JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים מיון תא הופעל קרינה (FACS) פרוטוקול ללמוד שינויים מולקולריים Fos להביע רכבים עצביים משתי רקמת מוח טריה וקפואה. שימוש רקמה קפוא מאפשר בידוד FACS של אזורי מוח רבים על פני פגישות מרובות כדי למקסם את השימוש בנושאי בעלי חיים בעלי ערך.

Abstract

המחקר של פלסטיות עצבית ושינויים מולקולריים התנהגויות למדו עובר מהמחקר של אזורים במוח כולו ללימוד קבוצות הספציפיות של נוירונים מופעלים בדלילות שנקראים רכבים עצביים אשר מתווכות למדו עמותות. תא קרינת מיון מופעל (FACS) כבר מותאם לאחרונה עבור רקמת מוח עכברוש מבוגר ואפשר בידוד של נוירונים מופעלים באמצעות נוגדנים נגד הסמן העצבי NeuN ו Fos חלבון, סמן של נוירונים הופעל בחום. עד עכשיו, פוס-להביע עצב סוגי תאים אחרים נותקו מן הרקמה טריה, שהיה כרוכות ימי עיבוד ארוכים ואפשרו מספרים מצומצמים מאוד של דגימות המוח יוערכו לאחר נהלי התנהגות ממושכים ומורכבים. כאן מצאנו כי התשואות של Fos-להביע עצב ו Fos mRNA מ בסטריאטום הגבי היו דומות בין רקמות טרי גזור ורקמות קפוא ב -80 ºC עבור 3 - 21 ימים. בנוסף, אישרנו את הפנוטיפשל NeuN-חיובי תאים ממוינים NeuN שליליים על ידי סמני ביטוי גנים בהערכת סעיף עצבי (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) ו microgial (Iba1), אשר מציין כי רקמה קפוא יכולה לשמש גם לבידוד FACS של סוגי תאי גליה. בסך הכל, אפשר לאסוף, לנתח ולהקפיא רקמת מוח הפעלות FACS המרובה. זה ממקסם את כמות נתונים המתקבלים בנושאי בעלי חיים יקרים, כי לעתים קרובות עברו נהלי התנהגות ארוכים ומורכבים.

Introduction

במהלך למידה, חיות להתאגד בין מכלולי גירויים מאוד ספציפיים. מידע ברזולוציה גבוהה זה הוא חשב להיות מקודד על ידי שינויים בתוך דפוסים מסוימים של נוירונים בדלילות שנקראים רכבים עצביים. רכבים עצביים זוהו לאחרונה על ידי האינדוקציה של גנים מוקדם מייד (IEGs) כגון Fos, Arc, ואת Zif268 ומוצרי החלבון שלהם בנוירונים אשר הופעלו בתוקף במהלך התנהגות או חשיפת קיו. Fos-להביע עצב בפרט הוכח לשחק תפקידים סיבתי בהקשר ו קיו ספציפי למדו התנהגויות 1-4. לפיכך, neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך המופעל אלה נוירונים Fos להביע הם מועמדים מובילים עבור המנגנונים העצביים מקודדים למדו עמותות נוצרו במהלך למידה רגילה ולמידה נורמלית הפרעות, כגון התמכרות והפרעת דחק פוסט-טראומטית (PTSD) 5.

FluoreCell Scence המיון המופעל (FACS) אפשר ניתוח לאחרונה neuroadaptations המולקולרי הייחודי בתוך הנוירונים להביע Fos. Cytometry זרימה מיון תאים שפותחו בשנות ה -1960 6,7 לאפיין ולבודד תאים לפי מאפייני פיזור האור ואת immunofluorescent שלהם, ואת כבר זמן רב בשימוש באימונולוגיה וחקר הסרטן. עם זאת cytometry זרימת FACS דורש תאים בודדים ניתקים שקשה להשיג מרקמות מוח מבוגרות. FACS שימש לראשונה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing נוירונים striatal מעכברים מהונדס כי לא דורשים תיוג נוגדן 8,9. פתחנו שיטת FACS מבוסס נוגדנים 10 לבודד ולהעריך שינויים מולקולריים Fos-להביע עצב מופעל על ידי סמים ו / או רמזים בחי סוג בר 11-15. בשיטה זו, נוירונים מסומנים עם נוגדן כנגד הסמן עצבי הכללי NeuN, בעוד מופעל בחום נוירוניםמסומנים עם נוגדן כנגד Fos. אמנם השיטה הראשונית שלנו נדרשת איגום של עד 10 חולדות לדגימה עבור רקמה טריה, שינויים מאוחרים יותר של הפרוטוקול מותר בידוד FACS של נוירונים Fos-הבעת תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR) ניתוח של אזורים במוח הבדידים של חולדה אחת 13-15 . בסך הכל, שינויים מולקולריים ייחודיים נמצאו Fos-להביע עצב המופעל במהלך מגוון של התנהגויות להיקשר ו קיו המופעל במחקר התמכרות 12,14,15.

בעיה לוגיסטית גדולה עם ביצוע FACS על רקמה טריה היא שזה לוקח יום שלם כדי לנתק את הרקמה ותהליך ידי FACS. בנוסף, רק כארבע דגימות יכולות להיות מעובד ליום. בדרך כלל זה אומר כי רק באזור מוח אחד ניתן להעריך מכל מוח ואת אזורי המוח הנותרים צריכים להיות מושלכים. זוהי אחת בעיות עיקריות עבור נהלי התנהגות תפוקה נמוכה כגון מנהל עצמי ואת trai ההכחדהנינג הדורש ניתוח ושבועות רבים של אימונים אינטנסיביים. יתר על כן, ארוכים ומורכבים נהלי התנהגות ביום בדיקה מקשה לבצע FACS באותו היום. זה יהיה יתרון משמעותי על מנת להיות מסוגל להקפיא את המוח מן הבהמה מיד לאחר בדיקות התנהגותיות, ולאחר מכן לבודד נוירונים Fos להביע מאזורים במוח אחד או יותר בזמנים שונים לפי בחירת החוקרים.

כאן אנו מראים כי פרוטוקול FACS שלנו יכול לשמש כדי לבודד נוירונים Fos להביע (סוגי תאים אחרים) משתי רקמת מוח טריה וקפואה. כדוגמא, אנחנו מבודדים Fos-להביע עצב מן בסטריאטום עכברוש לאחר זריקות מתאמפטמין אקוטיות של חולדות נאיביות ללא זריקות (מצב מלא). עם זאת, פרוטוקול FACS זה יכול לשמש לאחר כל טיפול התנהגותי או תרופתי. ניתוח qPCR העוקבת של דגימות שלנו עולה כי ביטוי גנים סוגי תאים אלה ניתן להעריך עם סימייעילות Lar משתי רקמות טריות וקפואות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של ה- National Institutes of Health מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה 16.

הערה: כל השלבים הבאים צינורות צנטריפוגה שימוש מחייב נמוכים כי הוחזקו על קרח אלא אם צוין אחר.

1. הכנה לפני אוסף רקמות

  1. הגדר את צנטריפוגות עד 4 מעלות צלסיוס
  2. אש פולנית סט של שלוש פיפטות פסטר זכוכית עם בקטרים ​​הולכים ויורדים של 1.3 כ, 0.8, ו -0.4 מ"מ עבור כל דגימה.
  3. הכן שכותרתו 1.7 מ"ל-צינורות המכיל 1 מ"ל קר הצפת ולשמור את הצינורות על הקרח.
  4. הכין מגש קרח המכיל את מוח חיתוך מטריקס, שפכטלים וצלחות זכוכית (או בכלי זכוכית פטרי הפוכים) שעליו לבצע את הנתיחה. צמרמורת קדם סכיני גילוח שתיים או יותר על נייר לוחות זכוכית ושימוש ברקמות לייבוש כל המכשירים כי לגעת tנושא.
  5. להפשיר את הפתרון אנזים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות לפני איסוף רקמות.

רקמות 2. איסוף Dissection

  1. ליזום את 90 דקות טיפול התנהגותי או תרופתי לפני איסוף רקמות.
    הערה: לקבלת התוצאות המוצגות כאן, זריקות intraperitoneal חריפות של 5 מ"ג / קילו מתאמפטמין על חולדות בסביבת רומן (תנאי בדיקה) וחולדות נאיביות בכלובים בביתם (מצב מלא) בוצעו.
  2. להרדים את העכברוש על ידי הצבתו בתוך צנצנת ייבוש זכוכית עם isoflurane רווי לערוף את 30 עכברוש - שניות 60 מאוחר יותר באמצעות גיליוטינה.
    השתמש במספריים כדי להסיר את העור והשרירים מהראש ולחשוף את הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך את הגולגולת ולפתוח מגנום foramen ולהסיר את החלק האחורי של הגולגולת. השתמש rongeurs לחתוך לאורך השוליים העליונים של הגולגולת כדי לחשוף את המוח. היזהר שלא להזיק למוח. השתמש מרית קטנה כדי לגרוף בעדינות תחתd לרומם את המוח. הרם את המוח לחתוך את העצבים עד למוח ללא תשלום 17.
  3. לנתח רקמות באמצעות סכיני גילוח.
    הערה: קבל דגימות רקמה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: (2.3.1) רקמת גזור טרי; (2.3.2) רקמה קפוא לאחר דיסקציה; או (2.3.3) רקמה קפוא גזור מן המוח כולו קפוא. שמור המטריצה ​​חיתוך המוח, סכיני גילוח ויבש זכוכית צלחת ברחבי לנתיחה וקוצצים תהליכים כמים מרוכז יכול להוביל lysing hypotonic של תאים. השתמש בזכוכית מגדלת על מנת להבטיח לנתיחה מדויקת.
    1. עבור רקמות גזורות טרי, למקם את המוח הטרי חילוץ לתוך מטריצת חיתוך המוח (תבנית מתכת עכברוש בצורת מוח עם חריצים עבור סכיני הגילוח ב 1 במרווחי מ"מ) כי כבר מקוררת על קרח. הכנס שני או יותר סכיני גילוח מראש צונן לתוך החריצים לחתוך פרוסות עטרה המכילות את האזור במוח (ים) של עניין. מניח את הפרוסה לגזור על צלחת זכוכית הצוננת.
      הערה: לנתח את Regio המוחNS של ריבית על צלחת זכוכית צוננת.
    2. עבור רקמה קפוא לאחר דיסקציה, לנתח את האזור במוח (ים) של עניין מן פרוסות מוח חילוץ טרי, דומה לזה שתואר לעיל 2.3.1. הנח את הרקמה גזורה לתוך microtube במהירות להקפיא את הרקמות על ידי השריית microtube ב איזופנטאן -40 ºC במשך 20 שניות. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת במקפיא -80 ºC עד לעיבוד נוסף.
    3. עבור הרקמה הקפואה, מיד להקפיא את המוח חילוץ טרי ב -40 ºC איזופנטאן ולאחסן בשקית אטומה ב -80 ºC עד 6 חודשים.
      1. ביום לנתיחה, למקם את המוח הקפוא בתוך cryostat נקבע על כ -20 ºC (לא חם יותר מאשר -18 ºC) למשך כ 2 שעות כדי לאזן את הטמפרטורה.
        הערה: Brains ניתן לחתוך בקלות בטמפרטורה זו, בעוד הרבה בטמפרטורות קרירות להפוך את המוח שביר מדי להיחתך בבטחה.
      2. השתמש סכיני גילוח לחתוך 1 - 2 מ"מ פרוסות עטרה שלבמוחם הקפוא cryostat. שימוש במחט 12 עד 16-מד קהה להשיג אגרופי רקמה פרוסות אלה בתנאי הקפאה. שמור גזור הרקמה הקפואה בכל עת עד לעיבוד נוסף.
  4. להוסיף 1 - 2 טיפות של הצפה כדי לכסות את הרקמה הגזורה לפני מיותר. הסר ביותר של החומר הלבן מהרקמה באמצעות שני סכיני גילוח כדי למנוע אובדן של נוירונים במהלך שאר תהליך הטחינה הדק. אם מתחיל עם רקמה קפוא, ואז לאפשר לרקמות להפשיר על צלחת הזכוכית הקרה למשך לא יותר מ 1 דקות לפני מריחת הצפת פתרון.
  5. לרכך את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון מאונך עם סכין גילוח על צלחת זכוכית צוננת. החזק את סכין הגילוח אנכי לצלחת הזכוכית כאשר מיותר.
    הערה: מתייפייפים יסודי הוא קריטי עבור כל צעדי הפרוטוקול.
  6. השתמש סכיני גילוח להעביר את רקמות טחון לתוך צינורות microcentrifuge המכיל 1 מ"ל של חיץ א קר להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי KEEP כל הרקמות הטחונות בתמיסה.

3. תא דיסוציאציה

הערה: בסוף עדין השתמש מעל סוף הערבוב עבור כל השלבים הבאים. אין להשתמש במערבל מערבולת ולהימנע בועות אוויר הגורמות נזק לתאים.

  1. צנטריפוגה דוגמיות ב 110 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. supernatant מחק. לאט לאט להוסיף 1 מ"ל של תמיסת אנזים קר טרי מופשר (המכיל תערובת של אנזימים מפרקי חלבונים) במורד הדופן הפנימית של microtube. מייד להתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה רק 4 פעמים עם טפטף בקוטר טיפ גדול בינוני לפזר את גלולת רקמות הטחונה.
  2. הפוך את microtubes מייד כדי למנוע הגלולה יידבק לתחתית דגירת הדגימות עם ערבוב קצה מעל לקצה עבור 30 דקות ב 4 מעלות צלסיוס
  3. לאחר עיכול רקמות האנזימטית, צנטריפוגה צינורות ב 960 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC. הסר את supernatant ולהוסיף 0.6 מ"ל של קר הצפת א Immediately לאחר הוספת החיץ, להשתמש באותו קצה פיפטה לפזר את הכדור על ידי מתחנף הגלולה כולו פיפטה בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
  4. מבחינה מכאנית triturate הרקמה מתעכלת ונאסף 15 מיליליטר צינורות באמצעות השלבים הבאים. עבור כל דגימה, השתמש קבוצה נפרדת של 3 פיפטות פסטר זכוכית אש מלוטש עם יורד בקטרים ​​של כ 1.3, 0.8 ו -0.4 מ"מ מחוברת נורות לטקס.
    1. בעדינות triturate כל דגימה 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 1.3 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח (פסולת ותאי undissociated יהיה ליישב לתחתית). אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל (צינור # 1).
    2. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון גלולה הנותרים. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.8 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל) ולהעביר אותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
    3. להוסיף 0.6 מ"ל הצפת פתרון Pelle הנותריםt. Triturate מדגם 10 פעמים עם פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ. בואו המדגם להסתפק 2 דקות על הקרח. אסוף את supernatant (~ 0.6 מ"ל; בלי לגעת גלולה עם תאים שאינם ניתק) ולהעביר לאותו 15 מ"ל # צינור חרוטי 1.
      הערה: שמור על פיפטה בקוטר 0.4 מ"מ בצינור # 1 עבור צעדי הטחינה הדקים הבאות.
    4. 3.4.3 חזור על שלב שלוש פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית הקטנה (~ 0.4 מ"מ קוטר), לאסוף את supernatant לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר נפרד (צינור # 2).
    5. Triturate השעיות התא נאספים צינורות # 1 ו # 2 עבור 10 פעמים יותר בעזרת פיפטה זכוכית 0.4 מ"מ ולשמור על הקרח.

Cell 4. קיבוע Permeabilization

  1. כן 4 microtubes לדגימה (שני microtubes עבור תאים מצינור # 1 ושני תאים מצינור # 2) על ידי הוספת 800 μl של אתנול קר 100% (מאוחסן ב -20 מעלות צלסיוס לפני השימוש) לתוך צינור אחד ולשמור אותם על קרח . הערה: אתנול הסופיריכוז יהיה 50%.
  2. פיפטה ~ 800 μl של מתלי התא (מצינור # 1 צינור # 2) לתוך כל אחת מ -4 הצינורות המכילים אתנול קר להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות.
  3. דגירת צינורות על קרח במשך 15 דקות תוך היפוך הצינורות כל 5 דקות.
  4. לאחר קיבוע / permeabilization, צנטריפוגות צינורות ב 1700 XG במשך 4 דקות ב 4 ºC וזורקים supernatant. השאירו 50 μl של פתרון כדי למנוע אובדן התא.
    הערה: הכדורים בשלב הזה לבנים, מקל פחות לקיר של הצינורות מבעבר permeabilization. לכן, להסיר את supernatant בקפידה על ידי נוגע בקיר של microtube שבו אין גלולה ולצייר את supernatant לאט באמצעות micropipette.

סינון נייד 5.

  1. Re- להשעות את כדורי משלב 4.4 עם PBS קר כדלקמן:
    1. להוסיף 550 μl של PBS קר אל אחד משני microtubes מגיע צינור # 1, ולהשתמש pi בקוטר גדול בינוניטיפ pette כדי פיפטה עד ההשעיה תא בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים. חזור על אותו הדבר עבור microtube אחד מגיע צינור # 2.
    2. עבור תאים מצינור # 1, באמצעות פיפטה אותו, להעביר את השעית התא הראשונה של הגלולה השנייה. Resuspend גלולה השני על ידי pipetting למעלה ההשעיה תא משולב בעדינות מעלה ומטה 5 פעמים.
    3. עבור תאים מצינור # 2, resuspend ולשלב את הכדורים (כלומר, microtubes השלישי והרביעי) כמתואר 5.1.2.
  2. סנן את שני מתלי התא מפני צעדים 5.1.2 ו 5.1.3 בנפרד באמצעות שני זוגות שונים של מסננות תא (100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר גודל נקבובי) כדלקמן:
    1. טרום רטוב כל מסננת תא על ידי הוספת PBS על החלק הפנימי של המסננת. השתמש פיפטה להסיר את PBS העודף מהחלק החיצוני של המסננת.
    2. פיפטה השעית תא משלב 5.1.2 באופן אחיד על מסננת התא הראשונה עם גודל נקבובי 100 מיקרומטר. אסוף את הזרימה דרך צינור 50 מ"ל על הקרח. השתמש pipette כדי לאסוף את הזרימה דרך מצורף בתחתית הצד החיצונית של מסננת התא.
    3. השתמש פיפטה אותו להעביר את הזרימה דרך מן מסננת תא 100 מיקרומטר מסננת תא 40 מיקרומטר. אסוף זרימה דרך זו עוד צינור 50 מ"ל על הקרח. בעת העביר את הזרימה דרך מ- 40 מיקרומטר מסננת תא, לשנות טיפים פיפטה חדשים כדי למנוע זיהום בין 100 מיקרומטר תא מסנן.
    4. חזור על שלבים אלה עבור השעית התא משלב 5.1.3 באמצעות סט חדש של מסננים.
  3. מערבבים את הזרימה דרך שתי מכל מדגם עבור נפח סופי של כ 1 מ"ל לדגימה.

6. דגירה עם נוגדנים

הערה: משתמש aliquots הקטן של מתלי תא המוח להכין דגימות שליטה מרובות עבור הגדרת הזרימה מתאימה cytometer הגדרות לפני הפעלת המדגם העיקרי. עבור כל תיוג נוגדן, להכין דגימות בקרה כוללות לא נוגדנים, רק seנוגדן condary (או תווית ניאון אחרת), ולאחר מכן הוא נוגדנים ראשוניים ומשניים (או תווית ניאון אחרת). השתמש בבקרות אלה כדי להגדיר את השערים מפרידים ספציפי לעומת התיוג הלא ספציפי של cytometer הזרימה. במידת האפשר, להשתמש fluorochromes שאינם דורשים פיצוי. הגבר את עוצמת הקול הסופית של דגימות בקרת gating לנפח סופי של 700 μl ידי הוספת PBS לפני הוספת הנוגדנים הראשוניים.

  1. הכן-פיזור אור מדגם מלא DAPI ידי העברת מדגם 100 μl של התאים המסוננים על microtube 1.7 מיליליטר. להוסיף 600 μl של PBS קר עם 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI מכתים גרעינים. דגירה במשך 10 דקות עם ערבוב הקצה על הקצה, ולשטוף (כמצוין צעדים 6.4.2 ל 6.4.5) לפני שהיא עוברת דרך cytometer זרימה.
    הערה: דגימה זו משמשת רק כדי להגדיר את שער התא / גרעינים לפני מיון התאים הנותרים במכונת FACS.
  2. הכן דגימות בקרת immunolabeled יחידות על ידי העברת 100 & #181; l של תאים מסוננים על 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 600 μl של PBS קר עם נוגדן אחד (למשל, נוגדן NeuN). להוסיף 600 μl של PBS קר אל microtube עם נוגדן אחר (למשל, נוגדן Fos). מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים אם זה לא נוגדן ראשוני ישיר מצומדות.
    הערה: דגימות אלה משמשים כדי לקבוע את צינור מכפיל המתאים (PMT) מתח, ועל מנת להעריך את החפיפה של שני אותות ניאון במידת הצורך. ריכוזי נוגדנים צריכים להיות טיטרציה כדי להשיג את יחסי אות לרעש הטובים ביותר בכל הערוצים. אותות ניאון חופפים ניתן לפצות גם על ידי כיול פנימי של ערוצי ניאון שונים בתוך הזרימה cytometer.
  3. הכן מדגם שליטה שלילי ניאון שכותרתו כפול על ידי העברת 100 μl של תאים מסוננים על microtube 1.7 מ"ל. להוסיף 600 μl של PBS הקר עם נוגדנים משני לבד או נוגדנים ראשוניים ישירים מצומדות IgG.
    הערה: תימדגם מלא של ניתן להשתמש בכל פעם לפני המיון כדי לקבוע את קרינת הרקע עבור כל fluorophore.
  4. כן מדגם עיקרי להיות מסודר.
    1. העבר 700 μl של תאים מסוננים לתוך 1.7 מ"ל microtube. להוסיף 7 μl (1: 100) של נוגדן Fos העיקרי מצומדות ישירות אלקסה פלואוריד 647 (אנטי-Fos-AF647) ו -1.4 μl (1: 500) של נוגדן NeuN העיקרי מצומדות ישירות Phycoerythrin (אנטי-NeuN-PE). דגירה צינורות במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עם ערבוב הקצה על הקצה.
    2. בסוף הדגירה, מוסיפים 800 μl של קר PBS על כל microtube, כולל המדגם העיקרי דגימות בקרה, ומערבבים על ידי היפוך.
    3. microtubes צנטריפוגה ב 1,300 XG 3 דקות ב 4 ºC. בטל supernatant, עוזב 50 supernatant μl כדי למנוע אובדן התא.
    4. הוסף 1 מיליליטר של PBS הקר לתאים הגלולים ו resuspend בעזרת פיפטה בקוטר טיפ די רב.
    5. צנטריפוגה ב 1300 XG 3 דקות ב 4 ºC. Discard supernatant.
    6. Re- להשעות גלולה ב 500 μl PBS קר (להתאים את עוצמת הקול הסופי תלוי בגודל של גלולה).
    7. העברה ולסנן את ההשעיה לתוך צינור מדגם מסביב לתחתית FACS עם כובע מסננת תא (40 מיקרומטר). שמור את התאים immunolabeled על הקרח ומיד לבצע FACS. הערה: סינון, לגעת קצה פיפטה אנכית על הכובע המסנן ולדחוף את השעית תא דרך זה.
  5. זרימת גדר cytometer שערים באמצעות דגימות בקרה.
    1. השתמש פיזור אור המדגם מלא DAPI לזהות את אוכלוסיית תאים העצבית מאירועי הכולל ופסולת הסלולר.
      הערה: גופי תא בהכנה זו הם רק 1 - 2% של סך כל אירועים (השאר הוא פסולת תהליכים תאיים שבורים). בהתבסס על אות ניאון DAPI (גרעינים מציינים) ואת פיזור קדימה (גודל של התא) אפשר לאתר גופי תא שער לאחור מבוססים על קדימה וצד אור פיזור נכסים שלהתאים (כפי שמוצג באיור 1 א ', ב).
    2. השתמש בדגימות שליטה immunolabeled אחת כדי לקבוע את הגדרות מתח PMT, ולנתח גלישת פליטה מן fluorochrome אחד מסוים לתוך מסנן אחר / ערוץ (למשל, Alexa פלואוריד 488 / FITC או Phycoerythrine). אם אותות ניאון חופפים, לתקן את החפיפה באמצעות התאמת רמות פיצוי ידנית.
    3. השתמש בשלט השלילי הניאון שכותרתו הכפול להגדיר את הסף עבור האוכלוסייה החיובית.
      הערה: האות מגיע מדגם זה נחשב בשל קרינה אוטומטית ותאי המדגם העיקרי הנמצא מעל סף זה יכול להיחשב חיובי. בדרך כלל, פרמטרי הסף למיון הם מחמירים יותר וכ העליון 2/3 התאים שכותרתו מעל הביקורת השלילית הם למעשה מסודרות.
  6. מיין הנוירונים מן המדגם העיקרי ידי FACS לתוך 1.7 microtubes מ"ל. אוספים את התאים לתוך 50 μl של רנ"אחיץ החילוץ. לאחר מיון, מערבולת ו צנטריפוגות הצינור ומערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לשחזר את כל התאים הממוינים מן הקירות של הצינור.
  7. לדגור על השעיית התא מיון ב -42 ºC למשך 30 דקות על מנת להבטיח כי כל התאים lysed לפני מיצוי RNA, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 2,800 XG במשך 2 דקות ב 4 ºC.
  8. מעבירים את supernatant צינור RNase ללא עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ºC או מיד לעבד את המדגם עבור בידוד RNA, סינתזה cDNA, הגברה-מראש הגן היעד qPCR, כפי שתואר לעיל 13-15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מיון נוירונים Fos-חיובי Fos-שלילי מרקמות בסטריאטום הגבה טריות וקפואות מן החולדות יחידות לאחר זריקות מתאמפטמין חריפות.

הפרוטוקול המתואר לעיל היה רגיל לסוג Fos-חיובי Fos-שלילי נוירונים מתוך 90 דקות בס?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניתן להשתמש FACS למיין נוירונים סוגי תאים אחרים מרקמות המוח המבוגר טרי או קפוא. כפי שהוזכר במבוא, את היכולת להשתמש רקמה קפוא מאפשרת ניצול אופטימלי של דגימות מבעלי החיים שעברו הליכי התנהגותי מורכבים וממושך, כגון לימודי מנהל עצמי ו להרע במחקר התמכרות. נהלי התנהגות אלה בד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

This work was supported by the NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. was supported by an appointment to the NIDA Research Participation Program sponsored by the National Institutes of Health and administered by the Oak Ridge Institute for Science and Education, and received additional financial support from a Becas-Chile scholarship managed by CONICYT and the Universidad de los Andes, Santiago, Chile. The Johns Hopkins FACS Core facility was supported by Award P30AR053503 from the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institute of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Brain matrixCellPoint Scientific69-2160-1to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescenceBrain BitsHA-lfBuffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
AccutaseMilliporeSCR005Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR cleanEppendorf22431081to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µmBD Falcon352340to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µmBD Falcon352360to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap capBD Bioscience352235to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, GlassNIH supply6640-00-782-6008to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibodyEMD MilliporeFCMAB317PEantibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) Cell Signaling Technology 8677antibody to detect Fos-expressing cells
DAPISigmaD8417to label nuclei
PicoPure RNA Isolation KitApplied Biosystems.KIT0204The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis systemInvitrogen18080-051to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master MixApplied Biosystems.4391128to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master Applied Biosystems.4444963to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00487426_g1TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probeApplied Biosystems.CACTCCAACAGCGTGACnucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primerApplied Biosystems.GGCCCCTGGCAGAAAGTAGnucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primerApplied Biosystems.TTCCCCCTGGTCCTTCTGAnucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00566603_m1TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probeApplied Biosystems.Rn00574125_g1TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probeApplied Biosystems.CTCATGACCACAGTCCAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primerApplied Biosystems.GACAACTTTGGCATCGTGGAAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primerApplied Biosystems.CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGAnucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probeApplied Biosystems.Rn01767116_m1 TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettorRainin17014382It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR systemApplied Biosystems.446985for quantitative PCR
FACSAria I Cell SorterBD Biosciencesfor FACS sorting

References

  1. Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
  2. Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking. J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).
  3. Fanous, S., et al. Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving. J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).
  4. Koya, E., et al. Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization. Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).
  5. Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  6. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. Spectrophotometric cell sorter. Science. 156, 1364-1365 (1967).
  7. Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis. Science. 150, 630-631 (1965).
  8. Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains. Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).
  9. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  10. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).
  11. Guez-Barber, D., et al. FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons. J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).
  12. Fanous, S., et al. Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking. J Neurochem. 124, 100-108 (2013).
  13. Liu, Q. R., et al. Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS). J Neurochem. 128, 173-185 (2014).
  14. Rubio, F. J., et al. Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons. J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).
  15. Li, X., et al. Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons. J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).
  16. US National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , (2011).
  17. Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles. Current Protocols. , (2016).
  18. Cruz, F. C., et al. New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear. Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).
  19. Mardones, G., Gonzalez, A. Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins. J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).
  20. Molyneaux, B. J., et al. DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex. Neuron. 85, 275-288 (2015).
  21. Schwarz, J. M. Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. J Vis Exp. , e52537(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience114mRNAFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved