Koku kılavuzluğunda Davranış Yüksek çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Drosophila melanogaster</emKullanma&gt;<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigma

Özet

Otomatik izleme sistemi Flywalk Drosophila melanogaster koku güdümlü davranış yüksek çözünürlüklü ölçümü için kullanılır.

Özet

Kendi doğal ortamında, sirke gibi böcekler kimyasal olarak farklı koku büyük miktarda ile bombardıman edilir Drosophila melanogaster uçmak. Hatta daha da karmaşıklaştıran, böcek sinir sistemi tarafından tespit edilen kokular genellikle kimin kompozisyon ve konsantrasyon oranları değişebilir tek bileşikler ancak bunların karışımları değildir. Bu sinir sistemi tarafından değerlendirilmesi gerekir farklı koku uyaranlara neredeyse sonsuz miktarda yol açar.

Bir koku uyarıcı yönleri sinek tarafından değerlendirmesini belirleyen anlamak için, verimli birçok koku ve koku karışımları doğru koku güdümlü davranışlarını incelemek için arzu edilen bir durumdur. Doğrudan nöronal aktivitenin davranışı ilişkilendirmek için, davranış karşılaştırılabilir bir zaman dilimi içinde ve nörofizyolojik deneylerde olduğu gibi aynı uyarıcı koşullarında sayısal olmalıdır. Bununla birlikte, Drosophila neuroethology çok anda kullanılan koku biyo-specia yerine vardırverimlilik doğru veya çözünürlük doğru ya lized.

Flywalk, otomatik koku teslimat ve izleme sistemi, verimlilik ve çözünürlük arasında köprüdür. Bu koku, paket serbest yürüme sinek uyarılmış ve Hayvanların dinamik davranış etkilerini belirlemek için tam olarak ne zaman belirlenmesini sağlar.

Giriş

Herhangi neuroethological araştırmanın herkesin ortak hedefi tek nöronlar veya nöronal devrelerin faaliyet devletler ve bir organizmanın davranışı arasında nedensel bir ilişki kurmaktır. Bu amaç nöronal aktivitenin elde etmek ve davranışları aynı uyarıcı koşullarında izlenmeli ve bu uyarıcı koşulları ideal olanların mantıklı gelişti inceleme altına sinir sistemi benzer olmalıdır. Davranışsal biyoanalizlere gelince, özellikle bu gereklilikler tarihsel Drosophila oldukça zorlu kanıtlanmıştır koku neuroethology melanogaster.

Kaynağından çıkan kez koku tüyleri hızla hava hareketi koku dağılımı ¹ temel belirleyicisi olmaktan kaynaklanan çalkantılı difüzyon ince filamentler içine break up. Bunun bir sonucu olarak, bir koku kaynağına doğru seyreden bir böcek temiz hava değişken aralıklarla serpiştirilmiş koku paketleri ile kesikli uyarımı karşılaşır. Her ikisiyürüyüş ve böcekler uçan - Drosophila dahil - ^{5 -} kokuların ² yokluğunda çapraz rüzgar hareketli ağırlıklı tüy karşılaşma üzerine rüzgâra karşı kabaran tarafından navigasyon için bu aralıklı stimülasyon rejimi yararlanmaya gösterilmiştir. Bu tuzak analizi olarak Drosophila neuroethology kullanılan ^11, birçok davranış biyoanalizlerin ^- ve fizyolojik deneyler için stimülasyon prosedürleri ise, büyük ölçüde, bir böcek, temiz hava veya dinamik stimülasyon dizilerinin ⁶ uzun süre serpiştirilmiş kokuların da sağlayarak, tek nefes çekme tarafından doğal ortamda yaşayabilir taklit ^{15 -} açık alan arenalar veya T-labirent koku geçişlerini ¹² güveniyor. Tanımı gereği koku geçişlerini koku kaynağından mesafeye bağlı konsantrasyonda değişken olduğundan, ancak belli bir davranış, bu paradigmalar kullanarak kesin bir koku konsantrasyonu isnat edilemez. Buna ek olarak, eğimiBir koku degrade eleştirel odorant fizikokimyasal özelliklerine bağlıdır. Bir zorluğa yol açabilir ^{20 -} Bir çok uçucu bileşiğin bir degrade daha az uçucu bileşiğin tarafından oluşturulan ve bu nedenle de zor navigasyon ¹⁶ tek yolu olarak uzayda konsantrasyon farklılıkları ölçmek güvenerek bir organizma için izlemek için daha sığ olacaktır Özellikle seçim analizlerde koku tercihler. Uzayda her noktada farklı karışım bileşeni oranlarına yol açar ve bu nedenle tekrar fizyoloji ve davranış arasında açık bir ilişki engellemektedir, çünkü koku karışımları yönelik davranışlarını araştıran Bu etki aynı zamanda son derece zararlıdır.

Sirke sinekleri meyve fermente üzerine agrega eğiliminde olsa da, gıda kaynakları ve ovipozisyon siteleri karşı navigasyon yalnız vardır. Bununla birlikte, bireysel hayvanları test ziyade birçok davranışsal paradigmalar Drosophila neuroetholo kullanılangy sineklerin kohortlarda kokusu eşliğinde davranışları incelemek ve cazibe bir kontrol uyaran üzerinde koku seçiminde sinekler kesir olarak puanlanır. Bu kohort deneyleri sinek neuroethology anlaşılmasına büyük katkıları olmuştur ve bunları kullanarak yapılan gözlemlerin birçoğu tek sinek deneylerinde teyit edilebilir. Ancak, her other's kararını ²¹ etkileyebilir ve aşırı durumlarda bir koku değerlendirilmesi nüfus yoğunluğuna bağlı olarak ²² kaçınmaya ilgisizlik geçebilirsiniz uçar olduğu gözlenmiştir. Ayrıca, deney bu türlü sonuçlar genellikle nöronal aktivite ile davranış arasında ilişki çalışırken arzu olurdu doğrusu bunu yapıyor iken sinek ne yaptığını gözlemleyerek daha davranışsal kararlar, bir dizinin sadece son nokta sağlamaktadır. Bunlar oldukça düşük çözünürlüklü kohort deneyleri gibi izin gergin uçuş arenalar ve koşu bandı gibi yüksek çözünürlüklü tek sinek yöntemleri ile tezatzaman davranışsal tepkilerin doğrudan gözlem için uyaran ^20,23,24 sunulmuştur. Onlar çok verimli ve-arası bireysel ve inter-deneme değişkenlik kısmen uzun süre boyunca nüfusun gözlem ortalaması alınır çünkü sağlam hatta nispeten sonuçları düşük örnek boyutları sağlar, çünkü Ancak, kohort deneyleri, hala popüler. Gergin uçuş ve koşu bandı muhtemelen uyaran sunum ve temporal çözünürlük konusunda altın standart sağlarken, kullanılan arenalar tek hayvanlar için tasarlanmış ve bu nedenle zaman alıcı örnek bir istatistiksel analiz için gerekli boyutları elde etmektir edilir. Çeşitli diğer yaklaşımlar son iyi tanımlanmış bir teşvik rejimi ile kombinasyon halinde, yüksek çözünürlüklü davranış verilerinin etkin bir şekilde alınmasını sağlayacak geliştirilmiştir. Bu koku tüy ⁵ doğru bir 3D-model ile kombinasyon halinde bir Projede, rüzgar tünelinde birden sirke sineklerinin denetimsiz 3D-izleme dahil , her iki tarafta ²⁵ ve Flywalk paradigma ^26'dan airstreams ile birlikte seçim odalarında çoklu bireysel sineklerin izleme.

Flywalk olarak, 15 ayrı sinekler, küçük cam tüplerde bulunmaktadır ve sürekli kırmızı ışık koşulları altında bir havai kamera tarafından izlenen. Kokular 20 cm / sn arasında sürekli bir hava akımı, bir ilave edildi ve sabit bir hızda cam tüpler boyunca yol. Hava akımı koku teslim sistemine girmeden önce distile su (nemlendiriciler) ihtiva eden 250 ml'lik şişeler içinden geçirilerek nemlendirilir. Flies' pozisyonları sinekler daha yukarı taşımak veya edemez ilgi (ROI) bir kare bölge koku tüplerin uzunluğu en kapsayan (ancak tüpleri (her tarafı yaklaşık 5 mm dış kenarlarını hariç) içinde kaydedilir downwind) koku sunumu (Şekil 1A, B) sefer. Fly kimlikleri izleme sistemi t sabit tutulmasıonların Y-pozisyonlarına (yani kendi cam tüp limitleri) bazında deney hroughout. Koku uyarılması kadar 8 tek koku ve ^26,29 (Şekil 1B), bunun bütün olası karışımları sunum sağlar çok bileşenli bir uyarıcı cihaz kullanılarak elde edilir. Bir deney ders bilgisayar koku verme sistemini düzenleyen ve sıcaklık ve nem bilgi toplama (bilgisayar 1, Şekil 1C) tarafından kontrol edilir. Bu bilgisayar, aynı zamanda sürekli olarak saniyede 20 kare (bilgisayar 2) sinek pozisyonlarını izler ikinci bir bilgisayara bir datalogger (kayıt başlat / durdur) kontrol eder. Koku stimülasyon döngüleri etrafında, koku vana durumunu (vana açıklığının yani zaman-noktası), koku kimliğini, sıcaklık ve nem pozisyonları Fly koku bilgisayara 2. Bu şekilde bilgileri kaydedilir ve pozisyonları .csv dosyaları olarak eşitlenir ve ihraç uçmak hangi daha da işlenir ve özel olarak yazılmış analiz rutinleri kullanarak analiz edilebilir. ÇünküTüm sistem bilgisayar kontrollü, hiçbir insan müdahalesi deneysel oturumu sırasında gereklidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Flywalk inşaat ve teknik detaylar yerde ²⁶ (MK elde edilebilir, bu kurmak daha fazla bilgi kurulması herhangi bir sorun durumunda) tarif edilmiştir. Burada güvenilir sonuçlar elde etmek için yardımcı olacak paradigmanın işleme hakkında ayrıntılı talimatlar odaklanmak.

1. Fly Taşıma

1. 12 saat ışık: 23-25 ​​° C ve% 70 bağıl nemde karanlık rejim Arka 12 saat altında gıda ortamı ²⁷ orta yoğunluklu kültürlerde düşük uçar. Bu amaçla, 20-30 yeni ortaya çıkan yetişkin, daha sonra 1 hafta boyunca büyük bir gıda flakon yeniden yetişkin sinekler atmak ve ortaya yavrular için beklemek uçar izin verir.
2. 30-40 yeni ortaya çıkan (yaş <24 saat), yetişkin sinekler toplayın ve 3-5 gün yemek ortamı ²⁷ içeren yeni bir şişede onları yaş.
3. Yirmi dört saat davranışsal deney başlamadan önce: Transferi Tüm 30-40 önceden toplanmış 3-5 d eski (2.2 bakınız) yeni bir vi uçarEl nemli kauçuk köpüğü fişi veya bir aspiratör kullanılarak nemli doku kağıt içeren.
   Not: CO ₂ kullanarak sinek uyuşturan etmeyin.

Flywalk Kur'un 2. Hazırlık

1. Nemlendiriciler olarak 250 ml'lik şişe kullanın. Damıtılmış su 100 ml nemlendiriciler doldurun.
2. Koku şişeleri hazırlayın.
   1. Saf kokular, etil asetat, etil bütirat, izopentil asetat ve çözücü, madeni yağ içinde 2,3-bütandion 500 ul 10 ^-3 dilüsyonları hazırlayın.
   2. Koku şişe başına iki toplu çek valfleri takın. Vanalar tek yönlü hava akımı sadece izin verdiği çek unutmayın. Bu nedenle, hava, bir tarafta şişeye girmesini ve diğer tarafta bırakın şekilde çek valfleri bağlayın.
   3. 200 ul PCR reaksiyonu, tüpün kapağını çıkarın. Ayrı bir reaksiyon tüpüne, her koku seyreltme 100 ul pipet ve ayrı bir koku viyaller içinde tüpleri. Ayrıca sadece çözücü mineral OI içeren tek koku şişe hazırlamakl.
   4. Sıkıca paslanmaz çelik fişleri ve lastik contalar kullanarak onları kapatarak koku şişeleri mühür.
   5. Koku verme sistemi (madeni yağ ihtiva eden 4 ihtiva eden kokular ve 1) 5 koku şişeleri bağlayın. Doğru akım yönünde onları bağlamak için emin olun. Yanlış bağlantı sadece planlanmış deney taviz vermeyecek, aynı zamanda dağıtım sistemi kirletebilir.
3. Uyarıcı cihazın karıştırma odasının çıkışını mühürleme suretiyle sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Uyarıcı cihazına önce tüm hava akımları artık giderek sıfıra düşmesi ki emin olun. Değilse, şimdi sistemin çıkan havanın tıslama sesi ile tespit edilebilir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
4. Dikkatle gelen adaptörleri kullanarak her iki taraftan bir aspiratör ve yakın cam tüpler kullanılarak 15 ayrı cam tüpler 15 ayrı sinekler aktarın.
   Not: Sistem hermetik başarılı deneyler için mühürlü gerektiğinden, adaptörler sıkıca cam tüpler uygun olmasını sağlamakve cam tüpler bu adımı sırasında kırılabilir unutmayın. Koruyucu eldiven ve gözlük takarak yaralanmaları önlemek için dikkat edin.
5. Flywalk kurulum cam tüpler bağlayın ve burada andan itibaren, sinekler yeni ortama alışmakta izin deney başlamadan önce en az 15 dakika bekleyin.
6. Cam tüpler taktıktan sonra: cam tüpler sonra 16 hava akımları sistemine girmeden hava akımı kadar eklerseniz bilgisayarda 1 aşağı dijital akış metre okuma kontrol edin. Nem% 60 ile% 80 arasında ise Ayrıca, bilgisayarda 1 kontrol edin.
7. Sinekler sunulan koku uyaranlara sırasını ve zamanlamasını kontrol Tasarım uyaran protokolü. 40 kez her anda açıklanan veriler, mevcut 4 koku ve tek başına kontrol (madeni yağ) ve tüm olası üçlü ve dörtlü kokular karışımları gibi edinin. 90 saniyelik bir interstimulus aralıklarla 500 msn darbe süresi ayarlayın ve uyarıcı dizisi rastgele.
8. Li açınght kaynağı (LED-küme, λ = 630). Cam tüpler içindeki sıcaklığı artırmadan verimli izleme için yeterli ışık sağlamak için emin olun.
9. 15 cam tüpler dahil bir şekilde izlenecek ve tüplerin kenarlarından yaklaşık 5 mm dışlanan alan boyunca bir çerçeve sürükleyerek izleme sisteminin ilgi bir bölge ayarlayın.
10. Bireyi korumak için gelen komut kendi Y-pozisyonlarını değiştirerek izleme sistemi bireysel tüpler arasındaki 14 paralel ayırma çizgileri kurmak deney boyunca tanımlanabilir uçar. Sadece bir sinek iki satır herhangi bir set arasında takip edilecektir, çünkü böyle iki ayırıcı hatları arasında tek cam tüp orada her zaman böyle bir şekilde onları konumlandırmak için emin olun.
11. Güvenilir cam tüpler boyunca izlenir sinekler şekilde kamera parametrelerini ayarlamak için emin olun. Sinekler ilgi bölgenin kenarlarında kayıp ise, izleme s parlaklığını veya kazancı artırmakoftware. Takip sistemi mekanik titreşimleri kaçının. Üreticinin protokolüne göre, ticari bir yazılım kullanılarak takip edin.
12. Uyarıcı protokolü başlayarak deney başlayın. Tutanak 20 fps (saniyede kare) de XY koordinatları flies' ve metin dosyaları koku valf durumu ile birlikte oturum açın.

3. Veri Analizi

NOT: Bu adımlar analizi yine de bir adım-adım bir şekilde sunulacaktır anlamlı sonuçlar elde etmek için çok önemli olduğu için veri analizi aşağıdaki adımlar R. programlanmış özel olarak yazılmış rutinleri kullanılarak otomatize edilir. Analiz için ham veriler, bir koku stimülasyon döngüsü için ortak bir zaman ekseni üzerinde cm koku vana durumu, nabız sayısında deneyde 15 sinek x pozisyonları senkronize bilgileri içeren .csv-dosyalarıdır. Veri analizi için özel kod istek üzerine temin edilebilir.

1. Açık .csv dosyası, bir cha tarafından anlamına valf açılma zamanı noktasını bulmakValf durumunu temsil eden sütun nge.
2. Formun koku pozisyonunun doğrusal fonksiyonunu hesaplayın
   f (t) s * t = i +
   t stimülasyon döngüsü zaman olduğu, s rüzgar hızı (burada 20 cm / sn) ve ben koku pozisyonu 0 (vana açma artı gecikme) tüpler girdiği zaman noktası kullanılarak hesaplanabilir kesmek olduğunu.
3. Bu koku da zaman noktasını bulun ve her sinek ve 0 Not bu zaman noktası ayarlayın x-pozisyon kesiştiği noktaları: sinek pozisyonları her individual's hizalanmış Bu şekilde koku ile karşılaşıyoruz.
4. Ilgi bölgenin çok kenarlarında oturan sinekler hariç.
5. Her stimülasyon çevrimi için bir zaman aralığı (100 milisaniye) ve yineleme prosedürü ile X ekseni boyunca yer değiştirme bölünmesiyle X-pozisyonlarından hız hesaplayın.
6. Şekil 2E'de gösterildiği gibi her sinek ve koku için ve belirli bir koku için bu süre ortalama ders itibaren ortalama hızı zaman kurs hesaplamak hız zaman kurslar elde etmek.
7. Şekil 3C gösterildiği gibi net deplasman elde etmek için her izleme olay için koku darbe ve sonrasında sinek ve koku başına ortalama net deplasman sonra 4 saniye içinde net deplasman hesaplamak.

4. Temizleme Prosedürü

1. Temiz Cam Tüpler
   1. Cam tüpler gelen sinek ve adaptörleri çıkarın ve deterjan, cam tüpler ıslatın.
   2. Çalışan damıtılmış su altında cam tüpler durulayın ve basınçlı hava ile kurutun.
   3. 8 saat boyunca 200 ° C'de ısı cam borular.
2. Temiz Koku Dağıtım Sistemi
   1. Merkezi karıştırma odasından tüm koku şişeleri ve tüpünü çıkarın.
   2. Karıştırma odasından boru bağdaştırıcıları çıkarın.
   3. Laboratuar temizleme solüsyonu ve çözücüler (örneğin, etanol, aseton) ile durulayarak temizleyin karıştırma odası. Laboratuar kaputun altında bu adımları uygulayın.
   4. Kuru karıştırma odası 8 saat 200 ° C 'de bu basınçlı hava ile ve ısıtın.
3. Temiz Koku Şişeler ve Çek Vanalar
   1. Çelik fişini (ıskarta kauçuk conta) çıkartın ve koku şişeleri gelen çek valfler ve laboratuvar temizleme solüsyonu tüm bileşenleri ıslatın.
   2. Bir ultrason banyosunda sonikasyon bileşenler ve damıtılmış su ile yıkayın.
   3. Etanol ve aseton ile kontrol valfleri dışındaki tüm bileşenleri temizleyin. Laboratuar kaputun altında bu adımları uygulayın.
   4. Ve basınçlı hava ile kuru bileşenler 8 saat süreyle 200 ° C sıcaklıkta tekrar ısıtın.
   5. Etanol ve bir şırınga kullanarak aseton ile yıkanarak iç temizliğini valfler (akış yönünü düşünün). Laboratuvar gözlüğü takan laboratuar başlık altında şu adımları uygulayın. Aseton basınçlı hava ile yıkama hemen lastik parçaları, kuru çek valfleri saldırır çünkü.
   6. Birkaç gün onay valfler havayı darbe ile kalıntı kokuları çıkarın. Bu temizleme adım için rejim kapalı / 1 sn hava 60 ° C'de bir inkübatör ve 1 sn hava kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sinekler sabit bir hızda cam tüpler yoluyla koku bakliyat ve koku darbe seyahatleri arasında kendi cam tüpler içinde serbestçe dağıtmak için izin Çünkü sinekler stimülasyon sırasında x-pozisyonuna bağlı farklı zamanlarda koku karşılaşıyoruz. Bunun bir sonucu olarak, etil asetat çekici 10 ^-3 seyreltme 500 milisaniye darbe uyandırdığı rüzgara karşı yörüngelerin başlangıç ​​ve bitiş noktalarının yakın oturmuş sinekler kişilerce kıyasla cam tüpler rüzgaraltı ucunda...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Flywalk sistemi ilk bakışta oldukça sofistike görünse de, bir kez kurmak ve onu çalıştıran kullanımı kolay ve çok sağlam sonuçlar üretir. Biyo-deney ile üretilen sonuçların tutarlılığını stres için burada gösterilen temsili sonuçlar neredeyse 2 yıl, yeni bir takip yazılımı ve ışık kaynağı kullanılarak modifiye kurulum ile bir önceki çalışmada ²⁹ de gösterilen bazı sonuçları sonra elde edildi söylenebilir. Bununla birlikte, çekici cevaplardır - Daha önce kendi di...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flywalk setup	Custom		details available upon request
stimulus device	Custom		details available upon request
LED cluster	Custom		details available upon request
HD Pro Webcam C920	Logitech, Lausanne, Switzerland
2 Computers
Flywalk Reloaded v1.0 software	Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net)
Labview 11.0 software	National Instruments, Austin, TX
Standard fly food	Custom
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
Standard fly vials	Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany
aspirator	Custom
mineral oil	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
odors	Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com)
200 µl PCR reaction tubes	Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany