Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) et Gene Expression Analyse de Fos exprimant Neurones de frais et de tissus congelés cerveau de rat

Résumé

Nous présentons ici un Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) protocole pour étudier les altérations moléculaires à Fos-exprimant ensembles neuronaux de tissu cérébral à la fois frais et congelés. L'utilisation de tissus congelés permet FACS isolement de nombreuses zones du cerveau sur plusieurs sessions afin de maximiser l'utilisation de sujets d'animaux précieux.

Résumé

L'étude de la neuroplasticité et altérations moléculaires dans les comportements appris est de commutation de l'étude des régions du cerveau entier à l'étude des ensembles spécifiques de neurones activés faiblement distribués appelés ensembles de neurones qui interviennent dans les associations apprises. Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment été optimisé pour les tissus du cerveau de rat adulte et l'isolement des neurones activés en utilisant des anticorps contre le marqueur neuronal NeuN et de la protéine Fos, un marqueur des neurones fortement activés autorisés. Jusqu'à présent, les neurones Fos exprimant et d'autres types de cellules ont été isolées à partir de tissu frais, ce qui a entraîné jours de traitement longs et a permis un nombre très limité d'échantillons de cerveau pour être évalués après des procédures comportementales longues et complexes. Ici , nous avons constaté que les rendements de neurones et de Fos ARNm de striatum dorsal Fos exprimant étaient similaires entre les tissus fraîchement disséqués et le tissu congelé à -80 ° C pendant 3 - 21 jours. En outre, nous avons confirmé le phénotypedes cellules NeuN-positives et NeuN négatives triées en évaluant l' expression des gènes des neurones (NeuN), astrocytes (GFAP), oligodendrocytaire (Oligo2) et microgial (Iba1) marqueurs, ce qui indique que le tissu congelé peut également être utilisé pour FACS isolement de les types de cellules gliales. Dans l'ensemble, il est possible de recueillir, de disséquer et de geler les tissus du cerveau pour les sessions multiples FACS. Ceci maximise la quantité de données obtenues à partir de sujets animaux précieux qui ont souvent subi des interventions comportementales longues et complexes.

Introduction

Au cours de l'apprentissage, les animaux forment des associations entre des ensembles complexes de stimuli très spécifiques. Cette information à haute résolution est pensé pour être codé par des altérations au sein des modèles spécifiques de neurones faiblement distribués appelés ensembles neuronaux. Ensembles neuronaux ont été récemment identifiés par l'induction de gènes précoces immédiatement (PFGE) tels que Fos, Arc et Zif268 et leurs produits protéiques dans les neurones qui ont été fortement activées pendant le comportement ou l' exposition de repère. Fos-neurones exprimant ont été montré en particulier jouer un rôle causal dans le contexte spécifique et-cue des comportements appris ^1-4. Ainsi, neuroadaptations moléculaires uniques dans ces neurones Fos exprimant activés sont les meilleurs candidats pour les mécanismes neuronaux qui codent pour les associations formées au cours des troubles d'apprentissage et d' apprentissage anormal normales, telles que la toxicomanie et le trouble de stress post-traumatique (PTSD) ⁵ apprises.

Fluorescence tri cellulaire activé (FACS) a récemment permis l'analyse des neuroadaptations moléculaires uniques dans les neurones Fos exprimant. La cytométrie en flux et tri cellulaire ont été développés dans les années 1960 ^6,7 à caractériser et isoler les cellules en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de lumière et immunofluorescence, et sont utilisés depuis longtemps en immunologie et en recherche sur le cancer. Cependant cytométrie en flux et FACS nécessite des cellules individuelles dissociées qui sont difficiles à obtenir du tissu cérébral adulte. A été utilisé pour la première FACS pour isoler et analyser la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant neurones striataux provenant de souris transgéniques qui ne nécessite pas de marquage d'anticorps de ^8,9. Nous avons développé un procédé FACS à base d' anticorps ¹⁰ pour isoler et évaluer des modifications moléculaires dans les neurones activés par des médicaments et / ou des indices chez les animaux de type sauvage exprimant ^11-15 Fos. Dans ce procédé, les neurones sont marqués avec un anticorps contre le marqueur neuronal général NeuN, tandis que les neurones fortement activéssont marqués avec un anticorps contre Fos. Bien que notre méthode initiale nécessaire mise en commun jusqu'à 10 rats par échantillon pour les tissus frais, les modifications ultérieures du protocole permis FACS isolement de Fos exprimant neurones et Polymerase Chain Reaction quantitative (qPCR) analyse des zones discrètes du cerveau à partir d' un seul rat ^13-15 . Dans l' ensemble, les altérations moléculaires uniques ont été trouvés dans les neurones activés lors d' une variété de comportements et au contexte cue activé dans la recherche sur la toxicomanie ^12,14,15 Fos-exprimant.

Un problème logistique majeur à l'exécution de FACS sur tissu frais est qu'il faut une journée entière pour dissocier le tissu et le processus par FACS. En outre, seulement environ quatre échantillons peuvent être traités par jour. Cela signifie généralement qu'une seule zone du cerveau peut être évalué à partir de chaque cerveau et les zones cérébrales restantes doivent être jetés. Ceci est un problème majeur pour faible débit des procédures comportementales telles que l'auto-administration et l'extinction training qui nécessite une intervention chirurgicale et plusieurs semaines de formation intensive. En outre, les procédures comportementales longues et compliquées le jour de test, il est difficile d'effectuer FACS le même jour. Ce serait un avantage significatif pour être en mesure de geler les cerveaux des animaux immédiatement après les tests de comportement, et ensuite isoler les neurones Fos exprimant d'une ou plusieurs zones du cerveau à différents moments de son choix les enquêteurs.

Ici, nous démontrons que notre protocole FACS peut être utilisé pour isoler les neurones Fos exprimant (et d'autres types de cellules) de tissu cérébral à la fois frais et congelés. A titre d'exemple, nous avons isolé des neurones de rat striatum après des injections de méthamphétamine aiguës et de rats naïfs sans injections (condition de contrôle) Fos exprimant. Cependant, ce protocole de FACS peut être utilisé suivant un traitement comportemental ou pharmacologique. Après analyse qPCR de nos échantillons a indiqué que l'expression des gènes à partir de ces types de cellules peut être évaluée avec similar efficacité du tissu à la fois frais et congelés.

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Protocole

Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la Commission institutionnelle animale soin et l' utilisation (IACUC) des National Institutes of Health Guide pour le soin et l' utilisation des animaux de laboratoire ^16.

Remarque: Toutes les étapes ci-dessous utilisent des tubes à faible liaison centrifugeuse qui ont été conservés sur la glace, sauf indication contraire.

1. Préparation Avant Collection de tissus

1. Réglez la centrifugeuse à 4 ^o C.
2. Feu polish un ensemble de trois pipettes Pasteur en verre avec des diamètres décroissants d'environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm pour chaque échantillon.
3. Préparer étiquetés 1,7 ml tubes contenant 1 ml de tampon A froid et de garder les tubes sur la glace.
4. Préparer un bac à glaçons contenant le cerveau tranchage matrice, spatules et plaques de verre (ou inversé verre boîte de Pétri) sur lequel effectuer la dissection. Pré-froid deux ou plusieurs lames de rasoir sur les plaques de verre et les tissus d'utilisation papier pour sécher tous les instruments qui touchent le tproblème.
5. Décongeler la solution enzymatique à la température ambiante (RT) pendant 30 min avant la collecte des tissus.

2. Tissue Collection et Dissection

1. Initier le comportement ou pharmacologique traitement 90 min avant la collecte des tissus.
   NOTE: Pour les résultats présentés ici, les injections intra-péritonéales aiguës de 5 mg / kg de méthamphétamine sur des rats dans un nouvel environnement (condition de test) et des rats naïfs gardés dans leurs cages à domicile (condition de contrôle) ont été réalisées.
2. Anesthésier le rat en le plaçant dans un récipient en verre dessicateur saturé avec de l'isoflurane et décapite les rats 30 - 60 secondes plus tard à l'aide d'une guillotine.
   Utilisez des ciseaux pour enlever la peau et les muscles de la tête et exposer le crâne. Utilisez Rongeurs pour couper le crâne et ouvrir le foramen magnum et retirer la partie arrière du crâne. Utilisez Rongeurs pour couper le long des bords supérieurs du crâne pour exposer le cerveau. Veillez à ne pas endommager le cerveau. Utilisez une petite spatule pour ramasser doucement sous und élever le cerveau. Soulever le cerveau et couper les nerfs jusqu'à ce que le cerveau est libre ^17.
3. Disséquer les tissus en utilisant des lames de rasoir.
   NOTE: Obtenir des échantillons de tissus à l'aide de l'une des méthodes suivantes: (2.3.1) tissus fraîchement disséqués; (2.3.2) tissu congelé après dissection; ou (2.3.3) Le tissu congelé a disséqué à partir du cerveau entier congelé. Gardez la matrice cerveau de tranchage, des lames de rasoir et de la plaque de verre sec tout au long de la dissection et les processus que l'eau condensée émincer peut conduire à la lyse hypotonique des cellules. Utilisez des loupes pour assurer la dissection précise.
   1. Pour les tissus fraîchement disséqués, placez le cerveau fraîchement extrait dans une matrice cérébrale de tranchage (un rat en forme de cerveau moule métallique avec des fentes pour les lames de rasoir à intervalles de 1 mm) qui a été refroidi sur de la glace. Insérez deux ou plusieurs lames de rasoir pré-réfrigérés dans les fentes pour couper des tranches coronales qui contiennent la région (s) du cerveau d'intérêt. Placez la tranche de coupe sur la plaque de verre réfrigéré.
      Note: Disséquer la regio du cerveauns d'intérêt sur une plaque de verre réfrigéré.
   2. Pour les tissus congelés après dissection, disséquer la région (s) de cerveau d'intérêt à partir des tranches de cerveau fraîchement extrait, similaire à celle décrite ci-dessus à la section 2.3.1. Placez le tissu disséqué dans un microtube et congeler rapidement le tissu en submergeant le microtube à -40 ºC isopentane pendant 20 sec. Gardez le tissu disséqué congelé à tout moment dans un congélateur ºC -80 jusqu'au traitement.
   3. Pour les tissus congelés, geler immédiatement le cerveau fraîchement extrait à -40 ºC isopentane et stocker dans un sac scellé à -80 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
      1. Le jour de la dissection, placez le cerveau congelé dans un cryostat fixé à environ -20 ° C (pas plus chaud que -18 ºC) pendant environ 2 heures pour équilibrer la température.
         NOTE: Les cerveaux peuvent être coupés facilement à cette température, tandis que des températures beaucoup plus fraîches rendent le cerveau trop fragile pour être coupé en toute sécurité.
      2. Utiliser des lames de rasoir pour couper 1 - 2 mm de coupes coronalesles cerveaux congelés dans un cryostat. Utiliser une aiguille de 12 à calibre 16 émoussée pour obtenir des poinçons de tissus provenant de ces tranches dans des conditions de gel. Gardez le tissu disséqué gelé en tout temps jusqu'à un traitement ultérieur.
4. Ajouter 1 - 2 gouttes de tampon A pour couvrir le tissu disséqué avant le hachage. Éliminer la majeure partie de la substance blanche à partir du tissu en utilisant deux lames de rasoir pour empêcher la perte de neurones pendant le reste du processus de trituration. Si à partir de tissu congelé, puis laisser le tissu décongeler sur la plaque de verre à froid pour pas plus de 1 min avant d'appliquer le tampon A solution.
5. Émincer le tissu 100 fois dans chaque direction orthogonale avec une lame de rasoir sur une plaque de verre réfrigéré. Maintenir la lame de rasoir verticale par rapport à la plaque de verre lors de hachage.
   NOTE: émincer approfondie est essentielle pour toutes les étapes du protocole.
6. Utiliser des lames de rasoir pour transférer le tissu haché dans des tubes de microcentrifugation contenant 1 ml de tampon froid A. Inverser le tube 3 - 5 fois keep tout tissu haché dans la solution.

3. Cellule Dissociation

REMARQUE: Utilisez fin douce sur l'extrémité de mélange pour toutes les étapes suivantes. Ne pas utiliser un mélangeur à vortex et d'éviter les bulles d'air qui causent des dommages aux cellules.

1. Centrifuger les tubes d'échantillon à 110 g pendant 2 min à 4 ° C. surnageant Jeter. ajouter lentement 1 ml d'une solution froide, fraîchement décongelé enzymatique (contenant un mélange d'enzymes protéolytiques) vers le bas de la paroi intérieure du microtube. aspirer immédiatement la totalité de culot et doucement la pipette de haut en bas seulement 4 fois avec un modérément grande pipette de diamètre de pointe pour disperser le culot de tissu haché.
2. Inverser les microtubes immédiatement pour éviter que la pastille de coller au fond et on incube les échantillons avec un mélange de bout en bout pendant 30 min à 4 ^° C
3. Après digestion de tissu enzymatique, centrifuger les tubes à 960 g pendant 2 min à 4 ° C. Retirer le surnageant et ajouter 0,6 ml de tampon A. froide Immediately après avoir ajouté le tampon A, utiliser le même embout de pipette pour disperser le culot en aspirant l'ensemble de granulés et doucement la pipette de haut en bas 5 fois.
4. Mécaniquement triturer le tissu digéré et recueillir dans 15 ml tubes en utilisant les étapes suivantes. Pour chaque échantillon, utilisez un ensemble distinct de 3 pipettes Pasteur en verre poli-feu avec décroissant diamètres d'environ 1,3, 0,8 et 0,4 mm attachés aux ampoules en latex.
   1. triturer délicatement chaque échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 1,3 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace (les débris et les cellules non dissociées se déposent au fond). Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml) et le transfert à un tube conique de 15 ml (le tube n ° 1).
   2. Ajouter 0,6 ml de tampon Une solution au culot restant. Triturer l'échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 0,8 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace. Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml) et le transfert aux mêmes 15 ml tube conique # 1.
   3. Ajouter 0,6 ml de tampon Une solution à la pelle restantet. Triturer l'échantillon 10 fois avec la pipette de verre de 0,4 mm. Laissez l'échantillon reposer pendant 2 min sur la glace. Recueillir le surnageant (~ 0,6 ml; sans toucher le culot avec des cellules non dissociés) et transférer les mêmes 15 ml tube conique # 1.
      NOTE: Conserver le diamètre pipette de 0,4 mm dans le tube n ° 1 pour les étapes suivantes de trituration.
   4. Répétez l'étape 3.4.3 trois fois de plus en utilisant la plus petite pipette en verre (~ 0,4 mm de diamètre) et recueillir le surnageant dans un tube conique de 15 ml séparés (le tube n ° 2).
   5. Triturer les suspensions de cellules recueillies dans des tubes # 1 et # 2 pour 10 plusieurs fois à l'aide de la pipette de verre de 0,4 mm et de garder sur la glace.

4. Cellule de fixation et de perméabilisation

1. Préparer 4 microtubes par échantillon (deux microtubes pour les cellules du tube n ° 1 et deux pour les cellules du tube 2 #) en ajoutant 800 pi de 100% de l' éthanol froid (stocké à -20 ^° C avant utilisation) dans chaque tube et les garder sur la glace . Remarque: L'éthanol finalela concentration sera de 50%.
2. Introduire à la pipette ~ 800 ul des suspensions cellulaires à partir du tube (# 1 et # 2 tubes) dans chacun des 4 tubes contenant de l'éthanol froid et inverser les tubes pour mélanger les échantillons.
3. Incuber les tubes sur de la glace pendant 15 min tout en inversant les tubes toutes les 5 min.
4. Après fixation / perméabilisation, centrifuger les tubes à 1700 g pendant 4 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Laisser 50 ul de solution pour éviter la perte de cellules.
   NOTE: Les pastilles à ce stade sont blancs et collent moins à la paroi des tubes qu'auparavant perméabilisation. Par conséquent, éliminer le surnageant avec précaution en touchant la paroi du microtube où il n'y a pas de culot et d'en tirer le surnageant lentement en utilisant une micropipette.

5. Cellule de filtration

1. Re-suspendre les granulés de l'étape 4.4 avec du PBS froid comme suit:
   1. Ajouter 550 ul de PBS froid à l'un des deux microtubes en provenance du tube n ° 1, et en utilisant un modérément grand diamètre pitip pette de pipeter doucement la suspension de cellules de haut en bas 5 fois. Répétez la même chose pour un microtube venant du tube n ° 2.
   2. Pour les cellules à partir du tube n ° 1, en utilisant la même pipette, transférer la première suspension de cellules à la seconde pastille. Reprendre le second culot par pipetage doucement le combiné suspension de cellules de haut en bas 5 fois.
   3. Pour les cellules du tube n ° 2, resuspendre et combiner les pellets (ie, troisième et quatrième microtubes) comme décrit dans 5.1.2.
2. Filtrer les deux suspensions de cellules à partir des étapes 5.1.2 et 5.1.3 en utilisant séparément deux paires différentes de crépines de cellules (100 um et 40 um tailles de pores) comme suit:
   1. Prémouillage chaque tamis cellulaire en y ajoutant du PBS à l'intérieur du filtre. Utiliser une pipette pour éliminer l'excès de PBS à l'extérieur du tamis.
   2. Introduire à la pipette la suspension de cellules provenant de l'étape 5.1.2 uniformément sur le premier tamis cellulaire à 100 um de taille des pores. Recueillir l'écoulement dans un tube de 50 ml sur la glace. Utilisez le pipette pour recueillir la accréditive attachée sur le fond du côté extérieur du tamis cellulaire.
   3. Utilisez la même pipette pour transférer l'écoulement de la cellule crépine 100 um à la cellule crépine 40 pm. Recueillir ce flux continu dans un autre tube de 50 ml sur la glace. Lors du transfert de l'écoulement à travers de 40 um tamis cellulaire, changer à de nouveaux embouts de pipette pour éviter la contamination de 100 crépine um cellulaire.
   4. Répétez ces étapes pour la suspension cellulaire de l'étape 5.1.3 en utilisant un nouvel ensemble de filtres.
3. Combiner les deux flux continu de chaque échantillon, pour un volume final d'environ 1 ml par échantillon.

6. incubation avec des anticorps

REMARQUE: Utilisez les petites aliquotes des suspensions de cellules du cerveau pour préparer plusieurs échantillons de contrôle pour la mise en cytomètre en flux approprié paramètres avant d'exécuter l'échantillon principal. Pour chaque marquage d'anticorps, préparer des échantillons de contrôle qui ne contiennent aucun anticorps, seul le soicondaire anticorps (ou un autre marqueur fluorescent), puis les deux anticorps primaires et secondaires (ou un autre marqueur fluorescent). Utilisez ces commandes pour régler les portes qui séparent spécifique par rapport à l'étiquetage non-spécifique dans le cytomètre de flux. Lorsque cela est possible, utiliser fluorochromes qui ne nécessitent pas de compensation. Augmenter le volume final des échantillons de contrôle de transmission sélective à un volume final de 700 ul par addition de PBS avant l'addition des anticorps primaires.

1. Préparer diffusion de la lumière et DAPI échantillon témoin en transférant un échantillon de 100 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pl de PBS froid avec 1 pg / ml pour la coloration DAPI des noyaux. Incuber pendant 10 min avec un mélange de bout sur bout, et laver (comme indiqué dans les étapes 6.4.2 à 6.4.5) avant de passer par la cytométrie de flux.
   NOTE: Cet échantillon est utilisé uniquement pour définir la cellule / noyaux porte avant de trier les cellules restantes dans la machine FACS.
2. Préparer simples échantillons de contrôle immunomarquées en transférant 100 & #181; l des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pi de PBS froid avec un anticorps (par exemple, un anticorps NeuN). Ajouter 600 pi de PBS froid à un microtube avec un autre anticorps (par exemple, un anticorps Fos). Ajouter l'anticorps secondaire correspondant si elle est pas un anticorps primaire directe conjugué.
   REMARQUE: Ces échantillons sont utilisés pour déterminer la tension photomultiplicateur approprié (FPM), et d'évaluer le recouvrement des deux signaux fluorescents, si nécessaire. Les concentrations d'anticorps doivent être titrés pour obtenir les meilleurs rapports signal-bruit dans tous les canaux. signaux fluorescents Chevauchement peuvent également être compensées par un étalonnage interne de différents canaux fluorescents au sein de la cytométrie de flux.
3. Préparer à double échantillon témoin négatif marqué par fluorescence en transférant 100 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 600 pi de PBS froid avec les anticorps secondaires seuls ou des anticorps primaires directe conjugués IgG.
   NOTE: Thiéchantillon s de contrôle peut être utilisé à chaque fois avant le tri pour déterminer la fluorescence de fond pour chaque fluorophore.
4. Préparer l'échantillon principal à trier.
   1. Transférer 700 ul des cellules filtrées dans un microtube de 1,7 ml. Ajouter 7 pi (1: 100) de l'anticorps primaire conjugué à Fos directement à Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) et 1,4 pi (1: 500) de l'anticorps primaire conjugué à NeuN directement à la phycoérythrine (anti-NeuN-PE). Incuber les tubes pendant 30 minutes à 4 ° C avec un mélange de bout sur bout.
   2. A la fin de l'incubation, ajouter 800 ul de PBS froid à chaque microtube, y compris l'échantillon principal et les échantillons témoins et mélanger par retournement.
   3. microtubes à centrifuger à 1300 xg pendant 3 min à 4 ºC. Jeter le surnageant, laissant 50 surnageant ul pour empêcher la perte de cellules.
   4. Ajouter 1 ml de PBS froid aux cellules de granulés et resuspendre en utilisant une pipette avec un diamètre modérément large de la pointe.
   5. Centrifugeuse à 1300 xg pendant 3 min à 4 ° C. réiscard le surnageant.
   6. Re-suspendre le culot dans 500 ul de PBS froid (régler le volume en fonction de la taille finale de la pastille).
   7. Transfert et filtrer la suspension dans un tube d'échantillon à fond rond FACS avec un bouchon de crépine de cellules (40 pm). Gardez les cellules immunomarquées sur la glace et effectuer immédiatement FACS. Remarque: Pour le filtrage, appuyez sur la pointe de la pipette verticalement sur le capuchon de la crépine et pousser la suspension cellulaire à travers elle.
5. Set cytomètre portes à l'aide d'échantillons de contrôle.
   1. Utilisez la diffusion de la lumière et DAPI échantillon de contrôle pour identifier la population des cellules neuronales du total des événements et les débris cellulaires.
      NOTE: Les corps cellulaires dans cette préparation ne sont que 1 - 2% du total des événements (les autres sont les débris et les processus cellulaires brisés). Sur la base de signal de DAPI fluorescent (noyaux indiquant) et scatter Forward (taille de la cellule), il est possible de localiser les corps cellulaires et la porte arrière sur la base du Forward et Side propriétés de diffusion de la lumièreles cellules (comme représenté sur la figure 1 A, B).
   2. Utilisez les échantillons de contrôle immunomarquées simples pour déterminer les réglages de tension de PMT et d'analyser des retombées de l' émission d'un fluorochrome spécifique dans un autre filtre / canal (par exemple, Alexa Fluor 488 / FITC ou phycoérythrine). Si des signaux fluorescents se chevauchent, corriger le chevauchement en ajustant les niveaux de rémunération manuellement.
   3. Utilisez la double contrôle négatif marqué par fluorescence à mettre en place le seuil pour la population positive.
      REMARQUE: le signal provenant de cet échantillon est considéré comme dû à l'auto-fluorescence et les cellules de l'échantillon principal situé au-dessus de ce seuil peut être considéré comme positif. En règle générale, les paramètres de seuil pour le tri sont plus strictes et à peu près le top 2/3 des cellules marquées au-dessus du contrôle négatif sont effectivement triés.
6. Trier les neurones à partir de l'échantillon principal par FACS dans 1,7 ml microtubes. Recueillir les cellules dans 50 ul d'ARNun tampon d'extraction. Après le tri, vortex et centrifuger le tube et mélanger la suspension par pipetage de haut en bas 10 fois pour récupérer toutes les cellules triées par les parois du tube.
7. Incuber la suspension de cellules triées à 42 ° C pendant 30 min pour assurer que toutes les cellules sont lysées avant l'extraction de l'ARN, puis centrifuger à 2.800 xg pendant 2 min à 4 ° C.
8. Transférer le surnageant dans un tube sans RNase pour le stockage à long terme à -80 ° C ou immédiatement traiter l'échantillon pour l' isolement de l' ARN, la synthèse d'ADNc, le gène cible de pré-amplification et de qPCR, comme décrit précédemment ^13-15.

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Résultats

Tri neurones Fos-positifs et Fos-négatifs de tissus frais et congelé striatum dorsal de rats simples après des injections de méthamphétamine aiguës.

Le protocole décrit ci-dessus a été utilisé pour trier les neurones Fos-positifs et négatifs de Fos à partir d'un seul rat striatum dorsal 90 min après une injection intrapéritonéale de la méthamphétamine (5 mg / kg). les rats naïfs dans leurs cages ont été...

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Discussion

FACS peut être utilisé pour trier les neurones et d'autres types de cellules provenant soit du tissu cérébral adulte frais ou congelé. Comme mentionné dans l'introduction, la possibilité d'utiliser les tissus congelés permet une utilisation optimale des échantillons provenant d'animaux qui ont subi des procédures comportementales complexes et prolongées, comme l'auto-administration et de rechute des études dans la recherche sur la toxicomanie. Ces procédures de comportement prend habitue...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain matrix	CellPoint Scientific	69-2160-1	to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescence	Brain Bits	HA-lf	Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
Accutase	Millipore	SCR005	Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340	to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µm	BD Falcon	352360	to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, Glass	NIH supply	6640-00-782-6008	to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody	EMD Millipore	FCMAB317PE	antibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Cell Signaling Technology	8677	antibody to detect Fos-expressing cells
DAPI	Sigma	D8417	to label nuclei
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis system	Invitrogen	18080-051	to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Applied Biosystems.	4444963	to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primer	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	nucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probe	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primer	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettor	Rainin	17014382	It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR system	Applied Biosystems.	446985	for quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		for FACS sorting