肝臓における大腸転移の高度な動物モデル：イメージング技術および転移性クローンのプロパティ

要約

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

要約

肝転移および進行の遅い速度の限られた数の患者が正常局所治療で治療することができる^1,2に近づきます。しかし、ほとんどは、肝転移の不均一性については知られており、個々の転移性コロニーの発達を評価することが可能な動物モデルが必要です。ここでは、定量的に肝臓内の個々の腫瘍クローンの開発を可視化し、それらの増殖速度と植民地化効率を推定する機能を提供し肝転移の高度なモデルを提示します。我々は安定してルシフェラーゼおよびtdTomatoと異なる成長特性を有するで標識したHCT116ヒト結腸直腸癌細胞のモノクローナル誘導体のパネルを生成しました。脾臓摘出に続いて脾臓注射で、これらのクローンの大部分は肝転移を生成することができますが、植民地化の異なる周波数及び様々な成長率を持ちます。 in vivoイメージングのSysteを使用して、M（IVIS）は、in vivoでの発光を用いて、転移の発達を可視化し、定量化することが可能であり、ex vivoでの蛍光イメージング。また、拡散発光イメージング断層撮影（DLIT）は、in vivoでの肝転移の3D分布を提供しています。収穫肝臓のex vivo蛍光イメージングは、肝臓のコロニー形成の頻度の評価と成長動力学を考慮して、個々の肝転移コロニーの定量的測定を提供します転移の。モデルは、臨床的に観察された肝転移と同様であるので、肝転移に関連する遺伝子を検出するための、肝臓の転移性疾患のための潜在的な切除またはアジュバント治療を試験するための様式としての役割を果たすことができます。

概要

原発性結腸直腸癌（CRC）から肝転移を有する患者は予後不良によって特徴づけられます。 12％の⁵ -肝転移（IV期）の患者は、わずか8の5年生存率を有するが、88％の^3,4 -一次非転移性CRCの5年生存率（ステージは、I - III）75と推定されています^、6。しかし、転移性の患者は、転移と異なる再発時間の異なる数を呈する、異種の基を表します。臨床観察は、と（地元の成長率に比例する）任意の単一の転移のサイズ（コロニー形成能力や定着の周波数に比例してもよい）、転移の数が独立した予後因子^1,7であること^を示し^ています。言い換えれば、肝臓をコロニー形成、転移性クローンの成功は、2つの主要な特性に依存する：増殖能と肝微小環境に普及し、生き残るために能力を。

デザイン転移性クローンの特性を捕捉し、定量化する能力を持つ成功した臨床モデルで大幅に肝転移生物学の我々の理解を改善し、潜在的な治療アプローチの設計のための効果的なツールを提供することができます。実験的肝転移のモデルは、以前に^8,9を報告されているが、それらのいずれも定量的に捉えるおよびin vivoおよびex vivo の両方で個々の転移性クローンのプロパティを記述するための機能を提供しました。

ここでは、異なる肝臓のコロニー形成効率と成長特性を有する腫瘍クローンの生成を含んで肝転移の新しい、先進的なモデルを提示します。我々は、転移能力の本質的な相違を有するモノクローナル細胞株の生成でルシフェラーゼおよびtdTomato蛍光タンパク質で癌細胞の二重標識の組み合わせを用います。この実験モデルでは、データは、開発することを示します肝転移は、コロニー形成頻度の条件および臨床観察と一致する倍加時間（TD）で記述することができます。このモデルの定量的性質は、創薬や診断目的のために、それは容易に採用可能になります。

プロトコル

すべての動物の手順は、シカゴ大学（プロトコール＃72213から09）で施設内動物管理使用委員会によって承認され、無菌条件下で行いました。

1.準備

1. HCT116腫瘍細胞の培養のための培地500mlを作る：10％ウシ胎児血清（FBS）、100U / mLのペニシリン、及び100mg / mLのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）。
2. 20分間251°Fで4手術用タオル、ガーゼ、二つの小さなAdsonピックアップ、針ドライバ二はさみの対、小クランプ、及び3マイクロクリップ、 - 3などの脾臓注射モデルに使用される器具をオートクレーブ。
3. 脾臓注射後の皮下に投与されるように、マウスのため術後麻酔を準備します。マウスあたり0.9の生理食塩水500μLにブプレノルフィンの4μgの - 2を希釈します。
4. 腹腔内注射durのためにホタルルシフェリンの150μgの/ 150μLのアリコートを準備生物発光アッセイる。 -20℃で保存し、光から保護します。

ルシフェラーゼ/ tdTomato標識モノクローナル細胞株の2世代^10,11

1. 10％FBS、100 U / mLのペニシリン、及び100mg / mlストレプトマイシンを含むDMEM中でHCT116ヒト結腸直腸癌細胞及び293FTヒト胚腎臓細胞を解凍し、維持します。 5％CO _2、37℃で培養物中に維持します。
2. 高力価のレンチウイルスを生成します。
   1. D 1に、プレート10 -完全DMEMの18ミリリットル（CDMEM）中の15cmの細胞培養皿に継代3と10との間に12×10 ⁶ 293FT細胞を、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％非必須アミノ酸と。 37℃で培養し、5％CO _2。
   2. D 2で、次のトランスフェクション溶液を用いて細胞をトランスフェクション：
      1. 各皿については、以下を使用します。ルシフェラーゼ（Luc2）とtdTomatoで挿入pFUGレンチウイルスベクターの37.5μgののDNAの混合物を滅菌H ₂ Oの1062μLの合計に再懸濁^11（シカゴ大学の博士ジェフリー・グリーンからの贈り物）、pCMVΔ8.7425μgの、およびpMD2.Gの12.5μgのを構築2 MのCaCl ₂の188μLを追加します。
      2. 貫通泡を吹き込みながら、DNA /のCaCl ₂溶液、当時のドロップに2倍Hepes緩衝生理食塩水（HBS、50mMのHEPES、1.5mMののNa ₂ HPO _4、及び180のNaCl、pHは7.12）の1250μLを追加します。ピペットを用いて溶液。
      3. 室温で20分間インキュベートし、その後、25μMの最終濃度を作るためにRT CDMEMとクロロキンの15.5 mLを加え。
   3. 293FT細胞の各ディッシュにメディアを吸引し、トランスフェクション溶液と交換してください。播種した細胞を容易に取り除くように、ゆっくりとトランスフェクション溶液の16 mLを加え。
   4. D 3に、8後 - タキ再び、16時間、トランスフェクション溶液を除去し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で1回細胞を洗浄細胞を除去しないように注意してngの。 10mMのヘペス新鮮なCDMEMの18 mLのメディアを交換してください。
      注：ゆっくりと、お皿を移動トランスフェクション溶液を吸引し、細胞を除去しないように、プレートの側壁を介してメディアを追加します。
   5. D 4に、トランスフェクションの時間から48時間で、細胞を除去しないようにピペットでゆっくりと吸引することにより、食器からメディアを収集します。遠心機で5分間、300×gで収集培地は、大きな細胞片を沈殿させました。
   6. 50,000×gで4℃で2時間、SW-28ローターを使用して、0.45μmの低タンパク質結合フィルターフラスコと遠心分離機を用いてウイルス上清をフィルタリングします。遠心分離が終了した直後に上清を除去し、ワイパーを有する管の内部を乾燥させます。
   7. 1％FBSで還元血清培地（RSM）の50μL中のウイルスペレットを再懸濁。アリコートは、将来の使用（ウイルスストック）のために-80℃で保存することができます。
3. レンチウイルスを形質導入HCT116細胞へのESとtdTomato陽性クローンのパネルを生成します。
   1. ウイルス感染前に24ウェルプレート1（d）に1×10 ⁵の密度でHCT116細胞をプレート。
   2. 1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび8 / mlのポリブレンを持つ：（100希釈1）（CRSM）RSM 4mLに（2.2.7から）再懸濁したウイルスの40μLに希釈します。
   3. 感染の日に、DPBSで細胞を1回洗浄し、その後、各ウェルにステップ2.3.2から希釈したウイルスの250μLを追加します。 37℃で4時間、5％CO ₂のためにインキュベートし、各ウェルにCDMEMの1 mLを加え。 72時間- 48、37℃でインキュベートし、5％CO _2。
   4. 0.05％トリプシンと0.53 mMのEDTAの1 mLで細胞を再懸濁し、その後、トリプシンを中和するためにCDMEMの1 mLを加え。 4分間300×gで遠心チューブとペレットに細胞を移します。ハンクス平衡塩溶液（HBSS）+ 2％FBS 1 mLにペレット3回洗浄します。
   5. ステップ2.3.4からペレットを再懸濁FACS緩衝液（2％FBCS、PBS中の2mM EDTA）で1×10 ⁶細胞/ mLの単一細胞懸濁液に。
   6. PE陽性細胞（：585分の556 nmの励起/発光）のためのゲーティング、セルソーターを使用してソートtdTomato陽性HCT116細胞。親tdTomato陽性HCT116細胞（ 図1A）を生成するために、5％CO _2、37℃で10 cmのディッシュ中で回収された細胞を成長させます。
   7. 3 0.05％トリプシンの8 mLおよび0.53 mMのEDTAで2.3.6から親tdTomato陽性HCT116細胞を再懸濁 - 5分、その後、トリプシンを中和するためにCDMEMの8 mLを加え。
      1. 4分間300×gで50 mLチューブ、ペレットに細胞を移します。上清を除去し、CDMEM（ 図1B）で200μLあたり1セルに親tdTomato陽性HCT116細胞を希釈します。
   8. プレート5％CO _2、37℃（ 図1C）で96ウェルプレート中のウェルあたり単一のセル（希釈の200μL）。
   9. 5％CO _2、37℃でフラスコ内の個々のモノクローンを成長させます。 （ 図1D）。

細胞数の関数としての蛍光シグナル強度の3キャリブレーション

1. 、10 ^3,0の密度で、現在HCT116-L2Tと呼ばれるトランスフェクトされたHCT116細胞を、プレート2×10 ^{4、3×10 5×10 4、7×10 4、×10 4} 9、および図10 ⁵細胞/ウェルの各密度のために三重に96ウェルプレート。
2. インキュベーションの5時間後、IVIS ^10を用いtdTomato蛍光強度を定量化します。
   1. ソフトウェアを起動するデスクトップ上の画像ソフトウェアのアイコンをクリックしてください。イメージングシステムを初期化するために、「初期化」ボタンをクリックします。 （数分程度かかります）初期設定が完了したら、「蛍光」、「4秒」の露光時間、「中」ビニング、 "2" F /停止を選択し、「535」励起フィルター、そして「580」発光フィルター。
   2. イメージングステーション上の96ウェルプレートを置き、撮影を開始するには、「取得」をクリックしてください。画像が取得された後、ツールパレットで「ROIツール」をクリックして、スリットアイコンから12×8を選択します。
   3. 96ウェルプレートの画像上の信号の領域をカバーし、測定]タブをクリックし、12×8のスリットを作成します。 ^（2光子/秒/ SR / cm）の平方cmあたりのステラジアンあたりのあたりの光子の単位とROIの測定値のテーブルを持つウィンドウを観察します。
3. 細胞数とシグナル強度を表す関数（Y軸）に等しい引数（X軸）との散布図を作成します。蛍光強度の単位に対応する細胞の量を計算する（ 図^2）10データ解析ソフトウェアを使用して回帰曲線を計算します。

肝転移の4動物モデル

1. HCT116-L2T細胞が70に達すると- 80％の密集度は、脾臓注射に約1時間前にそれらを準備します。 3のための0.53 mMのEDTA中で、0.05％トリプシンを用いて細胞を解離 - 5分、その後CDMEMの等しい量でそれらを中和します。凝集を回避するために、徹底的にピペッティングすることを確認します。
2. 自動セルカウンターで細胞を数えます。
3. 2×10 ⁶細胞/ 100μL - 1.2の濃度になるように1×DPBSで細胞を再懸濁します。ピペットおよび凝集を回避するために、徹底的に細胞を再懸濁することを確認します。
4. 時折チューブでそれらを再懸濁し、注射まで氷上で細胞を保管してください。
5. マウスを麻酔する前に、ステップ1.3で説明したブプレノルフィン混合物の500μLを皮下注射することにより、術前の麻酔および流体ボーラスを提供します。痛み（不自由、猫背身長、新郎に失敗し、取り扱う発声）の兆候が解決するまで、一日二回の追加ブプレノルフィン混合物の同じ用量を投与。
6. 6〜8週間の麻酔麻酔室の酸素中2％イソフルランで-old雌の無胸腺ヌードマウス。マウスは尾をつまんで麻酔下で完全であることを確認します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。脾臓注射のための個々のノーズコーンに各麻酔マウスを転送します。切開の前に、各マウスは、滅菌外科用ドレープで覆われるべきです。
7. ヌードマウスの左脇腹の皮膚を介して外部から見た紫色の領域として脾臓を識別します。顕微解剖ハサミを使用して、ちょうど脾臓上の皮膚に8ミリメートル左側腹部切開を行います。
   1. 次に、腹壁に持ち上げて、小さな切開を行います。内臓が切開部位から離れるように、腹腔内に空気を許可します。約5ミリメートルに腹壁切開を拡大。
   2. 静かに綿棒で切開部の周りに圧力を加えることによって、脾臓を公開します。必要に応じて、膵臓の脂肪は優しく男することができます脾臓を傷つけないように露出を支援するためにipulated。
8. ゆっくりと露出した脾臓の先端に27 G針を1 mLの注射器を用いた細胞の100μLを注入。外肝腫瘍を回避するために、60秒 - 少なくとも30にわたって、ゆっくり注入します。
9. 注入された細胞懸濁液の漏洩を防止するために、注入前の最後に針を取り除くに脾臓にマイクロクリップを配置します。
10. 5分間の場所でマイクロクリップを残します。
11. 5分注入後、止血のために手持ち焼灼装置を使用して脾臓摘出を行います。前方側から、脾門を解剖。大型船を解剖すると、過度の出血を避けるために、焼灼を使用して、隣接した脂肪組織と血管の近位側を事前に凝固。
    注：止血のための方法：は、焼灼を直接出血点を凝固3のために出血点に圧力をかける - 5分、または5-0絹のネクタイと出血点を縫合結紮。
12. 2層に各マウスの側腹部切開を閉じます。まず、単一横ステッチで5-0吸収性編組縫合糸（ 例えば、VICRYL）で腹壁を閉じます。次に、単一横ステッチで再び、4-0非吸収性モノフィラメント縫合糸（ 例えば、プロレン）を用いて皮膚を閉じます。
13. すべての手順の間に無菌状態を維持するために、70％のイソプロパノールを噴霧することにより、すべての楽器をきれいにしてください。
    注：彼らは麻酔から目覚めながら動物を温めていることを確認します。彼らは歩けるようになると、通常の活動に戻るまで、手術後、全てのマウスを監視します。 5分 - 典型的には、回復時間は約3です。彼らは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻してきたまでは無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。

インビボでの生物発光イメージング5.

1. 上で撮影を行います時間をかけて生物発光の変化を測定し、定量化する週単位。
2. 麻酔チャンバー内にマウスを置き、酸素中2％イソフルランでそれらを麻酔。マウスは尾をつまんで麻酔下で完全であることを確認します。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
3. 次に、腹腔内にステップ1.4からホタルルシフェリンprepreparedの150μLで各マウスを注入します。
4. イソフルランを投与し、個々のノーズコーンとIVISにマウスを置きます。隣接するマウスに信号を最小化するための間にスペーサーを有する仰臥位でマウスを置きます。 5匹のマウスの最大値は、一度に画像化することができます。
5. 測定し、生物発光強度をルシフェリン注射後3分を分析します。
   1. ステップ3.2.1で説明したようにIVISを初期化した後、「発光」、「1秒」の露光時間、および「中」ビニングを選択します。
   2. イマジンを開始するには、「取得」ボタンをクリックしてくださいグラム。ルシフェリン注射後に一貫性のある時間（3分）で各撮像を実行することを確認します。
   3. 画像が取得された後、画像ウィンドウとツールパレットが表示されます。 「ROIツール」をクリックして選択し、 "1"、 "2"、 "3"、 "4"、または "5"サークルアイコンから、撮像されたマウスの数に対応します。
   4. 、インタレスト（関心領域）の領域を定義するマウスの腹腔内での発光信号の信号領域を一周してから、放射効率の任意の単位としてROIの「測定」をクリックします（（光子/秒/ cm ²で/ステラジアン）/（μW/ cm ^2）で）。背景の追加のROIの円を持っていることを確認してください。
6. 4週間目に、注射後と前の動物の犠牲に、個々の腫瘍コロニーの生物発光強度のリアルタイム3D再構成を使用して、腫瘍負荷および分布を評価するためにIVISを用いて、拡散発光イメージング断層撮影法（DLIT）を行います。
   1. マウスを麻酔し、ステップ5.2.4で説明したように、ルシフェリンを注入。 DLITは、一度に一つのマウスに対して行われます。
   2. ステップ3.2.1で説明したようにIVISを初期化した後、「イメージングウィザード」、「生物発光」を選択し、「次へ」をクリックします。 「DLIT」を選択し、「次へ」をクリックします。 「ホタル」プローブを選択し、「次へ」をクリックします。 「マウス」の画像の件名、「自動」露光パラメータ、ビューの「C-13センチメートル」フィールド、および「0.5センチメートル「対象の高さを選択し、「次へ」をクリックします。撮影を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。
   3. 画像が取得された後、「DLIT 3D再構築」タブを選択し、「分析」タブと3D再構成画像を生成するために、「再構築」をクリックします。
   4. 「ツール」をクリックし、「3Dアニメーション」。 3Dアニメーションウィンドウで、「Y軸上のスピンCCW」を選択します。 MOV形式のファイルに「レコード」と「保存」をクリックしてください。

6. 生体外蛍光イメージング

1. 脾臓注射後6週間 - 麻酔、または4での機関のガイドラインに従ってながら頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
2. 肝臓を収穫。右脇腹に左から水平方向の切開を行います。ピックアップで剣状突起をつかん、鎌状、肝静脈、および下大静脈を解剖。
   1. 肝十二指腸間膜を切開しながら、尾状葉を傷つけないように注意しながら、右肝腎靭帯、肝十二指腸間膜、及び左肝腎靭帯を解剖。これは自家蛍光を表示するように肝臓を採取した後、胆嚢を削除します。存在する任意の追加の余分な肝腫瘍をメモします。
3. 現在肉眼番号と肝腫瘍の大きさに注意してください、そしてDPBSで収穫された肝臓を配置します。
   注：腫瘍は肉眼で肉眼で見えます白腫瘍として（代表例えば、 図4を参照してください）。
4. 画像用シート上に配置する前に、各肝臓を取り出し、ペーパータオルでブロッティングにより、過剰な液体を除去します。
5. IVISを用いて、各腫瘍コロニーからの蛍光強度を測定します。
   1. 「蛍光」、「4秒」の露光時間、「中」ビニング、 "2" F /ストップ、「535」励起フィルター、および「580」発光フィルターを選択します。撮影を開始するには、「取得」ボタンをクリックします。
   2. 画像を取得した後、画像ウィンドウとツールパレットを探します。 「ROIツール」をクリックして、丸いアイコンから「1」を選択します。 、関心領域を定義する画像上の個々の腫瘍コロニーの信号領域を一周してから、放射効率の任意単位（（光子/秒/ cm ²で/ステラジアン）/（μW/ cm ^2）を通り、ROIの「測定」をクリックします）。背景の追加のROIの円を持っていることを確認してください。
6. それは球体であると仮定することにより、総腫瘍体積を計算します。腫瘍の体積= 4×πXR ^3月3日 （R =半径）。 splenically注入された細胞の数で割った肝臓内の腫瘍の数のような腫瘍コロニー形成細胞（FC）の割合を計算します。
7. ステップ3.3から線形近似からコロニー当たりの総細胞数（= X）を計算します。 Yとしての細胞分裂（= Y）の数を計算する= Tdを（日）= 28 / Yとして₂ XおよびTDを記録

結果

この実験の目的は、in vivoでの転移性腫瘍負荷のシリアル定量化のためと肝転移を開発するのコロニー形成頻度と成長速度の推定のための潜在的と一致し、容易に再現可能な動物モデルを確立することであった。、2-6フィギュア伝説で、クリエイティブ・コモンズのCC-BYライセンスの¹⁰の下で私たちの以前の出版物から提供されています。

ディスカッション

現在のレポートに表示される動物モデルは、二つの主要なアプローチに基づいています。まず、コロニーを形成し、肝臓で増殖するために、異なる傾向と転移性クローンを観察する能力を確保するために、非常に不均一なモノクローナル細胞株のパネルは、むしろ確立未分画の癌細胞株^12,13よりも、設立されました。転移の開発に対するモノクローナルアプローチは、最近のゲノム・...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter