、実験セッション中に行う必要はありません。

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プロトコル

Flywalkの建設と技術的な詳細は、別の場所で^26（MKから得ることができ、これはセットアップ、さらに情報を確立するすべての問題の場合）に記載されています。ここでは、信頼性の高い結果を得るのに役立ちますパラダイムの取り扱いに関する詳細な手順に焦点を当てています。

1.フライ取り扱い

1. 12時間の明：23〜25°Cおよび相対湿度70％の暗所政権リアは12時間の下に食品媒体²⁷上の中密度培養に低に飛びます。このため、許可20-30新興大人は大人のハエを破棄し、出現する子孫のを待ち、その後、1週間に大きな食品バイアルに再現する飛びます。
2. 30-40新たに出現し（年齢<24時間）大人のハエを収集し、3〜5日間の食品^媒体 27 ^{を含む新しい}バイアルにそれらを熟成。
3. 行動実験の開始前に二十四時間：すべての30-40以前に収集された3-5日齢の転送は（2.2参照）は、新しいVIに飛びますアルは、湿ったゴム発泡体プラグや吸引器を使用して、湿ったティッシュペーパーを含みます。
   注：CO _{2を使用して}ハエを麻酔しないでください。

Flywalkセットアップの調製

1. 加湿器として250ミリリットルのボトルを使用してください。 100mlの蒸留水で加湿器を埋めます。
2. 臭気バイアルを準備します。
   1. 純粋な臭い酢酸エチル、酪酸エチル、酢酸イソペンチル、溶媒鉱油中の2,3-ブタンジオン500μlの10 ^-3希釈液を調製します。
   2. 臭気バイアルごとに2つのボールチェックバルブを取り付けます。バルブは唯一の単方向の気流を可能にそのチェックに注意してください。したがって、空気は一方の側にバイアルを入力して、反対側にそれを残すことができるように、チェックバルブを接続します。
   3. 200μlのPCR反応チューブの蓋を外します。別々の反応管に、すべての臭気希釈液100μlをピペットで、別の匂いバイアルにチューブを配置します。また、溶媒のみのミネラルOIを含むもの臭気バイアルを準備リットル。
   4. しっかりとステンレス鋼の栓とゴムガスケットを使用して閉じることによって臭気バイアルを密封します。
   5. 臭気送達システム5臭気バイアル（鉱油を含む4を含む臭気1）を接続します。右流れ方向にそれらを接続することを確認します。誤った接続は、計画された実験を損なうだけでなく、それはまた、配信システムを汚染する可能性があります。
3. 刺激装置の混合室の出口を封止することによって漏れがないか確認してください。刺激装置の前にすべての空気流は、今徐々にゼロに低下していることを、確認してください。ない場合は、ここでシステムを出る空気のシューという音で確認することができる漏れをチェック。
4. 慎重に対応するアダプタを使用して、両側の吸引器と近いガラス管を使用して15個々のガラス管に15個々のハエを転送します。
   注：システムは、気密成功の実験のために密封されなければならないので、アダプタがしっかりとガラス管に合うことを確認してくださいガラス管は、このステップの間に壊れる可能性があることに注意してください。保護手袋やゴーグルを身に着けていることによって怪我をしないように注意してください。
5. Flywalkセットアップにガラス管を接続し、ここにから、ハエは新しい環境に慣れることができるように、実験を開始する前に、少なくとも15分間待ちます。
6. ガラス管を取り付けた後：16気流場合ガラス管がシステムに入る空気の流れまで追加した後に、コンピュータ1に後段のデジタル流量計の読み出しを確認してください。湿度が60％から80％の間である場合にも、コンピュータ1上でご確認ください。
7. ハエに提示匂い刺激の順序やタイミングを制御するデザイン刺激プロトコル。 例えば記載されたデータは、本4臭いと制御（鉱物油）は、単独で、すべての可能な三元と40倍ごとに、同時に悪臭の四混合物を得るために。 90秒の刺激間隔で500ミリ秒のパルス持続時間を設定し、刺激シーケンスをランダム化。
8. 李に切り替えGHTソース（LEDクラスター;λ= 630）。ガラス管内部の温度を増加させることなく、効率的なトラッキングのために十分な光を提供することを確認します。
9. すべての15のガラス管が含まれるように監視すると、チューブの端部の約5mmを除く領域を横切ってフレームをドラッグすることにより、追跡システムの関心領域を設定します。
10. 実験を通して識別可能な個々のハエを維持するために、対応するスクリプトでのY-位置を変更することにより、追跡システム内の個々の管の間の14の平行分離線を設定します。唯一のフライが二行の任意のセットとの間で追跡されますので、そのような2つの区切り線の間に1つのガラス管が常に存在するような方法でそれらを配置することを確認します。
11. ハエを確実にガラス管全体に追跡されるようにカメラパラメータを設定してください。ハエは、関心領域のエッジで失われた場合、トラッキングSの輝度又はゲインを増やしますoftware。追跡システムの機械的振動を避けてください。製造業者のプロトコルに従って、市販のソフトウェアを使用して追跡します。
12. 刺激プロトコルを開始することによって、実験を開始します。録音は20 FPS（秒あたりのフレーム数）でのXY座標をflies'、テキストフ​​ァイル内の臭気バルブの状態との組み合わせでログインします。

