肝大肠癌转移的高级动物模型:成像技术和转移性克隆性质

摘要

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

摘要

肝转移和进展的速度缓慢的有限数量的患者可以用局部治疗成功治疗方法^1,2。然而，知之甚少肝转移的异质性，并且需要能够评估个体转移性集落的发育的动物模型。这里，我们提出，提供定量可视个体肿瘤克隆的发展，在肝脏和估计它们的生长动力学和移效率的能力肝转移的一种先进的模型。我们产生与荧光素酶和tdTomato和拥有不同生长特性稳定标记HCT116人结肠癌细胞的单克隆衍生物的面板。用脾注射后跟脾切除，大多数这些克隆能够产生肝转移，但与定植的不同的频率和不同的生长率。使用体内成像SYSTE米（IVIS），它是可能的可视化和量化转移发展与体内的发光和离体荧光成像。此外，漫射发光成像断层扫描（DLIT）提供肝转移体内三维分布。 体外收获肝脏荧光成像提供个别肝脏转移菌落定量测量，从而允许肝定植的频率的评估和生长动力学的转移。由于该模型类似于临床上观察到的肝脏转移，它可以作为用于检测与肝脏转移相关基因和用于肝脏转移性疾病测试潜在烧蚀或辅助治疗的一种模式。

引言

从初级结直肠癌（CRC）肝转移患者被预后不良表征。初级非转移性的CRC的5年生存率（阶段I - III）中被估计为75 - 88％的^3,4-，而肝转移患者（IV期）具有的只有8 5年生存率- ^{12％5 6。}然而，转移性患者是一组异质性，不同数量的转移和复发的不同时代的呈现。临床观察表明，转移（其可以是成比例的定植能力或定植频率）和任何单转移（正比于本地生长速率）的大小的数目是独立的预后因素^1,7。换句话说，转移克隆定植肝脏的成功取决于两个主要的性能:它们生长的能力和它们的传播，并在肝微生存能力。

该设计成功的临床模型与捕获和定量转移克隆的性能可显着提高我们的肝转移生物学的理解，并提供的潜在的治疗方法的设计的有效工具的能力。实验肝转移模型已经先前报道^8,9，但是他们都没有提供定量捕获，并描述在体内和离体个体转移性克隆的性质的能力。

在这里，我们提出肝转移，其中包括肿瘤克隆具有不同的肝脏定植效率和生长特性的产生一个新的，先进的模式。我们采用与荧光素酶和tdTomato荧光蛋白与具有在转移能力固有差异单克隆细胞系的产生癌细胞双标记的组合。在此实验模型中，数据表明，开发肝转移可以在定植频率方面和倍增时间（Td），这是与临床观察结果一致进行说明。该模型的定量性质使得它易于采用用于药物发现和诊断的目的。

研究方案

所有动物的程序是由机构动物护理和使用委员会在芝加哥大学（协议＃72213-09）批准，并在无菌条件下进行的。

1.准备

1. 使500毫升对HCT116肿瘤细胞的培养基:Dulbecco氏补充有10％胎牛血清（FBS），100U / mL青霉素，和100毫克/毫升链霉素改良的Eagle培养基（DMEM）。
2. 高压釜所用的仪器为脾注射模型，包括3 - 4手术巾，纱布，两个小斜角肌挤压拾音器，针驱动器，两双剪刀，小钳，和3 microclips，在251°F下20分钟。
3. 术后准备麻醉小鼠，待脾注射后皮下给药。稀2 - 4微克丁丙诺啡以每只小鼠0.9生理盐水500微升。
4. 准备萤火虫荧光素150微克/ 150微升等份腹腔注射DURING生物发光检测。在-20°C存储和避光。

2.生成荧光素酶/ tdTomato标记的单克隆细胞系^10,11的

1. 解冻并保持HCT116人结肠直肠癌细胞和293FT人胚肾细胞在DMEM含10％FBS，100U / mL青霉素，和100毫克/毫升链霉素。在5％CO ₂和37℃下维持培养。
2. 产生高滴度慢病毒。
   1. 第D 1，板10 - 12×10 ⁶ 293FT在18毫升完全DMEM的（cDMEM）通道3和10 15个1cm池培养皿之间1％非必需氨基酸的细胞有10％FBS，1％青霉素/链霉素和。在37℃和5％的CO _2。
   2. 上D 2，使用以下的转染溶液转染细胞:
      1. 对于每道菜，请使用以下内容:pFUG慢病毒载体的37.5微克插入荧光素酶（Luc2）和tdTomato一个DNA混合物构建^11（从杰弗里·格林博士在芝加哥大学的礼品），pCMVΔ8.74的25微克和12.5微克pMD2.G的悬浮在总共无菌H ₂ O. 1062微升加入2M的氯化钙₂ 188μL。
      2. 添加1250 2×HEPES-缓冲盐水（HBS，50mM的HEPES，1.5毫摩尔_的 Na ₂ HPO _4，和180 mM氯化钠，pH值7.12）的DNA / _氯化钙溶液中，在一个时间一滴微升，同时通过吹泡泡溶液用移液管。
      3. 孵育在室温20分钟，然后添加15.5毫升RT cDMEM和氯喹，以使25μm的终浓度。
   3. 吸媒体在293FT细胞每个培养皿的转染溶液替换。添加16毫升慢慢转染溶液，作为电镀的细胞容易地移去。
   4. 第D 3,8后 - 16小时，除去转染溶液，并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）一次洗涤细胞，再塔基NG不在乎打跑细胞。用18毫升新鲜cDMEM用10毫摩尔的Hepes更换介质。
      注:缓慢移动的菜，吸出的转染溶液，并通过板的侧壁添加介质，以便不去除细胞。
   5. 第D 4，在从转染时48小时，通过用移液管慢慢吸以免撞出细胞收集从碗碟介质。离心机在300×g离心5分钟收集的媒体以沉淀大细胞碎片。
   6. 使用过滤病毒上清用0.45μm低蛋白结合以50,000 xg离心4℃使用SW-28转子2小时过滤烧瓶中并离心。立即倒出上清液离心结束后，干燥与雨刷所述管的内侧。
   7. 有1％FBS重悬在低血清培养基（RSM）的50微升的病毒颗粒。等分试样可以储存在-80℃以供将来使用（病毒股票）。
3. 转导的慢病毒ES进入HCT116细胞和产生tdTomato阳性克隆的面板。
   1. 板的HCT116细胞在病毒感染前1 10 ^5×24孔板1天的密度。
   2. （:100稀释1）与1％青霉素/链霉素和8微克/毫升聚凝胺（CRSM）在4mL的RSM的稀重悬病毒的40微升（从2.2.7）。
   3. 感染的当天，用DPBS洗涤细胞一次，然后从步骤2.3.2添加稀释的病毒的250μL到每个孔中。孵育在37℃下4小时和5％的CO _2，然后添加cDMEM 1毫升到各孔中;孵育在37℃和5％CO ₂的48 - 72小时。
   4. 悬浮细胞用1mL 0.05％胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA，然后添加1mL的cDMEM以中和胰蛋白酶。转移细胞到一个离心管中，并沉淀在300×g离心4分钟。在1mL的Hanks'平衡盐溶液（HBSS）中加2％FBS的洗涤沉淀3次。
   5. 从步骤2.3.4悬浮颗粒用FACS缓冲液（2％FBCS和2mM EDTA的PBS中）成单细胞悬浮液以1×10 ^6个细胞/ mL。
   6. 排序使用细胞分选仪，门控PE阳性细胞的tdTomato阳性HCT116细胞（激发/发射:五百八十五分之五百五十六纳米）。生长于10-cm培养皿中收集的细胞在5％CO ₂和37℃，以产生亲tdTomato阳性HCT116细胞（ 图1A）。
   7. 悬浮亲tdTomato阳性HCT116细胞从2.3.6用8mL 0.05％胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA为3 - 5分钟，然后添加cDMEM 8毫升，以中和胰蛋白酶。
      1. 转移细胞到一个50毫升管中并沉淀在300×g离心4分钟。除去上清液和稀释亲tdTomato阳性HCT116细胞在cDMEM（ 图1B）每200微升1细胞。
   8. 在5％CO ₂和37℃（ 图1C）板在96孔平板每孔的单个小区（稀释的200微升）。
   9. 在5％的CO ₂和37℃，生长在瓶中个别单克隆。 （ 图1D）。

3.荧光信号强度校正为细胞数的函数

1. 板转染HCT116细胞，现在被称为HCT116-L2T，在0密度，10 ^{3，2×10 4，3×10 5，5×10 4，7×10 4，9×10 4个} ，10个⁵细胞/孔在一式三份的每个密度的96孔板。
2. 孵育5小时后，量化使用IVIS ¹⁰ tdTomato荧光强度。
   1. 点击桌面上的图像软件图标启动软件。点击"初始化"按钮初始化成像系统。初始化完成后（大约需要几分钟）后，选择"荧光"，"4秒"的曝光时间，"中"分档，"2"F /停止，"535"激发滤光片，和"580"的发射滤波器。
   2. 将成像站上96孔板，然后点击"获取"开始成像。图像被获取后，点击"投资回报工具"，在工具选项板，并选择12×8从狭缝图标。
   3. 创建12×8的狭缝，以覆盖96孔板的图像上的信号的区域，并点击测量标签。观察每球面度为每平方厘米每一台S光子单位投资回报测量的表的一个窗口（光子/秒/ SR /厘米^2）。
3. 构造用参数（X轴）等于细胞的数目和代表信号强度的函数（Y轴）的散点图。计算使用数据分析软件来计算对应于荧光强度的单元电池的数量（ 图^2）10回归曲线。

4.肝转移的动物模型

1. 一旦HCT116-L2T细胞达到70- 80％汇合，前约1小时，他们准备脾注射。分离使用0.05％胰蛋白酶将细胞在0.53毫摩尔EDTA为3 - 5分钟，然后与等量cDMEM的中和。请务必仔细吸取避免结块。
2. 伯爵用自动细胞计数细胞。
3. 重悬在1×DPBS细胞以1.2的浓度- 2×10 ^6个细胞/ 100微升。确保吸取，彻底悬浮细胞，以避免结块。
4. 保持冰细胞注射前，偶尔它们再悬浮在管。
5. 此前麻醉小鼠，提供术前麻醉和流体通过静推注射皮下步骤1.3中所述的丁丙诺啡混合500微升。辖额外丁丙诺啡混合相同剂量每天两次，直到疼痛（行动不便，驼背的身材，没有新郎，处理时发声）的迹象已经解决。
6. 麻醉6至8周-old雌性无胸腺裸小鼠中氧气2％异氟烷在麻醉室中。确认老鼠完全麻醉下按捏尾巴。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。每个麻醉鼠标转移到一个单独的鼻锥健脾注入。前切口，将每只小鼠应该用无菌手术盖布覆盖。
7. 确定脾通过对裸鼠的左翼皮肤外看到一个紫色区域。采用显微剪刀，使皮肤上的只是脾脏上方8mm的左翼切口。
   1. 接下来，抬起腹壁作一小切口。允许空气进入腹腔，使内脏从切口部位移开。放大腹壁切口大约5毫米。
   2. 轻轻用棉签将切口周围的压力暴露脾脏。如果需要的话，该胰脂肪可轻轻人ipulated以帮助曝光，以免伤害脾胃。
8. 缓缓注入100μL用1毫升注射器，用27克针插入暴露脾根尖细胞的。缓缓注入，历时至少30 - 60秒，以避免额外的肝肿瘤。
9. 放置在脾脏一个microclip在注射结束时除去针，以防止注入细胞悬液泄漏之前。
10. 离开代替microclip 5分钟。
11. 5分钟postinjection，使用手持式烧灼装置止血执行脾切除。解剖脾门，距前身边做起。当解剖大血管，预凝固与相邻的脂肪组织的血管的近端侧，利用烧灼避免过度出血。
    注:止血方法:采用烧灼直接凝固出血点，施加压力，出血点为3 - 5分钟，或缝合结扎出血点用5-0丝质领带。
12. 关闭每个小鼠的侧面切口在两层。首先，关闭腹壁在单个水平针5-0可吸收缝线编织（如薇乔）。接着，用一个单一的水平缝关闭用4-0不可吸收的单纤维缝合线（ 例如，prolene线）皮肤，一次。
13. 喷洒70％的异丙醇，以保持每道工序之间的无菌条件下清洗所有仪器。
    注意:确保当他们从麻醉中醒来的动物温暖。监视所有小鼠手术后，直到他们成为日间及恢复正常活动。通常情况下，恢复的时间大约为3 - 5分钟。直到他们重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧不要让动物无人值守。不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到它已经完全康复的动物。

5. 在体内生物光学成像

1. 进行成像上每周测量和随时间推移定量生物发光变化。
2. 放置小鼠麻醉室，并与在氧气2％异氟烷麻醉它们。确认老鼠完全麻醉下按捏尾巴。使用对眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
3. 其次，从腹腔1.4步注入每只小鼠用的预制的150微升萤火虫萤光素。
4. 将带有个人的鼻锥管理异氟醚在IVIS小鼠。放置在仰卧位的小鼠中之间的间隔的信号，以相邻的小鼠最小化。最多5只小鼠一可以在一个时间被成像。
5. 测量和分析生物发光强度荧光素注射后3分钟。
   1. 如在步骤3.2.1描述初始化IVIS后，选择"发光"，"1秒"的曝光时间，和"中"分箱。
   2. 点击"获取"按钮，开始IMAGING。确保在荧光素注射后一致的时间（3分钟）执行每个成像。
   3. 图像获取后，将图像窗口和工具调色板将出现。点击"的ROI工具"，选择"1"，"2"，"3"，"4"，或"5"，从圆圈图标，对应于成像的小鼠的数目。
   4. 要定义利息（投资回报）的地区，圈在小鼠腹腔发光信号的信号区域，然后单击投资回报率的"三围"为辐射效率的任意单位（（光子/秒/厘米² /球面度）/（μW/厘米^2））。确保有背景的额外投资回报循环。
6. 四周后喷射和前动物牺牲，使用IVIS评价使用个别肿瘤集落的生物发光强度的实时3D重建肿瘤负荷和分配执行漫射发光成像断层扫描（DLIT）。
7. 麻醉小鼠和注射萤光素，如在步骤5.2.4说明。 DLIT是在时间一个鼠标完成。
8. 初始化IVIS后，按步骤3.2.1所述，选择"映像向导"，"生物发光"，然后单击"下一步"。选择"DLIT"，然后单击"下一步"。选择"萤火虫"的探头和点击"下一步"。选择"鼠标"的形象主题，"自动"曝光参数，视"C-13 CM"领域，"0.5 CM"主题的高度，然后单击"下一步"。点击"采集"按钮，开始成像。
9. 图像被获取后，选择"DLIT三维重建"选项卡和"分析"选项卡，然后单击"重建"来生成三维重建图像。
10. 点击"工具"和"三维动画"。在3D动画窗口中选择"Y轴旋转CCW"。点击"记录"和"保存"成.MOV格式文件。

6. 离体荧光成像

1. 通过颈椎脱位牺牲小鼠而麻醉，或根据在4机构指南 - 第6周后的脾注射。
2. 收获肝脏。建立从左边到右侧水平切口。抓住剑突与皮卡，解剖镰状，肝静脉和下腔静脉。
   1. 解剖右肝肾韧带，肝十二指肠韧带，和左韧带肝肾，小心不要弄伤尾状叶，而解剖肝十二指肠韧带。收获肝脏后，取出胆囊，因为这将显示自体荧光。记存在的任何附加额外的肝肿瘤。
3. 记下号码和肝肿瘤的大小目前宏观，然后将收获的肝脏在DPBS。
   注意:肿瘤肉眼可见的宏观为白色的肿瘤（为一个代表性的例子，参见图4）。
4. 之前的成象片上的位置，采取各肝脏和轻轻印迹在纸巾上除去过量的液体。
5. 测量从使用IVIS每个肿瘤集落的荧光强度。
   1. 选择"荧光"，"4秒」的曝光时间，"中"分箱，"2"的F /停止，"535"激发滤光片，和"580"发射滤光片。点击"采集"按钮，开始成像。
   2. 获取图像后，找到图像窗口和工具调色板。点击"工具的投资回报率"，并从圆形图标选择"1"。要定义的ROI，圈出映像中的单个肿瘤殖民地的信号区域，然后单击投资回报率的"三围"为辐射效率的任意单位（（光子/秒/厘米² /球面度）/（μW/厘米^2） ）。确保有背景的额外投资回报循环。
   3. 通过假设它是一个球体计算总的肿瘤体积。肿瘤体积= 4×πXR ^3/3（R =半径）。计算肿瘤集落形成细胞（Fc）的作为肿瘤的肝脏由splenically注射细胞的数目除以数的分数。
   4. 从线性近似从步骤3.3计算每个菌落的细胞总数（= X）。计算细胞分裂（= Y）的数量为Y =登录_2×和TD作为Td的（天）= 28 / Y.

结果

该实验的目的是建立与潜在一致和容易复制动物模型的体内转移性肿瘤负荷的串行量化和对定植频率和显影肝转移生长动力学的估计。 图2-6，有传说，是从我们以前的出版物经Creative Commons CC-BY许可¹⁰提供。

双标肿瘤细胞单克隆生成

首先，用不同的转移能?...

讨论

在目前的报告中提出的动物模型是基于两种主要方法。首先，为了确保观察具有不同倾向转移克隆定殖并在肝脏增殖的能力，高度异质的单克隆细胞系的组建立了，而不是建立普通癌细胞系^12,13。单克隆办法转移发展受到最近的基因组数据¹⁴合理的，以前被成功地用于转移过程^10,15,16建模。第二，通过萤光素酶和tdTomato标记的亲代细胞系的双标记，以便提供转移性生长在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter