Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Protokoll zu untersuchen molekulare Veränderungen in Fos-exprimierenden neuronalen Ensembles aus frischen und gefrorenen Hirngewebe. Die Verwendung von gefrorenem Gewebe ermöglicht FACS Isolierung von vielen Bereichen des Gehirns über mehrere Sitzungen hinweg die Verwendung von wertvollen tierischen Patienten zu maximieren.

Zusammenfassung

Die Studie der Neuroplastizität und molekularen Veränderungen in erlernten Verhaltensweisen aus der Studie von ganzen Hirnregionen zur Untersuchung spezifischer Sätze von spärlich verteilten aktivierten Neuronen Schalt neuronalen Ensembles genannt, die Verbände vermitteln gelernt. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wurde vor kurzem für erwachsene Rattenhirngewebe und erlaubt die Isolierung von aktivierten Neuronen optimiert Antikörpern gegen den neuronalen Marker NeuN und Fos Protein, ein Marker der stark aktivierten Neuronen verwenden. Bisher Fos-exprimierenden Neuronen und anderen Zelltypen wurden aus frischem Gewebe isoliert, die lange Bearbeitungs Tage und erlaubt sehr begrenzte Anzahl von Gehirnproben brachte nach langwierigen und komplexen Verhaltensverfahren beurteilt werden. Hier fanden wir , dass die Renditen von Fos-exprimierenden Neuronen und Fos mRNA aus dorsalen Striatum ähnlich waren zwischen frisch sezierten Gewebe und Gewebe bei -80 ° C eingefroren 3 - 21 Tage. Zusätzlich bestätigten wir den Phänotypder NeuN-positive und NeuN-negativ sortierten Zellen durch die Bewertung der Genexpression von neuronalen (NeuN), astrozytären (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) und microgial (Iba1) Marker, die das gefrorene Gewebe für FACS Isolierung kann auch verwendet werden , von Glia-Zelltypen. Insgesamt ist es möglich, zu sammeln, zu sezieren und Hirngewebe für mehrere FACS Sitzungen einzufrieren. Dies maximiert die Menge von Daten von wertvollen tierischen Subjekten erhalten, die oft schon lange und komplexe Verhaltensverfahren unterzogen.

Einleitung

Während des Lernens bilden Tiere Assoziationen zwischen komplexen Sätzen von hochspezifische Reize. Diese hochauflösende Informationen wird angenommen, dass durch Veränderungen in spezifischen Mustern von spärlich verteilten Neuronen genannt neuronalen Ensembles codiert werden. Neuronale Ensembles durch die Induktion von unmittelbar frühen Gene (IEGs) wie Fos, Arc und Zif268 und ihre Proteinprodukte in Neuronen identifiziert , die waren stark aktiviert während Verhalten oder Cue - Exposition vor kurzem wurde. Fos-exprimierenden Neuronen insbesondere gezeigt wurden ^1-4 kausalen Rollen in Zusammenhang und Cue spezifische erlernten Verhaltensweisen zu spielen. Somit einzigartige molekulare neuroadaptations innerhalb dieser aktivierten Fos-exprimierenden Neuronen sind Top - Kandidaten für die neuronalen Mechanismen, die die Verbände , während des normalen Lernen und abnormal Lernstörungen, wie Sucht und posttraumatische Belastungsstörung (PTSD) ⁵ gelernt kodieren.

fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) wurde Analyse von einzigartigen molekularen neuroadaptations in Fos-exprimierenden Neuronen vor kurzem erlaubt. Durchflusszytometrie und Zellsortierung wurden in den 1960er Jahren entwickelt ^6,7 zu charakterisieren und zu isolieren Zellen entsprechend ihrer Lichtstreuung und Immunfluoreszenz - Eigenschaften und sind seit langem in der Immunologie und Krebsforschung eingesetzt. fließen jedoch Zytometrie und FACS erfordert dissoziierten einzelne Zellen, die aus adulten Hirngewebe zu erhalten, sind schwierig. FACS wurde zuerst verwendet , Green Fluorescent Protein (GFP) exprimierenden striatalen Neuronen aus transgenen Mäusen zu isolieren und zu analysieren , die nicht mehr als ^8,9 Antikörpermarkierung erforderlich war. Wir entwickelten einen Antikörper-basierten FACS Methode ¹⁰ zu isolieren und molekularen Veränderungen bewerten in Neuronen , die durch Drogen aktiviert Fos-exprimierenden und / oder Hinweise in Wildtyp - Tiere ^15.11. In diesem Verfahren werden die Neuronen mit einem Antikörper gegen den neuronalen Marker NeuN allgemeinen bezeichnet, während Neuronen stark aktiviertenmit einem Antikörper gegen Fos markiert. Obwohl unsere ursprüngliche Methode Bündelung der erforderlichen bis zu 10 Ratten pro Probe für frisches Gewebe, spätere Änderungen des Protokolls erlaubt FACS Isolierung von Fos-exprimierenden Neuronen und quantitative Polymerase - Kettenreaktion (qPCR) Analyse einzelner Hirnareale von einer einzelnen Ratte ^13-15 . Insgesamt wurden einzigartige molekulare Veränderungen gefunden in Neuronen während einer Vielzahl von kontext- und Cue-aktivierte Verhalten in der Suchtforschung ^12,14,15 aktiviert Fos-exprimierenden.

Eine große logistische Problem mit der Durchführung FACS auf frischem Gewebe ist, dass es einen ganzen Tag dauert das Gewebe und Verfahren durch FACS zu distanzieren. Darüber hinaus können nur etwa vier Proben pro Tag verarbeitet werden. Dies bedeutet in der Regel, dass nur ein Bereich des Gehirns von jedem Gehirn beurteilt werden kann, und die verbleibenden Gehirnbereiche haben zu verwerfen. Dies ist ein großes Problem für geringen Durchsatz Verhaltens Verfahren wie Selbstverwaltung und vom Aussterben Training, die Chirurgie und viele Wochen intensives Training erfordert. Darüber hinaus macht lange und komplizierte Verhaltensverfahren auf Testtag schwierig es FACS am selben Tag durchzuführen. Es wäre ein erheblicher Vorteil sein, um die Gehirne von den Tieren nach der Verhaltenstests sofort einzufrieren und dann isolieren Fos-exprimierenden Neuronen aus einem oder mehreren Bereichen des Gehirns zu unterschiedlichen Zeiten des Wählens der Ermittler.

Hier zeigen wir, dass unser FACS-Protokoll verwendet werden können, Fos-exprimierenden Neuronen (und andere Zelltypen) zu isolieren sowohl von frischen und gefrorenen Gehirngewebe. Als Beispiel isolierten wir Neuronen aus Rattenstriatum nach akuter Methamphetamin Injektionen und von naiven Ratten ohne Injektionen (Steuerzustand) Fos-exprimierenden. Allerdings kann dieses FACS Protokoll nach jeder Verhaltens- oder pharmakologische Behandlung verwendet werden. Die anschließende qPCR Analyse unserer Proben zeigte, dass die Genexpression von diesen Zelltypen mit Simi bewertet werden konntelar Effizienz von frischem und gefrorenem Gewebe.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) der National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren ¹⁶ durchgeführt.

Hinweis: Alle Schritte unter Verwendung schwach bindende Zentrifugenröhrchen, die auf Eis gehalten wurden, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereitung vor dem Gewebeentnahme

1. Stellen Sie die Zentrifuge bis 4 ^o C.
2. Feuerpolitur ein Satz von drei Glaspasteurpipetten mit abnehmendem Durchmesser von ca. 1,3, 0,8 und 0,4 mm für jede Probe.
3. Bereiten Sie markierten 1,7 ml-Röhrchen mit 1 ml kaltem Puffer A und halten Sie die Röhrchen auf Eis.
4. Bereiten Sie einen Eisbehälter das Gehirn schneiden Matrix, Spachteln und Glasplatten (oder umgekehrt Glaspetrischale), auf dem mit dem Sezieren durchzuführen. Pre-Chill zwei oder mehr Rasierklingen auf den Glasplatten und die Verwendung Gewebe Papier alle Instrumente, um zu trocknen, die die t berührenProblem.
5. Auftauen Enzymlösung bei Raumtemperatur (RT) für 30 Minuten vor dem Gewebesammlung.

2. Gewebeentnahme und Dissection

1. Initiieren Sie die Verhaltens oder pharmakologische Behandlung 90 Minuten vor der Gewebesammlung.
   HINWEIS: Für die Ergebnisse hier, akute intraperitoneale Injektionen von 5 mg / kg Methamphetamin an Ratten in einer neuen Umgebung (Testbedingung) und naiven Ratten gehalten durchgeführt in ihre Käfige (Kontrollbedingung) wurden gezeigt.
2. Anesthetize die Ratte, indem sie in einem Glas Exsikkator Glas mit gesättigten Isofluran platzieren und köpfen die Ratte 30 - 60 sec später eine Guillotine mit.
   Mit einer Schere die Haut und Muskel aus dem Kopf zu entfernen und den Schädel aus. Verwenden Sie rongeurs den Schädel zu schneiden und zu öffnen, das Foramen magnum und entfernen Sie den hinteren Teil des Schädels. Verwenden Sie rongeurs entlang der oberen Kanten des Schädels zu schneiden, das Gehirn zu belichten. Achten Sie darauf, nicht das Gehirn zu beschädigen. Mit einem kleinen Spachtel vorsichtig unter eine Schaufeld das Gehirn erhöhen. Heben Sie das Gehirn und schneiden Sie die Nerven , bis das Gehirn ¹⁷ frei ist.
3. Präparieren Gewebe mit Rasierklingen.
   HINWEIS: Gewebeproben eine der folgenden Methoden erhalten werden: (2.3.1) frisch sezierten Gewebe; (2.3.2) gefrorene Gewebe nach der Sektion; oder (2.3.3) gefrorenes Gewebe aus gefrorenem ganze Gehirn seziert. Halten Sie das Gehirn Slicing Matrix, Rasierklingen und Glasplatte trocken in der gesamten Dissektion und Prozesse als kondensierte Wasser zerkleinern zu hypotone Lyse von Zellen führen kann. Verwenden Sie Lupen genaue Präparation zu gewährleisten.
   1. Für frisch sezierten Gewebe, legen Sie den frisch extrahierte Gehirn in ein Gehirn Slicing-Matrix (eine Rattenhirn-förmigen Metallform mit Schlitzen für die Rasierklingen in 1 mm Intervallen), die auf Eis gekühlt wurde. Legen Sie zwei oder mehr vorgekühlte Rasierklingen in die Schlitze koronalen Scheiben zu schneiden, die die Hirnregion (en) von Interesse enthalten. Platzieren Sie die Scheibe geschnitten auf der gekühlten Glasplatte.
      Hinweis: Präparieren Sie das Gehirn regions von Interesse auf einer gekühlten Glasplatte.
   2. Für gefrorene Gewebe nach der Sektion, sezieren die Hirnregion (en) von Interesse aus Scheiben frisch extrahierte Gehirn, ähnlich wie oben in 2.3.1 beschrieben. Platzieren Sie den sezierten Gewebe in ein Mikroröhrchen und schnell das Gewebe einzufrieren durch Untertauchen des microtube in -40 ºC Isopentan für 20 Sekunden. Halten Sie zu jeder Zeit eingefroren seziert Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank bis zur Weiterverarbeitung.
   3. Für gefrorene Gewebe, gefrieren sofort die frisch extrahierte Gehirn in -40 ºC Isopentan und lagern in einem verschlossenen Beutel bei -80 ºC für bis zu 6 Monaten.
      1. Am Tag der Dissektion, legen Sie das gefrorene Gehirn in einem Kryostaten bei etwa -20 ° C eingestellt (nicht wärmer als -18 ° C) für etwa 2 Stunden die Temperatur zu äquilibrieren.
         HINWEIS: Gehirne können bei dieser Temperatur leicht schneiden, während viel kühler Temperaturen das Gehirn zu spröde machen sicher geschnitten werden.
      2. Verwenden Sie Rasierklingen 1 zu schneiden - 2 mm koronalen Scheibendie gefrorenen Gehirne in einem Kryostaten. Verwenden Sie ein abgestumpft 12- bis 16-Gauge-Nadel Gewebe Schläge aus diesen Scheiben unter Frostbedingungen zu erhalten. Halten Sie zu jeder Zeit eingefroren seziert Gewebe bis zur Weiterverarbeitung.
4. Merken 1 - 2 Tropfen Puffer A die sezierten Gewebe zu bedecken vor dem Hacken. Entfernen der Großteil der weißen Substanz aus dem Gewebe unter Verwendung von zwei Rasierklingen während der Rest der Zerreibungsprozeß Verlust von Neuronen zu verhindern. Wenn mit gefrorenem Gewebe beginnen, lassen Sie dann das Gewebe auf der kalten Glasplatte auftauen für nicht mehr als 1 min vor Buffer Aufbringen einer Lösung.
5. Mince das Gewebe 100-mal in jeder orthogonalen Richtung mit einer Rasierklinge auf einer gekühlten Glasplatte. Halten Sie die Rasierklinge senkrecht auf die Glasplatte, wenn zerkleinern.
   HINWEIS: Gründliche Hacken- für alle Protokollschritte kritisch ist.
6. Verwenden Sie Rasierklingen das zerkleinerte Gewebe in Mikrozentrifugenröhrchen mit kaltem Puffer A mit 1 ml zu übertragen das Rohr 3 umkehren - 5 mal keep alle zerkleinerten Gewebes in die Lösung.

3. Zelldissoziationsmedium

HINWEIS: Verwenden Sie sanft über die Enden für alle folgenden Schritte. Verwenden Sie keinen Wirbelmischer verwenden und Luftblasen zu vermeiden, die Zellschäden verursachen.

1. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen bei 110 × g für 2 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen. Langsam 1 ml kaltem frisch aufgetauten Enzymlösung auf der Innenwand des Mikroröhrchens (eine Mischung aus proteolytischen Enzymen enthält). Sofort das gesamte Pellet saugen und sanft Pipette nach oben und unten nur 4-mal mit einem mäßig großen Spitzendurchmesser Pipette des zerkleinerten Gewebes Pellet zu zerstreuen.
2. Kehren Sie die Mikro - Röhrchen sofort das Pellet zu verhindern , dass auf dem Boden kleben und man die Proben mit End-Over-End - Mischen für 30 min bei 4 ^o C
3. Nach der enzymatischen Gewebe Verdauung, Zentrifuge die Röhrchen bei 960 g für 2 min bei 4 ºC. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 0,6 ml kaltem Puffer A immediately nach dem Puffer A hinzufügen, verwenden die gleiche Pipettenspitze das Pellet zu zerstreuen, indem das gesamte Pellet aufsaugt und sanft Pipette auf und ab 5 mal.
4. Mechanisch verreiben das verdaute Gewebe und in 15-ml-Röhrchen sammeln mit den folgenden Schritten. Für jede Probe einen separaten Satz von drei feuerpolierten Pasteur-Glaspipetten verwenden mit einem Durchmesser von etwa 1,3, 0,8 und 0,4 mm an Latex-Lampen absteigend.
   1. Sanft verreiben jede Probe 10-mal mit dem 1,3 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen (die Trümmer und undissoziierten Zellen am Boden absetzen). Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml) aufnehmen und in einem 15 ml konischen Röhrchen (Röhrchen # 1).
   2. Hinzufügen 0,6 ml einer Lösung für das verbleibende Pellet puffern. Man reibt die Probe 10 mal mit dem 0,8 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml) aufnehmen und in den gleichen 15 ml konischen Röhrchen # 1.
   3. Hinzufügen 0,6 ml einer Lösung für die restlichen Pelle Buffert. Man reibt die Probe 10 mal mit dem 0,4 mm Glaspipette. Lassen Sie die Probe für 2 Minuten auf Eis absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (~ 0,6 ml; ohne das Pellet mit nicht getrennten Zellen berühren) und übertragen auf den gleichen 15 ml konischen Röhrchen # 1.
      HINWEIS: Halten Sie den 0,4 mm Durchmesser Pipette in das Röhrchen # 1 für die folgenden Verreiben Schritte.
   4. Wiederholen Sie Schritt 3.4.3 drei weitere Male die kleinste Glaspipette (~ 0,4 mm Durchmesser), und sammeln Sie den Überstand in einen separaten 15 ml konischen Röhrchen (Röhrchen # 2).
   5. Man reibt die gesammelten Zellsuspensionen in Röhrchen # 1 und # 2 für 10 weitere Male die 0,4-mm-Glaspipette und halten auf dem Eis.

4. Zell Fixierung und Permeabilisierung

1. Bereiten Sie 4 Mikroröhrchen pro Probe (zwei Mikro - Röhrchen für Zellen , die aus Rohr # 1 und zwei für Zellen , die aus Rohr # 2) durch Zugabe von 800 ul 100% kaltem Ethanol in jedes Röhrchen (bei ​​-20 ^° C vor der Verwendung gelagert) und halten sie auf dem Eis . Hinweis: Die endgültige EthanolKonzentration wird 50% betragen.
2. Pipette ~ 800 & mgr; l der Zellsuspensionen (aus Rohr # 1 und # Rohr 2) in jedem der 4 Röhren kaltem Ethanol enthält, und die Rohre zu invertieren, um die Proben zu mischen.
3. Röhrchen auf Eis für 15 min, während die Röhren alle 5 min zu invertieren.
4. Nach der Fixierung / Permeabilisierung Zentrifuge die Röhrchen bei 1700 × g für 4 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Verlassen 50 ul Lösung Zellverlust zu verhindern.
   HINWEIS: Die Pellets in diesem Stadium sind weiß und haften weniger an der Wand der Rohre als vor Permeabilisierung. Daher entfernen Sie den Überstand vorsichtig durch die Wand des Mikroröhrchens zu berühren, wo es kein Pellet und der Überstand langsam mit einer Mikropipette erstellen.

5. Zell Filtration

1. Re-suspend die Pellets aus Schritt 4.4 mit kaltem PBS wie folgt:
   1. In 550 ul kaltem PBS auf eine der beiden Mikro-Röhrchen aus Rohr # 1 kommt, und verwenden Sie einen mäßig großen Durchmesser piPette Spitze zu pipettieren sanft die oben Zellsuspension und ab 5 mal. Wiederholen Sie das gleiche für ein Mikroröhrchen aus Rohr # 2 kommt.
   2. Für Zellen, die aus Rohr # 1, die gleiche Pipette, übertragen Sie die erste Zellsuspension in die zweite Pellet. Resuspendieren der zweiten Pellet durch sanft die kombinierte Zellsuspension bis Pipettieren und ab 5 mal.
   3. Für Zellen , die aus Rohr # 2, suspendieren und kombinieren die Pellets (dh dritten und vierten Mikro - Röhrchen) , wie in 5.1.2 beschrieben.
2. Filtern Sie die zwei Zellsuspensionen aus den Schritten 5.1.2 und 5.1.3 separat mit zwei verschiedenen Paaren von Zellsiebe (100 & mgr; m und 40 & mgr; m Porengröße) wie folgt:
   1. Vorbefeuchtenden jeder Zellsieb durch PBS an der Innenseite des Siebes hinzugefügt wird. Verwenden einer Pipette das überschüssige PBS von der Außenseite des Filters zu entfernen.
   2. Pipette, um die Zellsuspension aus Schritt 5.1.2 gleichmäßig auf die erste Zelle Sieb mit 100 & mgr; m Porengröße. Sammeln Sie die Flow-Through in einem 50 ml-Röhrchen auf Eis. Verwenden Sie die piPette die fließ zu sammeln durch an der Außenseite des unteren Zellsieb befestigt.
   3. Verwenden Sie die gleiche Pipette, um die Durchfluss von 100 & mgr; m Zellsieb auf die 40 & mgr; m Zellsieb zu übertragen. Sammeln Sie diese Durchfluss in einem anderen 50-ml-Röhrchen auf Eis. Wenn die Strömung der Übertragung durch 40 & mgr; m Zellsieb, ändern Spitzen neue Pipette Kontamination von 100 & mgr; m Zelle Sieb zu vermeiden.
   4. Wiederholen Sie diese Schritte für die Zellsuspension aus Schritt 5.1.3 eine neue Reihe von Filtern.
3. Verbinden die beiden Durchströmungs von jeder Probe auf ein Endvolumen von etwa 1 ml pro Probe.

6. Inkubation mit Antikörper

HINWEIS: Verwenden Sie kleine Teilmengen der Gehirnzellsuspensionen für die Festlegung geeigneter Durchflusszytometer Einstellungen auf die Führung der Hauptprobe vor mehreren Kontrollproben vorzubereiten. Für jede Antikörpermarkierung, Kontrollproben herzustellen, die keine Antikörper enthalten, nur die sedäre Antikörper (oder andere Fluoreszenzmarkierung), und dann werden beide primären und sekundären Antikörper (oder andere fluoreszierende Markierung). Verwenden Sie diese Steuerelemente, die Tore zu setzen, die im Durchflusszytometer im Vergleich zu nicht-spezifische Markierung spezifischen trennen. Wenn möglich, verwenden Sie Fluorochrome, die keine Entschädigung verlangen. Erhöhung um das Endvolumen der Gating-Kontrollproben auf ein Endvolumen von 700 & mgr; l von PBS vor Zugabe der primären Antikörper zu addieren.

1. Bereiten Lichtstreuung und DAPI Kontrollprobe durch eine 100 ul Probe der filtrierten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen übertragen. Hinzufügen, 600 & mgr; l kaltem PBS mit 1 & mgr; g / ml DAPI für Kerne Färbung. Inkubieren für 10 min mit end-over-end Mischen und wasche (wie in den Schritten 6.4.2 bis 6.4.5 dargestellt) vor Zytometer durch den Strömungs verläuft.
   Hinweis: Dieses Beispiel nur dann verwendet wird, um die Zelle / Kerne Tor vor der Sortierung der verbleibenden Zellen in der FACS-Maschine einzustellen.
2. Bereiten Sie einzelne immunKontrollProben durch die Übertragung von 100 & #181; l der filtrierten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen. In 600 ul kaltem PBS mit einem Antikörper (zB NeuN Antikörper). Hinzufügen , 600 & mgr; l kaltem PBS zu einem Mikroröhrchen mit einem anderen Antikörper (beispielsweise Fos - Antikörper). Fügen Sie die entsprechenden sekundären Antikörper, wenn es nicht eine direkte konjugierte primäre Antikörper ist.
   ANMERKUNG: Diese Proben werden verwendet, um die entsprechenden Fotovervielfacherröhre (PMT) Spannung zu bestimmen, und die Überlappung der beiden Fluoreszenzsignale bei Bedarf zu beurteilen. Antikörperkonzentrationen sollte das beste Signal-Rausch-Verhältnisse in allen Kanälen zu erreichen, titriert werden. Lappenden Fluoreszenzsignale können auch durch interne Kalibrierung unterschiedlicher Fluoreszenzkanäle innerhalb des Durchflusszytometers kompensiert werden.
3. Bereiten Sie doppelt fluoreszenzmarkierten negativen Kontrollprobe durch die Übertragung von 100 ul der gefilterten Zellen zu einem 1,7 ml Mikroröhrchen. In 600 ul kaltem PBS mit den sekundären Antikörper alleine oder IgG Direkt konjugierte primäre Antikörper.
   HINWEIS: This Kontrollprobe kann jedes Mal, bevor die Sortierung verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz für jedes Fluorophor zu bestimmen.
4. Bereiten Hauptprobe sortiert werden.
   1. Übertragung von 700 & mgr; l der filtrierten Zellen in einem 1,7 ml Mikroröhrchen. ADD 7 ul (1: 100) des primären Antikörpers konjugiert Fos direkt an Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) und 1,4 ul (1: 500) der primären NeuN Antikörper konjugiert direkt an Phycoerythrin (anti-NeuN-PE). Die Röhrchen für 30 min bei 4 ºC mit end-over-end Mischen.
   2. Am Ende der Inkubation fügen 800 ul kaltem PBS in jedes Mikroröhrchen, einschließlich der Hauptprobe und die Kontrollproben und durch Umdrehen gemischt.
   3. Zentrifuge Mikro-Röhrchen bei 1300 × g für 3 min bei 4 ºC. Überstand verwerfen, 50 & mgr; l Überstand zu verlassen Zellverlust zu verhindern.
   4. 1 ml kaltem PBS zu dem Pellet und resuspendieren Zellen mit einer Pipette mit einem mäßig großen Spitzendurchmesser verwendet wird.
   5. Zentrifuge bei 1300 × g für 3 min bei 4 ºC. Discard den Überstand.
   6. Resuspendieren des Pellets in 500 ul kaltem PBS (Endvolumen einstellen Abhängigkeit der Größe des Pellets).
   7. Übertragung und filtern Sie die Suspension in einen Rundboden FACS Probenröhrchen mit einer Zelle Sieb Kappe (40 & mgr; m). Halten Sie die immun Zellen auf Eis und sofort FACS durchführen. Hinweis: Für die Filterung, berühren Sie die Pipettenspitze senkrecht auf dem Sieb Kappe und drücken Sie die Zellsuspension durch.
5. Stellen Sie Durchflusszytometer Tore Kontrollproben.
   1. Verwenden Sie die Lichtstreuung und DAPI Kontrollprobe, die neuronale Zellpopulation von den gesamten Ereignisse und Zelltrümmer zu identifizieren.
      HINWEIS: Zellkörper in diesem Präparat sind nur 1 bis 2% der gesamten Ereignisse (der Rest sind Schutt und Bruch zelluläre Prozesse). Basierend auf DAPI Fluoreszenzsignal (was anzeigt, Kerne) und Vorwärtsstreuung (Größe der Zelle) ist es möglich, Zellkörper und Tor nach hinten auf der Vorder- und Seitenlichtstreuungseigenschaften von der Basis lokalisierendie Zellen (wie in Figur 1 A, B gezeigt).
   2. Verwenden Sie die einzelnen immunKontrollProben die PMT Spannungseinstellungen , um zu bestimmen, und von einem spezifischen Fluorochrom in einen anderen Filter / Kanal (zB Alexa Fluor 488 / FITC oder Phycoerythrin) Schwappen Emission zu analysieren. Wenn Fluoreszenzsignale überlappen, korrigieren Sie die Überlappung von Kompensationsstufen manuell eingestellt werden.
   3. Verwenden Sie die Doppelfluoreszenzmarkierte Negativkontrolle den Grenzwert für die positive Bevölkerung einzurichten.
      HINWEIS: Das Signal von dieser Probe kommt, wird gedacht, um Autofluoreszenz und die Zellen der Hauptprobe über dieser Schwelle liegt aufgrund sein kann als positiv betrachtet werden. Typischerweise werden die Schwellenparameter für die Sortierung strengerer und ungefähr die oberen zwei Drittel der markierten Zellen über der Negativkontrolle tatsächlich sortiert.
6. Sortieren Sie die Neuronen, die aus der Hauptprobe durch FACS in 1,7 ml Mikroröhrchen. Sammeln Sie die Zellen in 50 ul RNAExtraktionspuffer. Nach dem Sortieren, Wirbel und Zentrifuge das Rohr und die Suspension mischen durch Pipettieren nach oben und unten 10-mal alle sortierten Zellen von den Wänden des Rohres zu erholen.
7. Inkubieren der sortierten Zellsuspension bei 42 ºC für 30 min, um sicherzustellen, dass alle Zellen vor der RNA-Extraktion lysiert werden, und dann bei 2.800 × g für 2 min bei 4 ºC zentrifugiert.
8. Den Überstand auf ein RNase-freies Röhrchen für die Langzeitlagerung bei -80 ºC oder unmittelbar verarbeiten , um die Probe für die RNA - Isolierung, cDNA - Synthese, Zielgen Vorverstärkung und qPCR, wie zuvor ^13-15 beschrieben.

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Ergebnisse

Sortierung Fos-positive und Fos-negativen Neuronen aus frischen und gefrorenen dorsalen Striatum Gewebe aus einzelnen Ratten nach akuter Methamphetamin Injektionen.

Die oben beschriebenen Protokoll wurde verwendet, Fos-positiven und Fos-negativer Neuronen von einer einzigen Ratte dorsalen Striatum 90 Minuten nach einer intraperitonealen Injektion von Methamphetamin zu sortieren (5 mg / kg). Naïve Ratten in ihre Käfige wurden...

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Diskussion

FACS verwendet werden Neuronen zu sortieren und andere Zelltypen entweder frisch oder gefroren adult Hirngewebe. Wie in der Einleitung erwähnt, ermöglicht die Fähigkeit, gefrorene Gewebe zu verwenden, eine optimale Nutzung von Proben von Tieren, die komplexe und langwierige Verhaltensverfahren, wie zum Beispiel Selbstverwaltung und Rückfall-Studien in der Suchtforschung unterzogen wurden. Diese Verhaltensverfahren dauert in der Regel 1 bis 2 Stunden oder länger, und verlangen , dass alle Tiere (10 - 20 insgesamt) a...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain matrix	CellPoint Scientific	69-2160-1	to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescence	Brain Bits	HA-lf	Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
Accutase	Millipore	SCR005	Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340	to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µm	BD Falcon	352360	to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, Glass	NIH supply	6640-00-782-6008	to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody	EMD Millipore	FCMAB317PE	antibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Cell Signaling Technology	8677	antibody to detect Fos-expressing cells
DAPI	Sigma	D8417	to label nuclei
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis system	Invitrogen	18080-051	to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Applied Biosystems.	4444963	to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primer	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	nucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probe	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primer	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettor	Rainin	17014382	It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR system	Applied Biosystems.	446985	for quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		for FACS sorting