Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Zusammenfassung

Das automatisierte Nachführsystem Flywalk ist für hochauflösende Quantifizierung der Art der Duft Verhalten in Drosophila melanogaster verwendet.

Zusammenfassung

In ihrer natürlichen Umgebung, Insekten wie der Essig Drosophila melanogaster sind mit einer riesigen Menge an chemisch verschiedenen Geruchsstoffen bombardiert. Um die Sache noch weiter zu komplizieren, die von der Insektennervensystems erkannt Gerüche in der Regel nicht einzelne Verbindungen, sondern Gemische, deren Zusammensetzung und Konzentrationsverhältnisse variieren. Dies führt zu einer nahezu unbegrenzten Anzahl unterschiedlicher olfaktorischer Stimuli, die durch das Nervensystem untersucht werden müssen.

Zu verstehen, welche Aspekte eines Geruchsreiz bestimmen dessen Auswertung durch die Fliege, ist es daher wünschenswert, geruchs geführt Verhalten gegenüber vielen Riechstoffe und Geruchsmischungen effizient überprüft werden. Um Verhalten neuronaler Aktivität direkt korrelieren, sollte das Verhalten in einem vergleichbaren Zeitrahmen und unter identischen Stimulus Bedingungen wie in neurophysiologischen Experimenten quantifiziert werden. Viele derzeit verwendete Geruchs Biotests in Drosophila Neuroethologie sind jedoch eher specialized entweder in Richtung Effizienz oder zur Auflösung.

Flywalk, ein automatisiertes Geruchs Lieferung und Tracking-System, schließt die Lücke zwischen Effizienz und Auflösung. Es ermöglicht die Bestimmung, wann genau ein Geruch Paket stimuliert ein frei herumlaufenden Fliege und die animal's bestimmen dynamische Verhaltensreaktion.

Einleitung

Das übergeordnete Ziel einer jeden neuroethologischen Forschung ist es, einen ursächlichen Zusammenhang zwischen den Aktivitätszuständen einzelner Neuronen oder neuronalen Schaltkreisen und dem Verhalten eines Organismus etablieren. Um dieses Ziel zu erreichen, die neuronale Aktivität und Verhalten sollte unter identischen Reizbedingungen überwacht werden und diese Reizbedingungen sollten idealerweise ähnlich denen das Nervensystem auf dem Prüfstand entwickelt, um Sinn zu machen. Besonders, wenn es um Verhaltens Biotests kommt, haben diese Anforderungen historisch in Drosophila melanogaster als recht anspruchs olfaktorischen Neuroethologie.

Einmal von der Quelle freigesetzt, Geruchswolken rasch zerfallen in dünne Filamente mit turbulente Diffusion durch Luftbewegung ist der wichtigste Faktor für die Geruchsverteilung ¹ verursacht. Als Ergebnis wurde ein Insekten Navigieren zu einer Geruchsquelle erfährt intermittierende Stimulation mit Geruchs Paketen mit variablen Abständen von Reinluft durchsetzt. BeideFuß und fliegenden Insekten - einschließlich Drosophila - wurde gezeigt, dass diese intermittierende Stimulationsregime für die Navigation durch die nach plume Begegnung wogenden gegen den Wind und vor allem bewegte Seitenwind in der Abwesenheit von Gerüchen ² nutzen ^{- 5.} Der Erwägung, dass die Stimulation Verfahren in physiologischen Experimenten weitgehend imitieren die ein Insekt kann in seiner natürlichen Umgebung entweder durch Bereitstellung von einzelnen Zügen von Gerüchen mit längerer saubere Luft oder dynamische Stimulationssequenzen ⁶ durchsetzt erleben ^{- 11,} viele Verhaltens Biotests in Drosophila Neuroethologie verwendet wie Trap-Assay , Open-field-Arenen oder T-Labyrinth verlassen sich auf geruchs Gradienten ^12-15. Da jedoch Geruchs Gradienten definitions sind variabel in Konzentration in Abhängigkeit vom Abstand von der Geruchsquelle, ein bestimmtes Verhalten nicht auf eine genaue Geruchskonzentration unter Verwendung dieser Paradigmen zurückzuführen. Darüber hinaus ist die Steigung derein Geruch Gradienten kritisch, hängt von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Geruchsstoff. Ein Gradient von einem sehr volatilen Verbindung wird flacher als die von einer weniger flüchtigen Verbindung und damit auch schwieriger für einen Organismus unter Berufung auf Messen Konzentrationsunterschiede im Raum als das einzige Mittel der Navigation ¹⁶ zu verfolgen ^{- 20,} was zu einer Fehlinterpretationen führen kann der Geruchspräferenzen insbesondere in Wahl-Assays. Dieser Effekt ist auch sehr nachteilig bei der Untersuchung von Verhalten gegenüber Geruchsmischungen, da sie zu unterschiedlichen Mischungskomponente Verhältnisse an jedem Punkt im Raum und damit wieder schließt eine klare Korrelation zwischen Physiologie und Verhalten.

Während Fruchtfliegen sind in der Regel auf gärenden Früchten aggregieren, sind sie einsam in ihrer Navigation in Richtung Nahrungsquellen und Eiablage Websites. Dennoch in Drosophila neuroetholo verwendet, anstatt die Prüfung einzelner Tiere viele Verhaltensparadigmengy prüft die Art der Duft Verhalten Kohorten von Fliegen und Anziehung als die Fraktion von Fliegen Wahl der Geruch über einen Steuer Stimulus erzielt. Diese Kohorte Experimente haben wesentlich zum Verständnis der Fliege Neuroethologie beigetragen und viele der Beobachtungen durch Verwendung von diesen hergestellt könnte in Einzel fly Experimenten bestätigt werden. Allerdings hat sich gezeigt, daß sich gegen other's Entscheidung ²¹ beeinflussen und im Extremfall die Auswertung eines Geruchs aus Gleichgültigkeit wechseln je nach Bevölkerungsdichte ^{22 bis} Vermeidung fliegt. Zusätzlich ergibt sich aus dieser Art von Experimenten bieten oft nur den Endpunkt einer Abfolge von Verhaltensentscheidungen anstatt zu beobachten, was die Flug tut, während sie es tut, was wünschenswert wäre, wenn versucht wird, das Verhalten, die mit neuronaler Aktivität korrelieren. Diese eher niedriger Auflösung Kohorten Experimente werden durch hochauflösende Single-fly Methoden wie Fesselflug Arenen und Laufbänder, die erlauben, gegenübergestelltfür eine direkte Beobachtung der Verhaltensreaktion zum Zeitpunkt der dargeboten wird, ^20,23,24. Dennoch sind Kohorten Versuche immer noch beliebt, denn sie sind sehr effizient und bieten robuste Ergebnisse auch bei vergleichsweise geringen Stichprobengrößen, weil interindividuelle und interTestVariabilität sind teilweise sich durch die Beobachtung von Populationen über einen längeren Zeitraum gemittelt. Während Fesselflug und Laufband wahrscheinlich bieten die Goldstandard zur Reizdarbietung und zeitlicher Auflösung, die verwendeten Arenen für Einzeltiere konzipiert und daher zeitaufwändig, zu erhalten Probengrößen, die für eine statistische Analyse ist. Mehrere andere Ansätze wurden kürzlich entwickelt, dass eine effiziente Übernahme von hochauflösenden Verhaltensdaten in Kombination mit einem gut definierten Stimulus-Regime zu ermöglichen. Dazu gehören unbeaufsichtigt 3D-Verfolgung mehrerer Fruchtfliegen in einem Windkanal in Kombination mit einer genauen 3D-Modell der Geruchsfahne ⁵ , Verfolgung mehrerer Einzel Fliegen in Wahl Kammern mit Luftströmen von beiden Seiten ^{25 und der} Flywalk Paradigmen ^{26 zugeführt.}

In Flywalk werden 15 einzelne Fliegen in Glasröhrchen entfernt und kontinuierlich von einem Overhead-Kamera unter Rotlichtbedingungen überwacht. Gerüche zu einem kontinuierlichen Luftstrom von 20 cm / s aufgenommen und wandern durch den Glasrohren mit einer konstanten Geschwindigkeit. Der Luftstrom wird durch Hindurchleiten durch 250 ml-Flaschen vor dem Eintritt in den Geruch Abgabesystem destilliertem Wasser (Befeuchter) enthält befeuchtet. Die flies' Positionen innerhalb eines quadratischen Bereichs von Interesse (ROI) umfassende Großteil der Länge der Geruchsrohre (aber ohne die Außenränder der Rohre (etwa 5 mm auf jeder Seite), wobei die Fliegen nicht weiter aufwärts bewegen oder aufgezeichneten Windrichtung) um die Zeit der Geruch Präsentation (1A, B). Fliegen Identitäten werden durch das Trackingsystem t konstant gehalten wirdberall das Experiment auf der Grundlage der Y-Positionen (dh ihre Glasrohr Grenzen). Geruchsstimulation unter Verwendung eines Mehrkomponenten-Reizeinrichtung, welche die Darstellung von bis zu 8 Einzel Gerüche und alle möglichen Mischungen davon ^26,29 (1B) können erreicht werden. Der Verlauf eines Experiments wird von einem Computer zur Regelung der Geruchsabgabesystems und zur Temperatur und Feuchtigkeitsinformation (Computer 1, 1C) gesteuert werden. Dieser Computer steuert auch einen Datenlogger (Aufnahme starten / stoppen) auf einem zweiten Computer, der kontinuierlich verfolgt fly Positionen bei 20 Frames pro Sekunde (Computer 2). Fliegen Positionen, Geruch Ventilstatus (dh Zeitpunkt der Ventilöffnung), Geruch ID, Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Umgebung von Geruchsstimulationszyklen auf Computer 2. Auf diese Weise Informationen über Geruchsloggt und fliegen Positionen synchronisiert und als .csv-Dateien exportiert die weiter verarbeitet werden und mit Hilfe speziell geschriebenen Analyseroutinen analysiert. weildas ganze System computergesteuert ist, ist keine menschliche Intervention während einer experimentellen Sitzung notwendig.

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Protokoll

Der Aufbau und die technischen Details der Flywalk habe an anderer Stelle ²⁶ (im Falle von Problemen der Gründung dieser Einrichtung, weitere Informationen erhalten Sie von MK erhalten werden) beschrieben worden. Hier konzentrieren wir uns auf detaillierte Anweisungen für den Umgang mit dem Paradigma, das hilft, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten wird.

1. Fly Handhabung

1. Rück fliegt in niedriger bis mittlerer Dichte Kulturen auf ^{Nahrungsmedium} 27 unter einem 12 Stunden: 12 Stunden Licht: dark-Regime bei 23-25 ​​° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit. Zu diesem Zweck lassen 20-30 neu entstandenen erwachsenen Fliegen in einem großen Lebensmittelfläschchen für 1 Woche zu reproduzieren und wirf dann erwachsenen Fliegen und warten Nachkommen entstehen.
2. Sammeln Sie 30 bis 40 neu entstandenen (Alter <24 h) erwachsenen Fliegen und Alter sie auf in neue ein Gefäß ^{Nahrungsmedium} 27 für 3-5 Tage.
3. Vierundzwanzig Stunden vor dem Start des Verhaltensexperiment: Übertragen Sie alle 30-40 zuvor gesammelten 3-5 d alt (siehe 2.2) fliegt zu einem neuen vial, die eine feuchte Schaumgummi-Stecker oder ein feuchtes Tissue-Papier unter Verwendung eines Gebläses.
   HINWEIS: betäuben Nicht Fliegen _mit CO 2.

2. Herstellung des Flywalk Einrichtungs

1. Verwenden Sie 250 ml Flaschen als Luftbefeuchter. Füllen Luftbefeuchter mit 100 ml destilliertem Wasser.
2. Bereiten Geruchsdurchstechflaschen.
   1. Vorzubereiten 500 ul ¹⁰ -3 Verdünnungen der reinen Geruchs Ethylacetat, Ethylbutyrat, Isopentylacetat und 2,3-Butandion in dem Lösungsmittel Mineralöl.
   2. Befestigen Sie zwei Kugelventile pro Geruch Fläschchen. Beachten Sie, dass Rückschlagventile erlauben nur unidirektionale Luftstrom. Daher verbinden Rückschlagventile in der Weise, dass Luft in das Fläschchen auf einer Seite eingeben und lassen Sie es auf der anderen Seite.
   3. Entfernen Sie den Deckel von einem 200 & mgr; l PCR-Reaktionsgefäß. Je 100 & mgr; l von jedem Geruch Verdünnung in einem separaten Reaktionsrohr und legen Sie die Röhrchen in getrennte Geruchsdurchstechflaschen. Auch bereiten einen Geruch Ampulle, die nur das Lösungsmittel mineral oil.
   4. Dicht verschließen Geruch Fläschchen durch Schließen sie mit Edelstahl-Steckern und Gummidichtungen.
   5. Schließen Sie die 5 Geruchsfläschchen (4 enthält, Gerüche und 1, die Mineralöl), um den Geruch Delivery-System. Achten Sie darauf, sie in die richtige Durchflussrichtung zu verbinden. Ein Falschanschluss wird nicht nur beeinträchtigen die geplanten Experiment, aber es kann auch verunreinigen das Liefersystem.
3. Dichtheit prüfen durch Abdichten der Auslass der Mischkammer des Stimulus-Gerät. Stellen Sie sicher, dass alle Luftströme vor dem Stimulus-Gerät nun schrittweise bis auf Null sinken. Wenn nicht, auf Dichtheit prüfen, die nun durch die zischendes Geräusch von Luft, die aus dem System identifiziert werden können.
4. Sorgfältig über 15 Einzel Fliegen zu 15 einzelnen Glasröhrchen unter Verwendung eines Gebläses und in der Nähe Glasröhren auf beiden Seiten mit den entsprechenden Adaptern.
   Hinweis: Da das System muss hermetisch für erfolgreiche Experimente abgedichtet werden, sicherzustellen, dass Adapter passen Glasröhrchen festund beachten Sie, dass Glasröhrchen können bei diesem Schritt zu brechen. Achten Sie darauf, um Verletzungen von Schutzhandschuhen und Schutzbrillen tragen zu vermeiden.
5. Schließen Sie die Glasrohre an den Flywalk und Setup, von hier aus, warten Sie mindestens 15 Minuten vor dem Start des Experiments, damit Fliegen um an die neue Umgebung zu gewöhnen.
6. Nach dem Anbringen Glasröhren: überprüfen Sie das Auslesen der nachgeschalteten digitalen Durchflussmesser auf dem Computer 1, wenn die Luftströme 16, nachdem die Glasröhren summieren sich zu dem Luftstrom in das System gelangen. Sie können auch auf Computer 1, wenn die Luftfeuchtigkeit zwischen 60% und 80%.
7. Design Stimulusprotokoll Steuern der Reihenfolge und den Zeitpunkt von Geruchsreize den Fliegen dargestellt. Um beispielsweise den beschriebenen, vorliegenden 4 Gerüche und der Steuerung (Mineralöl) einzeln und alle möglichen ternären und quaternären Mischungen der Gerüche gleichzeitig 40mal jeweils erhalten. Stellen Impulsdauer auf 500 ms bei einem Interstimulusintervall von 90 sec und randomisieren Reizfolge.
8. Schalten Sie den light Quelle (LED-Cluster; λ = 630). Achten Sie darauf, genügend Licht für ein effizientes Tracking ohne Erhöhung der Temperatur im Inneren der Glasröhren bereitzustellen.
9. Einen interessierenden Bereich des Verfolgungssystems durch Ziehen eines Rahmens über die Fläche in einer solchen Weise, dass alle 15 Glasrohre enthalten überwacht und etwa 5 mm von den Kanten der Rohre sind ausgeschlossen eingestellt.
10. Bis 14 parallele Trennlinien zwischen den einzelnen Rohren in dem Verfolgungssystem durch Änderung der Y-Position in der dazugehörigen Skript einzelne Halten gesetzt fliegt während des gesamten Versuchs erkennbar. Achten Sie darauf, um sie so zu positionieren, dass es immer ein Glasrohr zwischen zwei solchen Trennlinien, da nur eine Fliege zwischen jedem Satz von zwei Linien verfolgt werden.
11. Achten Sie darauf, Kameraparameter in einer Weise, die zuverlässig in den Glasröhren Verfolgt werden fliegt gesetzt. Wenn Fliegen werden an den Rändern der Region von Interesse verloren, erhöhen die Helligkeit oder die Verstärkung des Tracking-software. Vermeidung von mechanischen Schwingungen des Verfolgungssystems. Verfolgen Sie mit Hilfe kommerzieller Software nach Herstellerprotokoll.
12. Starten Experiment durch Starten des Stimulus-Protokoll. Nehmen flies' XY-Koordinaten bei 20 fps (Bilder pro Sekunde) und melden Sie sich in Verbindung mit dem Geruch Ventilstatus in Textdateien.

3. Datenanalyse

Hinweis: die folgenden Schritte in der Datenanalyse werden automatisiert mit speziell geschriebenen Routinen in R. programmiert Da diese Schritte sind entscheidend, um aussagekräftige Ergebnisse der Analyse wird jedoch in einer Schritt-für-Schritt-Weise präsentiert zu bekommen. Die Rohdaten für die Analyse sind CSV-Dateien, die synchronisiert Informationen zu Geruchsventilstatus, Impulszahl in dem Experiment und 15 fly x-Positionen in cm auf einer gemeinsamen Zeitachse für einen Geruchsstimulationszyklus. Benutzerdefinierten Code für die Datenanalyse können auf Anfrage bereitgestellt werden.

1. Offene .csv-Datei zu finden Zeitpunkt der Ventilöffnung durch einen cha bezeichnetnge in der Spalte, die die Ventilstatus.
2. Berechnung der linearen Funktion der Geruchs Position der Form
   f (t) = s * t + i
   wobei t die Zeit in der Stimulationszyklus, s die Windgeschwindigkeit (hier 20 cm / sec) und der Schnittpunkt i kann unter Verwendung der Zeit-Punkt der Geruch an der Position 0 (Ventilöffnung sowie Delay) tritt in die Rohre berechnet werden.
3. Finden Sie den Zeitpunkt, an dem Geruch und Fliegen x-Position schneiden für jeden fliegen und setzen Sie diesen Zeitpunkt auf 0. Hinweis: Auf diese Weise fly Positionen werden zu jedem individual's ausgerichtet Begegnung mit dem Geruch.
4. Fliegen sitzen an den sehr Ränder der Region von Interesse auszuschließen.
5. Berechnen Geschwindigkeit von X-Positionen durch Dividieren Verschiebung entlang der x-Achse durch das Zeitintervall (100 ms) und Prozedur für jedes Stimulationszyklus.
6. Um die Geschwindigkeit der Zeit-Kurse wie in 2E gezeigt, zu erhalten berechnen mittlere Geschwindigkeit der Zeitverlauf für jede Fliege und Geruch und von denen die mittlere Zeit-Kurs für einen bestimmten Geruch.
7. Netto Verschiebung, wie in 3C gezeigt, zu erhalten berechnen die Nettoverschiebung innerhalb von 4 Sekunden nach der Geruchsimpuls für jeden Tracking-Ereignis und anschließend die mittlere Nettoverschiebung pro Fliege und Geruch.

4. Reinigungsverfahren

1. Saubere Glas-Tubes
   1. Fliegen und Adapter Remove von Glasröhren und genießen Glasröhren in Reinigungsmittel.
   2. Glasröhrchen unter fließendem destilliertem Wasser und trocknen Sie sie mit Druckluft.
   3. Wärmeglasröhrchen bei 200 ° C für 8 h.
2. Saubere Geruch Delivery System
   1. Entfernen Sie alle Geruchs Fläschchen und Schläuche von der zentralen Mischkammer.
   2. Entfernen Schlauch-Adapter aus der Mischkammer.
   3. Sauberen Mischkammer durch Spülung mit Laborreinigungslösung und Lösungsmittel (zB Ethanol, Aceton). Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug.
   4. Trockenmischkammer mit Druckluft und erhitzen auf 200 ° C für 8 h.
3. Saubere Geruch Vials und Rückschlagventile
   1. Entfernen Stahlstecker (Discard Gummidichtung) und Rückschlagventile aus Phiolen Geruch und genießen Sie alle Komponenten im Laborreinigungslösung.
   2. Beschallen Komponenten in einem Ultraschallbad und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser.
   3. Reinigen Sie alle Komponenten außer Rückschlagventile mit Ethanol und Aceton. Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug.
   4. Trockenen Komponenten unter Verwendung von Druckluft und erhitzen auf 200 ° C für 8 h.
   5. Sauber Rückschlagventile auf der Innenseite durch Spülen sie mit Ethanol und Aceton mit einer Spritze (berücksichtigen Flussrichtung). Führen Sie diese Schritte unter dem Laborabzug tragen Laborschutzbrille tragen. Da Aceton greift Gummiteile, sofort trocken Rückschlagventile durch Spülen sie mit Druckluft.
   6. Rückstände von Gerüchen durch Pulsen Luft durch Rückschlagventile für mehrere Tage. Verwenden Sie einen Brutschrank bei 60 ° C und einer 1 sec Luft auf / 1 Sekunde Luft off-Regimes für diese Reinigungsschritt.

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Ergebnisse

Wegen entfernt sind erlaubt, sich frei in ihrem Glasröhrchen zwischen Geruchsimpulse und der Geruch Impuls wandert durch den Glasrohren verteilen mit einer konstanten Geschwindigkeit fliegt begegnen, den Geruch zu unterschiedlichen Zeitpunkten je nach ihrer x-Position zum Zeitpunkt der Stimulation. Als Ergebnis werden die Onsets der Aufwind Trajektorien durch eine 500 ms Impuls von einem attraktiven ¹⁰ -3 Verdünnung Ethylacetat hervorgerufen werden, indem etwa 1 sec für Fliegen an der Lee Ende der Glasrohr...

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Diskussion

Obwohl die Flywalk System auf den ersten Blick eher anspruchsvoll erscheint, einmal eingerichtet und es läuft ist einfach zu bedienen und erzeugt sehr robuste Ergebnisse. Um die Konsistenz der Ergebnisse mit der Biotest produziert betonen, kann man sagen, dass die hier gezeigten repräsentativen Ergebnisse wurden fast 2 Jahren, nachdem einige der in einer früheren Studie ²⁹ mit einem modifizierten Setup mit einer neuen Tracking-Software und Lichtquelle gezeigten Ergebnisse erhalten werden. Dennoch sind die ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany