Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale

Riepilogo

Qui vi presentiamo una Sorting (FACS) protocollo Fluorescence Activated cellulare per studiare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo ensemble neuronali dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. L'uso di tessuti congelati permette FACS isolamento di molte aree cerebrali in più sessioni per massimizzare l'uso di soggetti animali preziosi.

Abstract

Lo studio della neuroplasticità e alterazioni molecolari in comportamenti appresi sta passando dallo studio di regioni cerebrali intere allo studio di specifici gruppi di neuroni attivati ​​scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali che mediano imparato associazioni. La fluorescenza delle cellule Attivato ordinamento (FACS) è stato recentemente ottimizzato per tessuti adulti cervello di ratto e ha permesso l'isolamento dei neuroni attivati ​​utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale NeuN e proteine ​​Fos, un marker di neuroni fortemente attivati. Fino ad ora, i neuroni Fos-esprimere e altri tipi di cellule sono state isolate dal tessuto fresco, che ha comportato lunghi giorni di lavorazione e consentite un numero molto limitato di campioni di cervello per essere valutati dopo le procedure comportamentali lunghe e complesse. Qui abbiamo trovato che i rendimenti di Fos-esprimendo neuroni e Fos mRNA da dorsale striato sono stati simili tra tessuto fresco sezionato e tessuti congelati a -80 ° C per 3 - 21 giorni. Inoltre, abbiamo confermato il fenotipodelle cellule NeuN-positivi e NeuN-negativi ordinate per valutare l'espressione genica di neuronale (NeuN), astrociti (GFAP), oligodendrocitario (Oligo2) e microgial marcatori (Iba1), il che indica che il tessuto congelato può essere utilizzato anche per FACS isolamento tipi di cellule gliali. In generale, è possibile raccogliere, analizzare e congelare il tessuto cerebrale per le sessioni multiple FACS. Questo massimizza la quantità di dati ottenuti da soggetti animali importanti che sono spesso sottoposti a procedure comportamentali lunghe e complesse.

Introduzione

Durante l'apprendimento, gli animali formano associazioni tra insiemi complessi di stimoli altamente specifici. Queste informazioni ad alta risoluzione è pensato per essere codificato da alterazioni all'interno di modelli specifici di neuroni scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali. Ensemble neuronali sono stati recentemente identificati dalla induzione di immediatamente primi geni (IEGs) come Fos, Arco, e Zif268 e dei loro prodotti proteici nei neuroni che sono stati fortemente attivati ​​durante il comportamento o l'esposizione stecca. Fos-esprimendo neuroni, in particolare, hanno dimostrato di giocare un ruolo causale nel contesto e comportamenti appresi ^1-4 specifici stecca. Così, neuroadaptations molecolari unici all'interno di questi neuroni Fos-esprimono attivati ​​sono migliori candidati per i meccanismi neurali che codificano apprese le associazioni costituite durante il normale disturbi di apprendimento e di formazione anomala, come la dipendenza e disturbi da stress post-traumatico (PTSD) ^5.

Fluorescence attivato cell sorting (FACS) ha recentemente permesso l'analisi di neuroadaptations molecolari unici all'interno dei neuroni Fos-esprimono. Citometria a flusso e cell sorting sono stati sviluppati nel 1960 ^6,7 per caratterizzare e isolare le cellule in base alle loro caratteristiche di luce-dispersione e immunofluorescenza, e sono da tempo utilizzati in immunologia e la ricerca sul cancro. Tuttavia citometria a flusso e FACS richiede singole cellule dissociate che sono difficili da ottenere da tessuto cerebrale adulta. FACS è stato usato per la prima per isolare e analizzare Green Fluorescent Protein (GFP) esprimente neuroni striatali dei topi transgenici che non richiedono l'etichettatura degli anticorpi ^8,9. Abbiamo sviluppato un metodo FACS a base di anticorpi ¹⁰ per isolare e valutare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo neuroni attivati ​​da farmaci e / o spunti in animali wild-type ^11-15. In questo metodo, i neuroni sono etichettati con un anticorpo contro il marcatore neuronale generale NeuN, mentre i neuroni iperattivazionesono etichettati con un anticorpo contro Fos. Anche se il nostro metodo iniziale richiesto messa in comune di un massimo di 10 ratti per campione di tessuto fresco, successive modifiche del protocollo ha permesso FACS isolamento di Fos-esprimendo neuroni e della polimerasi quantitativa Chain Reaction (qPCR) analisi delle aree cerebrali distinte da un singolo topo ^13-15 . Nel complesso, alterazioni molecolari unici sono stati trovati in Fos-esprimendo neuroni attivati ​​nel corso di una serie di comportamenti al contesto e cue-attivati ​​nella ricerca dipendenza ^12,14,15.

Un importante problema logistico con l'esecuzione di FACS sul tessuto fresco è che ci vuole un giorno intero per dissociare il tessuto e il processo da FACS. Inoltre, solo circa quattro campioni possono essere processati al giorno. Questo di solito significa che solo una zona del cervello può essere valutata da ciascun cervello e le zone del cervello rimanenti devono essere scartati. Questo è un grave problema per le procedure comportamentali basso throughput come l'auto-somministrazione e l'estinzione training che richiede un intervento chirurgico e molte settimane di allenamento intensivo. Inoltre, le procedure comportamentali lunghe e complicate giornata di test rende difficile eseguire FACS lo stesso giorno. Sarebbe un vantaggio significativo per essere in grado di congelare il cervello dagli animali subito dopo test comportamentali, e quindi isolare i neuroni Fos-esprimono da una o più aree cerebrali in diversi momenti della scelta degli investigatori.

Qui dimostriamo che il nostro protocollo FACS può essere utilizzato per isolare i neuroni Fos-esprimono (e altri tipi di cellule) dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. A titolo di esempio, abbiamo isolato Fos-esprimendo neuroni da striato di ratto dopo le iniezioni di metanfetamina acute e da ratti naive senza iniezioni (condizione di controllo). Tuttavia, questo protocollo FACS può essere utilizzato dopo ogni trattamento comportamentale o farmacologica. La successiva analisi qPCR dei nostri campioni indicato che l'espressione del gene da questi tipi di cellule potrebbe essere valutata con Simiefficienza lar da tessuti sia freschi che surgelati.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato Cura e uso istituzionale animali (IACUC) dei National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio ^16.

Nota: Tutti i passi sotto tubi di scarso utilizzo vincolante centrifuga che sono stati tenuti in ghiaccio se non diversamente specificato.

1. Preparazione alla Tissue Collection

1. Impostare la centrifuga a 4 ^° C.
2. Fuoco smalto un insieme di tre pipette Pasteur in vetro con decreasing diametri di circa 1,3, 0,8, e 0,4 mm per ogni campione.
3. Preparare etichettati 1,7 ml-provette contenenti 1 ml freddo tampone A e tenere i tubi in ghiaccio.
4. Preparare un vassoio di ghiaccio che contiene il cervello affettare matrice, spatole e lastre di vetro (o invertita vetro capsula di Petri) su cui eseguire la dissezione. Pre-freddo a due o più lame di rasoio sulla carta lastre di vetro e l'uso dei tessuti a secco tutti gli strumenti che toccano il tproblema.
5. Scongelare la soluzione enzimatica a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima della raccolta del tessuto.

2. Tessuto Collection e la dissezione

1. Avviare la comportamentale o farmacologica trattamento 90 minuti prima della raccolta del tessuto.
   NOTA: Per i risultati mostrati qui, iniezioni intraperitoneali acuti di 5 mg / kg di metanfetamine su ratti in un ambiente romanzo (condizione di prova) e ratti naive tenuti nelle gabbie casa (condizione di controllo) sono state eseguite.
2. Anestetizzare il topo ponendolo in un barattolo di vetro con essiccatore isoflurano saturi e decapitare il topo 30-60 secondi più tardi con una ghigliottina.
   Utilizzare forbici per rimuovere la pelle ei muscoli dalla testa ed esporre il cranio. Utilizzare rongeurs per tagliare il cranio e aprire il foro occipitale e rimuovere la parte posteriore del cranio. Utilizzare rongeurs per tagliare lungo i bordi superiori del cranio per esporre il cervello. Fare attenzione a non danneggiare il cervello. Utilizzare una piccola spatola per raccogliere delicatamente sotto und elevare il cervello. Sollevare il cervello e tagliare i nervi fino a quando il cervello è libero ^17.
3. Sezionare il tessuto usando lame di rasoio.
   NOTA: Ottenere campioni di tessuto utilizzando uno dei seguenti metodi: (2.3.1) del tessuto fresco sezionato; (2.3.2) tessuti congelati dopo la dissezione; o (2.3.3) del tessuto congelato sezionato dal congelato tutto il cervello. Mantenere la matrice affettare cervello, lamette e lastra di vetro secco per la dissezione e tritare processi come l'acqua condensata può portare a lisi ipotonico delle cellule. Utilizzare lenti di ingrandimento per garantire la dissezione accurata.
   1. Per il tessuto fresco sezionato, posizionare il cervello appena estratto in una matrice affettatura cerebrale (uno stampo metallico a forma di cervello di ratto con slot per le lamette a intervalli di 1 mm) che è stato raffreddato su ghiaccio. Inserire due o più lame di rasoio pre-refrigerati negli slot per tagliare fette coronali che contengono la regione del cervello (s) di interesse. Posizionare la fetta tagliata sulla lastra di vetro freddo.
      Nota: sezionare il cervello regions di interesse su una lastra di vetro freddo.
   2. Per tessuti congelati dopo la dissezione, sezionare la regione del cervello (s) di interesse da fette di cervello appena estratta, simile a quello sopra descritto in 2.3.1. Posizionare il tessuto sezionato in una provetta e rapidamente congelare il tessuto immergendo la microprovetta in -40 ° C isopentano per 20 sec. Mantenere tessuto sezionato congelato in ogni momento in una ºC freezer -80 fino al procedimento.
   3. Per tessuti congelati, congelare immediatamente il cervello appena estratto in -40 ° C isopentano e conservare in un sacchetto sigillato a -80 ° C per un massimo di 6 mesi.
      1. Il giorno della dissezione, posizionare il cervello congelato in un criostato settato a circa -20 ° C (non più caldo di -18 ° C) per circa 2 ore per equilibrare la temperatura.
         NOTA: Cervelli possono essere facilmente tagliati a questa temperatura, mentre le temperature più fresche rendono il cervello troppo fragile da tagliare in modo sicuro.
      2. Utilizzare lame di rasoio per tagliare 1 - 2 mm fette coronali diil cervello congelato in un criostato. Utilizzare un ago 12 a 16-gauge smussato per ottenere punzoni di tessuto da queste fette in condizioni di congelamento. Mantenere il tessuto sezionato congelato in ogni momento fino al procedimento.
4. Aggiungere 1 - 2 gocce di tampone A per coprire il tessuto sezionato prima della macinazione. Rimuovere la maggior parte della sostanza bianca dal tessuto utilizzando due lame di rasoio per evitare la perdita di neuroni durante il resto del processo di triturazione. Se iniziano tessuto congelato, quindi consentire il tessuto scongelare sulla lastra di vetro freddo per non più di 1 min prima di applicare tampone A soluzione.
5. Tritare il tessuto 100 volte in ogni direzione ortogonale con una lama di rasoio su una lastra di vetro refrigerati. Tenere la lametta verticale alla piastra di vetro quando macinazione.
   NOTA: macinazione approfondita è fondamentale per tutte le fasi del protocollo.
6. Utilizzare lame di rasoio per trasferire il tessuto tritato in provette da microcentrifuga contenente 1 ml di tampone a freddo A. Invertire il tubo 3 - 5 volte a keep tutto il tessuto tritato nella soluzione.

3. cellulare Dissociazione

NOTA: L'uso delicato su se stesso miscelazione per tutti i seguenti passaggi. Non utilizzare un vortex e di evitare bolle d'aria che causano danni alle cellule.

1. Centrifugare le provette dei campioni a 110 xg per 2 minuti a 4 ° C. surnatante degli scarti. Lentamente aggiungere 1 ml di soluzione di enzima appena scongelati fredda (contenente una miscela di enzimi proteolitici) lungo la parete interna della provetta. Immediatamente succhiare tutto il pellet e delicatamente pipetta su e giù solo 4 volte con una pipetta moderatamente grande diametro punta per disperdere il precipitato di tessuto tritato.
2. Invertire immediatamente i microtubi per evitare il pellet di attaccarsi al fondo e incubare i campioni con miscelazione end-over-end per 30 min a 4 ^° C.
3. Dopo la digestione enzimatica del tessuto, centrifugare le provette a 960 xg per 2 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aggiungere 0,6 ml di freddo tampone A. immediately dopo l'aggiunta del tampone A, utilizzare la stessa punta della pipetta per disperdere il pellet risucchiando tutto il pellet e delicatamente pipetta su e giù per 5 volte.
4. Meccanicamente triturare il tessuto digerito e raccogliere in provette da 15 ml utilizzando le seguenti operazioni. Per ogni campione, utilizzare un insieme separato di 3 pipette Pasteur di vetro incendio lucidato con decrescente diametri di circa 1,3, 0,8 e 0,4 mm attaccati alle lampadine di lattice.
   1. Delicatamente triturare ogni campione per 10 volte con la pipetta di vetro 1,3 millimetri. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 minuti sul ghiaccio (i detriti e le cellule indissociate si depositerà sul fondo). Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e trasferimento in un tubo da 15 ml (tubo # 1).
   2. Aggiungere 0,6 ml di tampone A soluzione al pellet rimanente. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro e 0,8 mm. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 min in ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml) e il trasferimento agli stessi tubo da 15 ml # 1.
   3. Aggiungere 0,6 ml di tampone Una soluzione alla pelle rimanentit. Triturare il campione 10 volte con la pipetta di vetro 0,4 mm. Lasciate che il campione accontentarsi di 2 min in ghiaccio. Raccogliere il surnatante (~ 0,6 ml; senza toccare il pellet con le cellule non dissociati) e trasferire agli stessi 15 tubo conico # 1 ml.
      NOTA: Mantenere il diametro pipetta 0,4 millimetri nel tubo # 1 per le seguenti operazioni triturazione.
   4. Ripetere il punto 3.4.3 altre tre volte utilizzando la più piccola pipetta di vetro (~ 0,4 millimetri di diametro), e raccogliere il surnatante in un tubo conico separati 15 ml (tubo # 2).
   5. Triturare le sospensioni cellulari raccolti in tubi # 1 e # 2 per ulteriori 10 volte usando la pipetta di vetro 0,4 millimetri e tenere in ghiaccio.

4. cellulare Fissazione e permeabilizzazione

1. Preparare 4 microtubi per campione (due microtubi per le cellule dal tubo # 1 e due per le cellule da tubo # 2) con l'aggiunta di 800 ml di etanolo al 100% freddo (conservati a -20 ^° C prima dell'uso) in ogni provetta e tenerli in ghiaccio . Nota: L'etanolo finaleconcentrazione sarà 50%.
2. Pipettare ~ 800 ml di sospensioni cellulari (dal tubo # 1 e tubo # 2) in ciascuna delle 4 provette contenenti etanolo freddo e invertire i tubi per mescolare i campioni.
3. Incubare le provette in ghiaccio per 15 minuti, mentre invertendo i tubi ogni 5 minuti.
4. Dopo la fissazione / permeabilizzazione, centrifugare le provette a 1.700 xg per 4 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante. Lasciare 50 ml di soluzione per evitare la perdita di cellule.
   NOTA: I pellet in questa fase sono bianchi e bastone meno alla parete dei tubi di prima permeabilizzazione. Pertanto, rimuovere il supernatante attentamente toccando la parete della provetta dove non c'è pellet e redige il surnatante lentamente con una micropipetta.

5. cellulare Filtrazione

1. Risospendere il pellet dal punto 4.4 con PBS freddo come segue:
   1. Aggiungere 550 pl di PBS freddo ad uno dei due microtubi provenienti dal tubo # 1, e utilizzare un moderatamente grande diametro piPette punta di pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per 5 volte. Ripetere la stessa per una provetta proveniente dal tubo # 2.
   2. Per le cellule dal tubo # 1, utilizzando la stessa pipetta, la prima sospensione cellulare al secondo pellet. Risospendere il secondo pellet pipettando delicatamente il combinato sospensione cellulare su e giù per 5 volte.
   3. Per le cellule dal tubo # 2, risospendere e combinare i pellet (vale a dire, terzo e quarto microtubi), come descritto in 5.1.2.
2. Filtrare le due sospensioni cellulari da passi 5.1.2 e 5.1.3 separatamente utilizzando due diverse coppie di filtri cellulari (100 micron e 40 micron dimensioni dei pori) come segue:
   1. Pre-umidi ciascuna colino cella aggiungendo PBS all'interno del filtro. Utilizzare una pipetta per rimuovere l'eccesso di PBS dall'esterno del filtro.
   2. Pipetta la sospensione cellulare dal punto 5.1.2 in modo uniforme sulla prima colino cella con 100 micron dimensione dei pori. Raccogliere il flusso continuo in un tubo da 50 ml su ghiaccio. Utilizzare il pi grecopipetta per raccogliere il flusso continuo attaccata sul fondo lato esterno del filtro cella.
   3. Utilizzare la stessa pipetta per trasferire il flusso continuo dal filtro delle cellule 100 micron per il filtro cella di 40 micron. Raccogliere questo flusso passante in un altro tubo 50 ml su ghiaccio. Quando si trasferisce il flusso attraverso di 40 micron colino cella, cambiare per nuove punte per pipette per evitare la contaminazione da 100 micron colino cella.
   4. Ripetere questi passaggi per la sospensione cellulare dal punto 5.1.3 utilizzando una nuova serie di filtri.
3. Combinare i due flusso continuo di ogni campione per un volume finale di circa 1 ml per campione.

6. Incubazione con anticorpi

NOTA: utilizzare piccole aliquote delle sospensioni delle cellule cerebrali per preparare più campioni di controllo per la regolazione del flusso adeguato citometro impostazioni prima di eseguire l'esempio principale. Per ogni etichettatura degli anticorpi, preparare campioni di controllo che includono anticorpi, solo la SEanticorpo condary (o altra etichetta fluorescente), e quindi entrambi gli anticorpi primari e secondari (o altra etichetta fluorescente). Utilizzare questi controlli per impostare le porte che separano specifico contro l'etichettatura non specifico nel citometro di flusso. Se possibile, utilizzare fluorocromi che non richiedono un risarcimento. Aumentare il volume finale dei campioni di controllo gating ad un volume finale di 700 microlitri aggiungendo PBS prima di aggiungere gli anticorpi primari.

1. Preparare luce-dispersione e campione di controllo DAPI con il trasferimento di un campione di 100 ml di cellule filtrata in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con 1 mg / ml DAPI per la colorazione dei nuclei. Incubare per 10 minuti con miscelazione end-over-end, e lavare (come indicato nei passaggi 6.4.2 a 6.4.5) prima di passare attraverso il citofluorimetro.
   Nota: questo esempio viene utilizzato solo per impostare il / nuclei di gate di cella prima di ordinare le cellule rimanenti nella macchina FACS.
2. Preparare singoli campioni di controllo immunolabeled trasferendo 100 & #181; l delle cellule filtrate in un provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con un anticorpo (ad esempio, anticorpi NeuN). Aggiungere 600 pl di PBS freddo ad una microprovetta con un altro anticorpo (ad esempio, anticorpi Fos). Aggiungere il corrispondente anticorpo secondario se non è un anticorpo primario diretta coniugato.
   NOTA: Questi campioni vengono utilizzati per determinare la tensione del tubo fotomoltiplicatore appropriata (PMT), e di valutare la sovrapposizione dei due segnali fluorescenti se necessario. Le concentrazioni anticorpali devono essere titolati per ottenere i migliori rapporti segnale-rumore in tutti i canali. segnali fluorescenti sovrapposte possono essere compensate con taratura interna dei canali fluorescenti diverse all'interno del citofluorimetro.
3. Preparare campione di controllo negativo con marcatore fluorescente doppio trasferendo 100 ml di cellule filtrata in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 600 ml di PBS freddo con i soli anticorpi secondari o IgG anticorpi primari diretta-coniugati.
   NOTA: Thicampione di controllo s può essere utilizzato ogni volta prima di ordinare per determinare la fluorescenza di sfondo per ogni fluoroforo.
4. Preparare campione principale da ordinare.
   1. Trasferire 700 microlitri di cellule filtrati in una provetta 1,7 ml. Aggiungere 7 ml (1: 100) di anticorpo primario Fos coniugato direttamente Alexa Fluor 647 (anti-Fos-AF647) e 1,4 ml (1: 500) di anticorpo primario NeuN coniugato direttamente ficoeritrina (anti-NeuN-PE). Incubare le provette per 30 minuti a 4 ° C con miscelazione end-over-end.
   2. Al termine dell'incubazione, aggiungere 800 ml di PBS freddo ad ogni microprovetta, compreso il campione principale e campioni di controllo, e mescolare per inversione.
   3. microtubi centrifugare a 1.300 xg per 3 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante, lasciando 50 surnatante ml per prevenire la perdita di cellule.
   4. Aggiungere 1 ml di PBS freddo alle cellule pellet e risospendere con una pipetta con un moderatamente grande diametro della punta.
   5. Centrifugare a 1.300 xg per 3 minuti a 4 ° C. Discard il surnatante.
   6. Risospendere il pellet in 500 ml PBS freddo (regolare il volume finale a seconda delle dimensioni del pellet).
   7. Trasferimento e filtrare la sospensione in un tubo a fondo rotondo campione FACS con un tappo colino cella (40 micron). Mantenere le cellule immunolabeled sul ghiaccio ed eseguire immediatamente FACS. Nota: Per il filtraggio, toccare la punta della pipetta verticalmente sul tappo filtro e spingere la sospensione cellulare attraverso di essa.
5. Impostare citofluorimetro cancelli utilizzando campioni di controllo.
   1. Utilizzare la luce-dispersione e campione di controllo DAPI per identificare la popolazione di cellule neuronali dal totale eventi e detriti cellulari.
      NOTA: corpi cellulari in questa preparazione sono solo 1-2% degli eventi totali (il resto sono detriti e processi cellulari rotti). Sulla base del segnale DAPI fluorescente (indicando nuclei) e dispersione Forward (dimensione della cella) è possibile localizzare corpi cellulari e cancello all'indietro basati sulla avanti e laterale proprietà della luce scatteringle cellule (come mostrato in Figura 1 A, B).
   2. Utilizzare i singoli campioni di controllo immunolabeled per determinare le impostazioni di tensione PMT, e di analizzare spillover di emissioni da un fluorocromo specifico in un altro filtro / canale (ad esempio, Alexa Fluor 488 / FITC o Phycoerythrine). Se i segnali fluorescenti si sovrappongono, correggere la sovrapposizione regolando i livelli di compensazione manualmente.
   3. Utilizzare il doppio controllo negativo con marcatore fluorescente per impostare la soglia per la popolazione positiva.
      NOTA: Il segnale proveniente da questo campione è pensato per essere causa di auto-fluorescenza e le cellule del campione principale si trova sopra di questa soglia può essere considerata positiva. In genere, i parametri di soglia per l'ordinamento sono più severe e circa la parte superiore 2/3 delle cellule marcate al di sopra del controllo negativo sono in realtà ordinato.
6. Ordinare i neuroni del campione principale da FACS in 1,7 ml microtubi. Raccogliere le cellule in 50 ml di RNAtampone di estrazione. Dopo la cernita, vortex e centrifugare la provetta e miscelare la sospensione pipettando su e giù per 10 volte per recuperare tutte le cellule filtrate dalle pareti del tubo.
7. Incubare la sospensione cellulare ordinata a 42 ° C per 30 minuti per garantire che tutte le cellule sono lisate prima dell'estrazione RNA, e quindi si centrifuga a 2800 xg per 2 minuti a 4 ° C.
8. Trasferire il surnatante in una provetta RNasi-free per la conservazione a lungo termine a -80 ° C o immediatamente elaborare il campione per l'isolamento di RNA, la sintesi del DNA, geni bersaglio di pre-amplificazione e qPCR, come descritto in precedenza ^13-15.

Risultati

Ordinamento neuroni Fos-positivi e Fos-negativi dal tessuto striato dorsale freschi e congelati da singoli ratti dopo le iniezioni di metanfetamina acute.

Il protocollo descritto sopra è stato usato per ordinare neuroni Fos-positivi e Fos-negativi da un singolo ratto striato dorsale 90 min dopo l'iniezione intraperitoneale di metamfetamina (5 mg / kg). ratti naive nelle loro gabbie a casa sono stati utilizzati come contro...

Discussione

FACS possono essere utilizzati per ordinare neuroni e altri tipi di cellule provenienti da tessuti adulti o cerebrale fresco o congelato. Come accennato nell'introduzione, la possibilità di utilizzare tessuti congelati consente un utilizzo ottimale di campioni da animali che sono stati sottoposti a procedure comportamentali complesse e prolungate, quali studi di auto-amministrazione e di ricaduta nella ricerca tossicodipendenza. Queste procedure comportamentali richiede solitamente 1-2 ore o più a lungo, e richied...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain matrix	CellPoint Scientific	69-2160-1	to obtain coronal brain slices
Hibernate A low fluorescence	Brain Bits	HA-lf	Buffer A in the protocol is used for processing tissue and cells from the dissociation to fixation steps
Accutase	Millipore	SCR005	Enzyme solution in the protocol is used for enzymatic digestion of tissue prior to trituration
Protein LoBind Tube 1.5 ml, PCR clean	Eppendorf	22431081	to prevent cell lost during the protocol
Cell Strainer, 40 µm	BD Falcon	352340	to filter cell suspension
Cell Strainer, 100 µm	BD Falcon	352360	to filter cell suspension
Falcon 5 ml round-bottom polystyrene test tube with cell strainer snap cap	BD Bioscience	352235	to filter cell suspension before passing though the flow cytometer
Pasteur Pipet, Glass	NIH supply	6640-00-782-6008	to do tissue trituration
Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (mouse monoclonal) antibody	EMD Millipore	FCMAB317PE	antibody to detect neurons
Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate)	Cell Signaling Technology	8677	antibody to detect Fos-expressing cells
DAPI	Sigma	D8417	to label nuclei
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems.	KIT0204	The kit includes the RNA extraction buffer for step 6.14. It is used to collect sorted cells
Superscript III first strand cDNA synthesis system	Invitrogen	18080-051	to synthesize cDNA from RNA
TaqMan PreAmp Master Mix	Applied Biosystems.	4391128	to do targeted-preamplification from cDNA
TaqMan Advance Fast Master	Applied Biosystems.	4444963	to do PCR using TaqMan probes
Fos TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00487426_g1	TaqMan probe/primers
NeuN TaqMan probe	Applied Biosystems.	CACTCCAACAGCGTGAC	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Forward primer	Applied Biosystems.	GGCCCCTGGCAGAAAGTAG	nucleotide sequence for neuronal gene marker
NeuN Reverse primer	Applied Biosystems.	TTCCCCCTGGTCCTTCTGA	nucleotide sequence for neuronal gene marker
Gfap TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00566603_m1	TaqMan probe/primers for astrocityc gene marker
iba-1 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn00574125_g1	TaqMan probe/primers for microglya gene marker
Gapdh TaqMan probe	Applied Biosystems.	CTCATGACCACAGTCCA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Forward primer	Applied Biosystems.	GACAACTTTGGCATCGTGGAA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Gapdh Reverse primer	Applied Biosystems.	CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA	nucleotide sequence for reference/housekeeping gene
Oligo2 TaqMan probe	Applied Biosystems.	Rn01767116_m1	TaqMan probe/primers for oligodendrocytic gene marker
P1000 pipettor	Rainin	17014382	It is refered to as the pipette with a large tip diameter in steps 3.1 and 3.3 for mild tissue trituration and step 6.7 to resuspend cells
7500 Fast Real-time PCR system	Applied Biosystems.	446985	for quantitative PCR
FACSAria I Cell Sorter	BD Biosciences		for FACS sorting