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摘要

在这里，我们提出了一个荧光活化细胞分选（FACS）协议来研究分子改建的Fos表达来自新鲜和冷冻的脑组织神经元歌舞团。使用冷冻组织可在多个会话许多脑区的FACS隔离，最大限度地利用宝贵的动物主题。

摘要

神经可塑性和习得行为的分子变化的研究是从全脑区的研究转向的稀疏分布激活的神经元称为介导学协会神经歌舞团特定集合的研究。荧光活化细胞分选（FACS）最近已经成年大鼠脑组织进行了优化，并允许使用抗神经元的NeuN标记和Fos蛋白，强烈地激活的神经元的标志物激活的神经元的隔离。到现在为止，Fos蛋白表达的神经元和其他细胞类型，从新鲜组织，从而享有很长的处理天脑样品的允许号码非常有限的冗长和复杂的行为过程之后进行评估隔离。在这里，我们发现，Fos蛋白表达来自背侧纹状体神经元和Fos蛋白的mRNA产率分别为新鲜解剖组织和组织在-80ºC冷冻3之间相似- 21天。另外，我们证实了表型所述的NeuN阳性和的NeuN阴性分选的细胞通过神经元的评估基因表达的（ 的NeuN），星形细胞（GFAP），少突胶质细胞（Oligo2）和microgial（Iba1）标记物，这表明冷冻组织也可用于的FACS分离的神经胶质细胞类型。总体而言，它是可以收集，解剖和冷冻多个FACS会话脑组织。这最大化从有价值动物受试者已经经常发生长和复杂的行为过程获得的数据量。

引言

学习过程中，动物形成复台高度特异性的刺激之间的关联。此高分辨率信息被认为是由稀疏分布的神经元称为神经合奏特定图案内的改变进行编码。神经乐团最近已确定了的立即早期基因（即早基因）如Fos的 ， 圆弧和Zif268及其蛋白质产物在神经元的行为或线索暴露在强烈激活的诱导。 fos基因表达的神经元尤其已经示出在背景和线索特定习得行为1-4发挥因果作用。因此，这些被激活的Fos表达神经元内独特的分子neuroadaptations是编码了解到，在正常的学习和正常的学习障碍形成的协会，如成瘾和创伤后应激障碍（PTSD）5的神经机制的热门人选。

荧光李宗红激活细胞分选（FACS）最近允许的Fos蛋白表达的神经元内独特的分子neuroadaptations分析。流式细胞术和细胞分选在1960 6,7被开发根据它们的光散射和免疫特征来表征和分离细胞，并且早已在免疫学和癌症研究中使用。然而流式细胞仪和FACS需要解离的单细胞难以从成人脑组织得到。 FACS最早是用来分离和分析绿色荧光蛋白（GFP）-expressing从没有要求抗体标记8,9转基因小鼠纹状体神经元。我们开发了一种基于抗体的FACS方法10来隔离并在的Fos表达由药物和/或暗示在野生型动物中11-15激活的神经元评估分子改变。在该方法中，神经元被标以对一般的神经元标记物的NeuN的抗体，而强烈激活的神经元标记与抗Fos蛋白的抗体。虽然我们最初的方法所要求达到10只，每个样品新鲜组织池，该协议的后续修改允许从单个老鼠13-15的Fos表达神经元和定量聚合酶链反应（定量PCR）分立的大脑区域的分析，流式细胞仪分离。总体而言，在Fos蛋白表达的成瘾研究12,14,15各种上下文和提示激活行为的过程中激活的神经元中发现独特的分子变化。

与新鲜组织进行的FACS的一个主要的后勤问题是，它需要一整天以解离通过FACS组织和处理。此外，只有大约四个样品每天可处理。这通常意味着只有一个大脑区域可从各脑进行评估和剩余的脑区域都被丢弃。这对于低吞吐量行为程序，如自我施用和消光TRAI一个主要问题宁认为需要手术治疗和强化训练几个星期。此外，在测试当天长期和复杂的行为过程使得难以在同一天进行的FACS。这将是一个显著优点是能够从动物行为测试后，立即冻结的大脑，然后在研究者的选择的不同的时间从一个或多个脑区域隔离的Fos表达神经元。

在这里，我们证明，我们的FACS协议可以用于分离从新鲜和冷冻的脑组织的Fos表达神经元（和其它细胞类型）。作为一个例子，我们分离的Fos表达后急性注射甲基苯丙胺，并从幼稚大鼠不打针（对照条件）从纹状体神经元。然而，该FACS协议可以按照任何行为或药物治疗中使用。我们的样品的后续的qPCR分析表明，从这些类型的细胞的基因表达可以与西米进行评估从新鲜和冷冻组织征地拆迁的效率。

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研究方案

所有实验均按照健康指南全国学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的护理和使用实验动物16进行。

注意:下面使用低结合离心管的所有步骤都保持在冰上，除非另有指定。

1.准备组织收集前

  1. 离心机设置为4℃。
  2. 火抛光具有大约1.3递减的直径，0.8和0.4毫米每个样品一组三个玻璃巴斯德移液管。
  3. 准备含1毫升冷缓冲液A标1.7毫升管和保持管冰。
  4. 制备含有脑切片矩阵，刮刀和其上以执行清扫玻璃板（或倒玻璃培养皿）的冰盘。预寒意两个或多个刀片上的玻璃板和使用组织纸晾干触及的T所有的仪器问题。
  5. 解冻在室温（RT）处理30分钟组织收集前的酶溶液。

2.组织收集和解剖

  1. 发起组织收集前的行为和药物治疗90分钟。
    注:对于这里示出的结果，5毫克/公斤的甲基苯丙胺对一种新的环境（测试条件）和幼稚大鼠大鼠急性腹膜内注射保持在它们的饲养笼（对照条件）进行。
  2. 通过将其放置饱和异氟醚玻璃干燥器罐子麻醉大鼠和斩首大鼠30 - 60秒后用断头台。
    用剪刀去除头部皮肤和肌肉，暴露颅骨。用咬骨钳切割颅骨和开拓枕骨大孔，取出头骨后面的部分。使用骨钳沿头骨的顶边切割以暴露脑。小心不要损伤大脑。使用小铲下轻轻舀Ð提高大脑。提高大脑和切断的神经，直到大脑是免费的17。
  3. 使用刀片解剖组织。
    注:获得使用以下两种方法的组织样本:（2.3.1）新鲜解剖组织; （2.3.2）解剖后冷冻的组织;或（2.3.3）组织冷冻冷冻全脑解剖。保持大脑切片矩阵，刀片和玻璃干板整个解剖和切碎流程作为的冷凝水可能会导致细胞的裂解低渗。使用放大镜，以确保准确的解剖。
    1. 对于新鲜解剖组织，将新鲜榨取的大脑已在冰上冷却大脑切片矩阵（大鼠脑形金属模具在1mm间隔的刀片插槽）。插入两个或更多个预冷刀片到槽切割包含所关注的脑区域（多个）冠状切片。放置在冷冻玻璃板切割片。
      注:解剖大脑区域选择性对冷冻玻璃板兴趣纳秒。
    2. 解剖后冷冻组织，从新鲜提取脑，类似于2.3.1上述切​​片解剖感兴趣的脑区域（多个）。放置解剖组织成微管并通过浸没在-40°异戊烷微管，持续20秒快速冷冻组织。保存在-80ºC冷冻，直到进一步的处理在任何时候都冻结解剖组织。
    3. 对于冰冻组织，立即冻结在-40ºC异戊烷和储存在密封的袋子在-80ºC新鲜提取大脑长达6个月。
      1. 上解剖当天，将冷冻的脑在设定为约一低温恒温器-20℃（不超过华氏-18℃）约2小时，达到平衡的温度。
        注:大脑可以很容易地在此温度下进行切割，而冷得多的温度使大脑太脆安全地切割。
      2. 使用刀片切1 - 2毫米冠状切片冷冻大脑在低温恒温器。使用钝12至16号针头，以获得冷冻条件下，从这些切片组织拳。始终保持冷冻，直到进一步的处理解剖组织。
  4. 添加1 - 缓冲液A 2滴切碎之前覆盖解剖组织。从使用两个刀片以防止磨碎处理的其余部分中的神经元损失的组织去除大部分的白质。如果与冷冻组织开始，然后允许组织向施加缓冲液A溶液之前在冷玻璃板解冻时间不超过1分钟。
  5. 剁碎的组织在每个正交方向上的100倍以上的冷却玻璃板的剃刀刀片。切碎当握住刀片垂直于玻璃板。
    注:彻底剁碎是所有协议的步骤至关重要。
  6. 使用刀片的切碎的组织转移到含有1ml冷缓冲液A的倒置管3的离心管 - 5次使电机EP中的解决方案的所有组织糜。

3.细胞分离

注:使用温和的结束比上年末为以下所有步骤的混合。不要使用旋涡混合器，避免气泡造成的细胞损伤。

  1. 离心样品管在110 XG 2分钟，4ºC。弃上清。慢慢加入1毫升冷的刚解冻的酶溶液（含有蛋白水解酶的​​混合物）下微管的内壁。立即吸了整个颗粒和轻轻地用中等大小的尖端直径吸管吸取上下只有4次驱散组织糜颗粒。
  2. 立即倒置微管，以防止粘附于底部的沉淀，并在4℃孵育与最终过端混合样品30分钟
  3. 酶组织消化后，离心机在4ºC960 XG 2分钟管子。除去上清液，加入0.6毫升冷的缓冲液A.立即出现的加入缓冲液A后Y，使用相同的枪头驱散颗粒通过吸了整个颗粒和吸管轻轻向上和向下的5倍。
  4. 机械磨碎消化的组织，并在使用以下步骤15ml试管收集。对于每个样本，使用一套独立的3火抛光的玻璃巴斯德移液器降直径附着乳胶泡约1.3，0.8和0.4毫米。
    1. 轻轻磨碎每个样品与1.3毫米的玻璃吸移管的10倍。让样品静置2分钟在冰上（碎片和未离解的细胞将沉淀在底部）。收集上清液（〜0.6mL）中，并转移到15毫升锥形管（管＃1）。
    2. 添加0.6毫升缓冲液中的溶液，以剩余的粒料。磨碎样品与0.8毫米的玻璃吸移管的10倍。让样品静置在冰上2分钟。收集上清液（〜0.6mL）中，并转移到同一的15毫升锥形管＃1。
    3. 加入0.6毫升缓冲液的溶液将剩余PELLE吨。磨碎样品与0.4毫米的玻璃吸移管的10倍。让样品静置在冰上2分钟。收集上清液（〜0.6毫升;不接触与非解离的细胞沉淀），并转移到相同的15毫升锥形管＃1。
      注意:保持0.4毫米直径的吸管在管＃1以下研磨步骤。
    4. 重复步骤3.4.3三次用最小玻璃吸管（〜0.4mm直径），并且收集上清液到一个单独的15毫升锥形管（管＃2）。
    5. 磨碎在管＃1和＃2所收集的细胞悬浮液，使用0.4毫米的玻璃吸移管10次以上，并保持在冰上。

4.细胞固定和透

  1. 加入800微升100％的冷乙醇准备（从管＃2单元两个微管从管＃1单元和两个），每个样品4微管（储存在使用前-20℃）每管，并让他们在冰。注意:最终乙醇浓度为50％。
  2. 吸取〜800微升细胞悬浮液（从管＃1和＃管2）到每个含冷乙醇的4管和颠倒管混匀样品。
  3. 在冰上孵育管15分钟，同时反相，每5分钟的管中。
  4. 固定/透化后，离心管1700 xg离心在4ºC4分钟并弃上清。离开50微升的溶液，以防止细胞的损失。
    注:在此阶段的粒料是白色和粘比透以前少在管子的壁上。因此，小心地取出上清液通过触摸微管的管壁里没有颗粒和制定上清慢慢用微量。

5.细胞过滤

  1. 重悬来自步骤4.4用冷PBS将粒料如下:
    1. 添加550微升冷PBS的两个微管，从管＃1来的一个，并使用适度大直径圆周佩特笔尖轻轻吸取细胞悬液上下5次。重复相同的一个微管由管＃2的到来。
    2. 从管＃1细胞，使用相同的移液管，所述第一细胞悬浮液转移到第二沉淀。轻轻吹打组合的细胞悬液上下5次重悬第二沉淀。
    3. 从管＃2细胞，重悬，并结合在5.1.2中描述的颗粒（ 即，第三和第四微管）。
  2. 过滤来自分别使用两种不同的对细胞滤器（100微米和40微米孔径大小）如下步骤5.1.2和5.1.3两种细胞悬浮液:
    1. 预湿通过加入PBS至过滤器的内侧的每个细胞过滤。使用移液管从过滤器的外侧除去过量的PBS中。
    2. 移液器步骤5.1.2细胞悬浮液均匀涂抹于100微米孔径的第一个细胞过滤。收集在冰上的50ml管中的流通。使用PI佩特收集液流 - 通过附着在细胞过滤的外侧底部。
    3. 使用相同的移液管的流动通从100微米的细胞滤网转移到40微米的细胞滤网。收集在冰上另外50毫升管此流过。当40微米的细胞过滤通过传输流，切换到新的枪头，以避免从100微米的细胞过滤污染。
    4. 重复这些步骤步骤5.1.3细胞悬液采用一套新的过滤器。
  3. 从每个样品结合两种流过为每个样品约1ml的最终体积。

6.孵化与抗体

注:使用脑细胞悬液的小等分，为运行主样本之前，适当的流式细胞仪的设置设置准备多个对照样品。对于每个抗体标记，准备对照样品，其中包括没有抗体，只有本身condary抗体（或其他荧光标记），然后一次和二次抗体（或其他荧光标签）。使用这些控件设置单独与特定的流式细胞仪的非特异性标记的大门。如果可能的话，使用不要求赔偿的荧光。加入第一抗体之前加入的PBS增加选通控制样品的700微升最终体积的最终体积。

  1. 通过过滤的细胞的100微升样品转移至1.7毫升微管制备光散射和DAPI对照样品。添加600微升冷PBS与1微克/毫升的DAPI对细胞核染色。孵育10分钟终过端的混​​合，并通过流过流式细胞仪之前清洗（如在步骤6.4.2至6.4.5表示）。
    注:此示例只用于设置之前在FACS机器分拣剩余细胞的细胞/细胞核栅极。
  2. 通过转让100＆＃制备单免疫标记对照样品181;微升过滤细胞对一个1.7毫升微型管。添加600微升冷PBS与一种抗体（ 例如，的NeuN抗体）。添加600微升冷PBS到与另一种抗体（ 例如，Fos抗体）微管。添加相应的二级抗体，如果它不是一直接缀合的初级抗体。
    注意:这些样品被用来确定相应的光电倍增管（PMT）的电压，并在必要时，以评估两种荧光信号的重叠。抗体浓度应该滴定，以达到最佳的信号 - 噪声比中的所有信道。重叠的荧光信号，也可以通过流式细胞仪内不同的荧光通道的内部校准补偿。
  3. 通过将100μl过滤的细胞转移到一个1.7毫升微型管制备双荧光标记的阴性对照样品。添加600微升冷PBS单独用二抗或IgG直接缀合的初级抗体。
    注:氏与S样品可以进行排序，以确定每个荧光背景荧光之前使用每一次。
  4. 制备主要样本进行排序。
    1. 转移700微升过滤细胞成1.7毫升微型管。加7微升（1:100）主Fos抗体的直接缀合的Alexa Fluor 647（抗的Fos-AF647）和1.4微升（1:500）初级的NeuN抗体的直接缀合到藻红蛋白（抗的NeuN-PE）。在4ºC与最终过端混合孵育管30分钟。
    2. 在孵育结束时，加入800微升冷PBS到每个微管，包括主样品和对照样品，并通过倒置混合。
    3. 微管离心在4ºC1300 XG 3分钟。弃去上清液，留下50微升上清液，以防止细胞的损失。
    4. 1毫升冷PBS添加到使用移液管有一个中等大小的顶端直径的颗粒和重悬细胞。
    5. 离心机在4ºC1300 XG 3分钟。 ðiscard上清液。
    6. 重悬在500微升冷PBS丸粒（调节终体积取决于颗粒的大小）。
    7. 转移和悬浮液用细胞过滤网帽（40微米）过滤到圆底FACS样品管中。保持冰的免疫标记细胞和立即执行FACS。注意:对于过滤，垂直触及滤网盖枪头，并通过它推动细胞悬液。
  5. 设置流式细胞仪使用对照样品门。
    1. 使用光散射和DAPI控制样品从事件总数和细胞碎片识别神经元细胞群。
      注:本制剂细胞体只有1 - 总的事件（其余的都是碎片和破碎的细胞过程）的2％。基于DAPI的荧光信号（指示核）和前向散射（小区大小），可以找到向后基于所述前向和侧向细胞体和栅极光散射特性将细胞（ 如图1的A，B）。
    2. 使用单免疫标记对照样品，以确定PMT电压设定，并分析排放溢出从一个特定的荧光染料进入另一个过滤器/通道（ 如的Alexa Fluor 488 / FITC或藻红蛋白）。如果荧光信号重叠，通过手动调节薪酬水平纠正重叠。
    3. 使用双荧光标记的阴性对照来建立阈值的正的人口。
      注意:从该样品来的信号被认为是由于自体荧光和位于高于该阈值的主要试样的细胞可以被认为是阳性。通常情况下，用于排序的阈值的参数是更严格的，并大致标记的细胞的阴性对照以上的顶部2/3实际上排序。
  6. 排序由FACS主要样本的神经元到1.7毫升微管。收集细胞于50微升RNA的提取液。排序，涡旋并离心管并通过上下抽吸10次来恢复所有分选的细胞，从该管的壁混合该悬浮液后。
  7. 孵育在42ºC的分选的细胞悬浮液30分钟，以确保所有的细胞之前，提取RNA裂解，然后在2,800 xg离心在4ºC离心2分钟。
  8. 将上清转移到长期存储的无RNase的管中，在-80ºC或立即处理用于RNA分离，cDNA合成，靶基因的预扩增和qPCR样品，如先前13-15所述。

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结果

急性注射甲基苯丙胺后排序从单只新鲜和冷冻背侧纹状体组织的Fos阳性和Fos蛋白阴性神经元。

上述方案用于甲基苯丙胺（5毫克/千克）的腹膜内注射后从单个的大鼠背侧纹状体90分钟的Fos阳性和Fos蛋白阴性的神经元进行排序。在他们的家笼幼稚大鼠用作对照。背其集合（新鲜组织）或被冷冻并储存在-80ºC为1,7或21天之后进行处?...

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讨论

FACS可用于从新鲜或冷冻的成人脑组织的神经元和其他细胞类型进行排序。如在引言中提到的，使用冷冻组织的能力允许从已经历复杂和长期行为的程序，如在成瘾研究自我施用和复发的研究的动物样品的最佳利用。这些行为过程通常需要1 - 2小时或更长的时间，并且要求所有动物（10 - 20个）上13,18在同一天进行测试。它需要〜4小时处理4新鲜解剖脑组织样本，其包括脑解剖，细胞解离，?...

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披露声明

The authors declare that they have no competing financial interests.

致谢

This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Brain matrixCellPoint Scientific69-2160-1to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescenceBrain BitsHA-lfBuffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
AccutaseMilliporeSCR005Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR cleanEppendorf22431081to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µmBD Falcon352340to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µmBD Falcon352360to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap capBD Bioscience352235to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, GlassNIH supply6640-00-782-6008to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibodyEMD MilliporeFCMAB317PEantibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) Cell Signaling Technology 8677antibody to detect Fos-expressing cells
DAPISigmaD8417to label nuclei
PicoPure RNA Isolation KitApplied Biosystems.KIT0204The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis systemInvitrogen18080-051to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems.4391128to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master Applied Biosystems.4444963to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00487426_g1TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probeApplied Biosystems.CACTCCAACAGCGTGACnucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primerApplied Biosystems.GGCCCCTGGCAGAAAGTAGnucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primerApplied Biosystems.TTCCCCCTGGTCCTTCTGAnucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00566603_m1TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00574125_g1TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probeApplied Biosystems.CTCATGACCACAGTCCAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primerApplied Biosystems.GACAACTTTGGCATCGTGGAAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primerApplied Biosystems.CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probeApplied Biosystems.Rn01767116_m1 TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettorRainin17014382It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR systemApplied Biosystems.446985for quantitative PCR
FACSAria I Cell SorterBD Biosciencesfor FACS sorting

参考文献

  1. Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
  2. Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
  3. Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
  4. Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
  5. Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  6. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
  7. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
  8. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
  9. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  10. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
  11. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
  12. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
  13. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
  14. Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
  15. Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
  16. US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  17. Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
  18. Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
  19. Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
  20. Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537(2015).

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