3.データ分析

注：これらの手順は、分析は、それにもかかわらず、段階的に提示される意味のある結果を得るために重要であるため、データ分析の次のステップは、Rにプログラムされたカスタム書かれたルーチンを使用して自動化されています。分析用の生データは1匂い刺激サイクルのための共通の時間軸上のCMで臭いバルブの状態、パルス数の実験では、15フライのx位置に同期された情報を含む.csvファイル・ファイルです。データ分析のためのカスタムコードは、要求に応じて提供することができます。

1. オープンの.csvファイル、CHAによって示されるバルブ開度の時点を見つけますバルブの状態を表す列でNGE。
2. フォームの臭気位置の線形関数を計算します
   F（t）は、のS * tを= I +
   tは刺激サイクルの時間である、sは風速（ここでは20センチメートル/秒）と私は臭いが位置0（バルブ開度プラス遅延）でチューブに入った時点を用いて計算することができる切片です。
3. これは臭い時点を見つけ、すべてのが飛ぶと0（注）この時点を設定するためのx位置が交差フライ：フライ位置が各individual'sに整列している。この方法は、臭気を発生します。
4. 関心領域の非常に縁に座ってハエを除外します。
5. すべての刺激サイクルのための時間間隔（100ミリ秒）を繰り返し手順によってx軸に沿った変位を分割することによって、X位置の速度を算出します。
6. 図2Eに示すように、すべてのハエや臭いのために、与えられた臭気のものの平均時間経過から平均速度が時間経過を計算し、速度、時間のコースを取得するには。
7. 図3Cに示すように、ネットの変位を得るためには、すべてのイベント追跡用の臭気パルス、その後フライや臭いあたりの平均純変位後4秒以内のネット変位を計算します。

4.クリーニング手順

1. きれいなガラス管
   1. ガラス管からハエやアダプターを取り外し、洗剤でガラス管を浸します。
   2. 実行中の蒸留水の下でガラス管を洗浄し、加圧された空気を使用してそれらを乾燥させてください。
   3. 8時間200℃で加熱ガラス管。
2. クリーン臭気配信システム
   1. 中央の混合室からすべての臭気バイアルとチューブを外します。
   2. 混合室からチューブアダプタを削除します。
   3. 実験室の洗浄溶液および溶媒（ 例えば、エタノール 、アセトン）でそれを洗浄することによって清浄な混合室。実験室のフードの下で次の手順を実行します。
   4. 乾式混合室に加圧空気を使用し、8時間200℃でこれを加熱します。
3. クリーン臭いバイアルとバルブを確認してください
   1. スチールプラグ（廃棄ゴムパッキン）を取り外し、臭気バイアルからバルブをチェックして、実験用洗浄液にすべてのコンポーネントを浸します。
   2. 超音波浴中で超音波処理コンポーネントおよび蒸留水でそれらを洗い流してください。
   3. エタノール及びアセトンでチェックバルブを除くすべてのコンポーネントを清掃してください。実験室のフードの下で次の手順を実行します。
   4. 乾燥成分は、加圧空気を使用し、8時間200℃でこれを加熱します。
   5. 注射器を用いて、エタノール、アセトンでそれらをフラッシュすることにより、内部のクリーンチェックバルブ（流れの方向を検討します）。実験用ゴーグルを身に着けている実験室のフードの下で次の手順を実行します。アセトンは、加圧された空気でそれらをフラッシュすることによって、直ちにゴム部品、ドライチェックバルブを攻撃するので。
   6. 数日間の逆止弁を介して空気をパルスすることによって、残留悪臭を除去します。この洗浄工程のために60℃のインキュベーターと政権オフ/ 1秒の空気に1秒の空気を使用してください。

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結果

ハエは、一定の速度でガラス管を介して臭気パルス及び臭気パルスが伝わる間にそれらのガラスチューブ内で自由に配布することが許可されているので、ハエは、刺激の時点でそれらのx位置に応じて異なる時間に臭気が発生します。その結果、酢酸エチルの魅力10 ^-3希釈の500ミリ秒パルスによって誘発される風上軌道の発症は、に近い座ってハエに比べて、そのガラス管の風下終わ?...

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ディスカッション

Flywalkシステムを一度セットアップし、実行している、一見かなり洗練されたに見えますが、それは使いやすく、非常に堅牢な結果を生成します。バイオアッセイで得られた結果の一貫性を強調するためには、ここに示した代表的な結果は、ほぼ2年新しいトラッキングソフトウェアおよび光源を使用して変更する設定で、以前の研究²⁹に示した結果のいくつかの後に得られたといえま...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany