Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d'imagerie et propriétés des métastatiques Clones

Résumé

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Résumé

Les patients ayant un nombre limité de métastases hépatiques et de faibles taux de progression peuvent être traités avec succès avec le traitement local des approches ^1,2. Cependant, on sait peu sur l'hétérogénéité des métastases hépatiques, et des modèles animaux capables d'évaluer le développement des colonies métastatiques individuels sont nécessaires. Ici, nous présentons un modèle avancé de métastases hépatiques qui permet de visualiser l'évolution quantitative de clones individuels de la tumeur dans le foie et l'estimation de leur cinétique de croissance et l'efficacité de la colonisation. Nous avons généré un panel de dérivés monoclonaux de HCT116 cellules cancéreuses colorectales humaines stablement marquées avec la luciférase et tdTomato et possédant des propriétés de croissance. Avec une injection splénique suivie d'une splénectomie, la majorité de ces clones sont capables de générer des métastases hépatiques, mais avec des fréquences différentes de la colonisation et les différents taux de croissance. Utilisation du Syste In Vivo Imagingm (IVIS), il est possible de visualiser et de quantifier le développement de métastases avec luminescente in vivo et ex vivo de l' imagerie de fluorescence. En outre, Diffuse luminescentes imagerie par tomographie (en DLIT) fournit une distribution 3D des métastases hépatiques in vivo. Ex vivo imagerie de fluorescence des foies prélevés fournit des mesures quantitatives des colonies métastatiques hépatiques individuels, ce qui permet l'évaluation de la fréquence de la colonisation du foie et de la cinétique de croissance des métastases. Étant donné que le modèle est similaire à des métastases hépatiques cliniquement observés, il peut servir en tant que modalité pour détecter les gènes associés à des métastases du foie et pour tester des traitements ablatifs ou un adjuvant potentiel pour une maladie métastatique du foie.

Introduction

Les patients présentant des métastases hépatiques de cancers colorectaux primaires (CRC) sont caractérisés par un mauvais pronostic. Le taux de survie à 5 ans pour les primaires non métastatiques CRC (stades I - III) est estimée à 75-88% ^3,4, alors que les patients présentant des métastases hépatiques (stade IV) ont un taux de survie à 5 ans de seulement 8 - 12% ^{5 , 6.} Cependant, les patients métastatiques constituent un groupe hétérogène, présentant des nombres différents de métastases et des temps de récurrence. Les observations cliniques indiquent que le nombre de métastases (qui peut être proportionnelle à la capacité de coloniser ou de la fréquence de la colonisation) et la taille d'une métastase unique (proportionnelle au taux de croissance locale) sont des facteurs pronostiques indépendants ^1,7. En d'autres termes, le succès des clones métastatiques colonisent le foie dépend de deux propriétés principales: leur capacité à croître et à leur capacité à diffuser et à survivre dans le microenvironnement du foie.

La conceptiondes modèles cliniques réussis avec la capacité de capturer et de quantifier les propriétés des clones métastatiques peut considérablement améliorer notre compréhension des métastases hépatiques biologie et de fournir un outil efficace pour la conception d'approches thérapeutiques potentielles. Les modèles de métastases hépatiques expérimentales ont été précédemment rapporté ^8,9, mais aucun d'entre eux à condition que la capacité de capturer et de décrire les propriétés des clones individuels métastatiques in vivo et ex vivo quantitativement.

Ici, nous présentons un nouveau modèle avancé de métastases hépatiques qui comprend la génération de clones tumoraux avec des efficacités différentes de colonisation du foie et des propriétés de croissance. Nous avons employé une combinaison de double marquage des cellules cancéreuses avec la luciférase et la protéine fluorescente tdTomato avec la génération de lignées cellulaires monoclonales qui ont des différences intrinsèques de la capacité métastatique. Dans ce modèle expérimental, les données indiquent que le développement dedes métastases hépatiques peuvent être décrits en termes de fréquence de la colonisation et le temps de doublement (Td), ce qui est cohérent avec les observations cliniques. La nature quantitative de ce modèle rend facilement adoptable pour la découverte de médicaments et à des fins de diagnostic.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Université de Chicago (Protocole # 72213-09) et effectuées dans des conditions stériles.

1. Préparatifs

1. Faire 500 ml de milieu pour la culture de cellules tumorales HCT116: milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine.
2. AutoClave les instruments à utiliser pour le modèle d'injection de la rate, dont 3 - 4 serviettes chirurgicales, de la gaze, deux petits micros Adson, un pilote d'aiguille, deux paires de ciseaux, une petite pince, et 3 microclips, à 251 ° F pendant 20 min .
3. Préparer l'anesthésie postopératoire pour les souris, doit être administré par voie sous cutanée après l'injection de la rate. Diluer 2-4 ug de buprénorphine dans 500 ul de 0,9 solution saline normale par souris.
4. Préparer des aliquotes de 150 pg / 150 pi de luciférine de luciole pour injection intrapéritonéale DURment les essais de bioluminescence. Conserver à -20 ° C et protéger de la lumière.

2. Génération de luciférase / tdTomato marquées monoclonales des lignées cellulaires ^10,11

1. Décongeler et conserver les cellules humaines de cancer colorectal HCT116 cancéreuses et les cellules 293FT de rein embryonnaire humain dans du DMEM avec 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine. Maintenir en culture à 5% de CO ₂ et 37 ° C.
2. Produire un lentivirus à titre élevé.
   1. Sur D 1, la plaque 10 - 12 x 10 ⁶ 293FT cellules entre le passage 3 et de 10 à 15 cm des boîtes de culture cellulaire dans 18 ml de DMEM complet (cDMEM) avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% acides aminés non essentiels . Incuber à 37 ° C et 5% de CO _2.
   2. Sur D2, transfecter les cellules en utilisant la solution de transfection de ce qui suit:
      1. Pour chaque plat, utilisez ce qui suit: un mélange d'ADN de 37,5 pg de vecteur lentiviral pFUG inséré avec le luciférase (luc2) et tdTomatoconstruit ¹¹ (un don du Dr. Geoffrey Greene à l'Université de Chicago), 25 ug de pCMVΔ8.74, et 12,5 pg de pMD2.G remises en suspension dans un total de 1062 pi de H ₂ O. stérile Ajouter 188 ul de 2 M CaCl _2.
      2. Ajouter 1 250 ul de solution saline 2 x tampon HEPES (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM de Na ₂ HPO ₄ et NaCl 180, pH 7,12) à la solution d' ADN / _CaCl2, une goutte à la fois, tout en faisant des bulles à travers la la solution avec une pipette.
      3. Incuber à température ambiante pendant 20 min, puis ajouter 15,5 ml de RT cDMEM et la chloroquine pour obtenir une concentration finale de 25 uM.
   3. Aspirer les médias dans chaque plat de 293FT cellules et le remplacer par la solution de transfection. Ajouter 16 ml de la solution de transfection lentement, comme les cellules étalées déloge facilement.
   4. Le D 3, après 8-16 h, retirer la solution de transfection et laver les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (DPBS) de Dulbecco, à nouveau taking soin de ne pas déloger les cellules. Remplacez le support avec 18 ml de cDMEM frais avec Hepes 10 mM.
      REMARQUE: déplacer lentement la vaisselle, aspirer la solution de transfection, et ajoutez les médias à travers la paroi latérale de plaques afin de ne pas déloger les cellules.
   5. D sur 4 à 48 heures à partir du moment de la transfection, de recueillir les supports des plats en aspirant lentement avec une pipette de manière à ne pas déloger les cellules. Centrifugeuse les médias collectés à 300 xg pendant 5 min pour précipiter le gros débris cellulaires.
   6. Filtrer le surnageant viral en utilisant 0,45 um à faible liaison aux protéines flacon de filtration et centrifugation en utilisant un rotor SW-28 pendant 2 h à 50 000 x g et 4 ° C. Décanter le surnageant immédiatement après la fin de la centrifugation et de sécher l'intérieur du tube avec des essuie-glaces.
   7. Remettre en suspension le culot viral dans 50 ul de milieu sérique réduit (RSM) avec 1% de FBS. Aliquotes peuvent être conservés à -80 ° C pour une utilisation future (stock virale).
3. Transduire le lentiviruses dans les cellules HCT116 et génèrent un panel de clones tdTomato positifs.
   1. Plaquer les cellules HCT116 à une densité de 1 x 10 ⁵ à 24 plaques de puits 1 j avant l'infection virale.
   2. Diluer 40 ul de virus remis en suspension (de 2.2.7) dans 4 ml de RSM (dilution 1: 100) avec 1% de pénicilline / streptomycine et 8 pg / ml de polybrène (CRSM).
   3. Le jour de l'infection, se laver les cellules une fois avec DPBS, puis ajouter 250 ul de virus dilué de l'étape 2.3.2 à chaque puits. Incuber pendant 4 h à 37 ° C et 5% de CO _2, puis ajouter 1 ml de cDMEM à chaque puits; incuber à 37 ° C et 5% de _CO2 pendant 48-72 heures.
   4. Resuspendre les cellules avec 1 ml de trypsine à 0,05% et 0,53 mM EDTA, puis ajouter 1 ml de cDMEM pour neutraliser la trypsine. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger et à granulés à 300 g pendant 4 min. Laver le 3x culot dans 1 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) plus 2% de FBS.
   5. Reprendre le culot de l'étape 2.3.4avec du tampon FACS (2% FBCS et 2 mM d' EDTA dans du PBS) dans une suspension à cellule unique à 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
   6. Trier les cellules HCT116 tdTomato positif en utilisant un trieur de cellules, gating pour les cellules PE-positif (excitation / émission: 556/585 nm). Cultiver les cellules recueillies dans un plat de 10 cm à 5% de CO ₂ et 37 ° C pour produire des cellules HCT116 de tdTomato positif parentales (figure 1A).
   7. Resuspendre les cellules HCT116 de tdTomato positif parentales de 2.3.6 avec 8 ml de trypsine à 0,05% et 0,53 mM EDTA pendant 3 - 5 min, puis ajoutez 8 ml de cDMEM pour neutraliser la trypsine.
      1. Transférer les cellules à un tube et à granulés 50 ml à 300 g pendant 4 min. Retirer le surnageant et diluer les cellules HCT116 de tdTomato positif parental pour 1 cellule par 200 ul dans cDMEM (figure 1B).
   8. Plaquer une seule cellule (200 ul de la dilution) par puits dans une plaque à 96 puits à raison de 5% de CO ₂ et 37 ° C (figure 1C).
   9. Cultivez monoclones individuels dans des flacons à 5% de CO ₂ et 37 ° C. (Figure 1D).

3. Calibration de l'intensité fluorescente du signal en fonction du nombre de cellules

1. Plaque les cellules HCT116 transfectées, désormais dénommée HCT116-L2T, à une densité de 0, 10 ^3, 2 x 10 ^4, 3 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 7 x 10 ^4, 9 x 10 ⁴ et 10 ⁵ cellules / puits dans des plaques à 96 puits en triple pour chaque densité.
2. Après 5 heures d'incubation, de quantifier les tdTomato intensités de fluorescence en utilisant IVIS ^10.
   1. Cliquez sur l'icône du logiciel d'image sur le bureau pour lancer le logiciel. Cliquez sur le bouton "Initialiser" pour initialiser le système d'imagerie. Après les finitions d'initialisation (ce qui prend environ quelques minutes), sélectionnez "Fluorescence", "4 secondes" temps d'exposition, binning "Medium", "2" F / stop, "535" filtre d'excitation,et le filtre d'émission "580".
   2. Placer la plaque de 96 puits sur la station d'imagerie et cliquez sur "Acquérir" pour démarrer l'imagerie. Après l'image est acquise, cliquez sur "Outils de retour sur investissement" dans la palette d'outils et sélectionnez 12 x 8 à partir de l'icône de la fente.
   3. Créer 12 x 8 fentes pour couvrir la zone de signal sur l'image de la plaque 96 puits et cliquez sur l'onglet mesures. Observer une fenêtre avec une table de mesures de retour sur investissement avec des unités de photons par s par stéradian par centimètre carré (photons / s / sr / cm ^2).
3. Construire un diagramme de dispersion avec le (axe X) égal à l'argument du nombre de cellules et la fonction (axe Y) représentant l'intensité du signal. Calculer les courbes de régression en utilisant un logiciel d'analyse de données pour calculer la quantité de cellules correspondant à l'unité d'intensité de fluorescence (Figure 2) ^10.

4. Modèle animal de métastases hépatiques

1. Une fois que les cellules HCT116-L2T atteignent 70- 80% de confluence, les préparer environ 1 h avant l'injection de la rate. Dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine en mM EDTA 0,53 pendant 3 - 5 min, puis les neutraliser avec une quantité égale de cDMEM. Assurez-vous de la pipette à fond pour éviter l'agglutination.
2. Compter les cellules avec un compteur de cellules automatique.
3. Remettre en suspension les cellules dans 1 x DPBS à une concentration de 1,2 - 2 x 10 ⁶ cellules / 100 pi. Assurez-vous de la pipette et remettre les cellules à fond pour éviter l'agglutination.
4. Maintenir les cellules sur de la glace jusqu'à ce que l'injection, à l'occasion de les remettre en suspension dans le tube.
5. Préalablement à anesthésier les souris, fournir une anesthésie pré-opératoire et un bol de fluide par voie sous-cutanée par injection de 500 ul du mélange de buprénorphine décrit à l'étape 1.3. Administrer la même dose de mélange buprénorphine supplémentaires deux fois par jour jusqu'à ce que des signes de douleur (mobilité réduite, la stature courbée, non marié, vocalisation lorsqu'ils sont manipulés) ont résolu.
6. Anesthésier de 6 à 8 semaines-old souris nude athymiques femelles avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène dans une chambre d'anesthésie. Vérifiez que les souris sont complètement sous anesthésie en pinçant la queue. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Transférer chaque souris anesthésiés à un cône de nez particulier pour l'injection de la rate. Avant l'incision, chaque souris doit être recouvert d'un drap chirurgical stérile.
7. Identifier la rate comme une zone violette vu de l'extérieur à travers la peau sur le flanc gauche de la souris nude. Avec des ciseaux de microdissection, faire un 8 mm flanc gauche incision sur la peau juste au-dessus de la rate.
   1. Ensuite, soulevez la paroi abdominale et faire une petite incision. Permettre à l'air dans la cavité abdominale de telle sorte que les organes internes se déplacent à distance du site d'incision. Agrandir le mur incision abdominale à environ 5 mm.
   2. Exposer la rate en appliquant doucement la pression autour de l'incision avec un coton-tige. Si nécessaire, la graisse du pancréas peut être doucement hommeipulated pour aider à l'exposition afin de ne pas nuire à la rate.
8. Injecter lentement 100 uL de cellules à l'aide d'une seringue de 1 ml avec une aiguille G 27 dans la pointe de la rate exposée. Injecter lentement, sur une période d'au moins 30 - 60 s, afin d'éviter les tumeurs extra-hépatiques.
9. Placer une microclip sur la rate avant de retirer l'aiguille à la fin de l'injection pour empêcher une fuite de la suspension cellulaire injectée.
10. Laissez le microclip en place pendant 5 min.
11. 5 min après l'injection, effectuer une splénectomie en utilisant un dispositif de cautérisation à main pour l'hémostase. Disséquer le hile splénique, en partant de la face antérieure. Lors de la dissection de grands navires, pré-coaguler le côté proximal des vaisseaux avec le tissu adipeux adjacent, en utilisant la cautérisation pour éviter un saignement excessif.
    NOTE: Les méthodes de l'hémostase: coagulent le point de saignement directement avec cautérisation, appliquer une pression sur le point de saignement pendant 3 - 5 min, ou suture-ligaturer le point avec une cravate de soie 5-0 de saignement.
12. Fermer l'incision du flanc de chaque souris en deux couches. Tout d' abord, fermer la paroi abdominale avec un absorbable suture 5-0 tressé (par exemple, Vicryl) en un seul point horizontal. Ensuite, fermez la peau à l' aide d' une suture non résorbable 4-0 monofilament (par exemple, prolene), encore une fois avec un seul point horizontal.
13. Nettoyez tous les instruments par pulvérisation isopropanol à 70% pour maintenir des conditions stériles entre chaque procédure.
    REMARQUE: Assurez-vous que les animaux sont chauffés alors qu'ils se réveillent de l'anesthésie. Surveiller toutes les souris post-opératoire jusqu'à ce qu'ils deviennent ambulatoires et le retour à une activité normale. En règle générale, le temps de récupération est d'environ 3 - 5 min. Ne pas laisser les animaux sans surveillance jusqu'à ce qu'ils aient repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce qu'il ait complètement récupéré.

5. In Vivo Bioluminescent Imaging

1. Effectuer l'imagerie surune base hebdomadaire pour mesurer et quantifier les changements dans bioluminescence au fil du temps.
2. Placer la souris dans une chambre d'anesthésie et de les anesthésier avec 2% d'isoflurane dans de l'oxygène. Vérifiez que les souris sont complètement sous anesthésie en pinçant les queues. Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
3. Ensuite, injecter intrapéritonéale chaque souris avec 150 ul de la luciférine de luciole préalablement préparé à l'étape 1.4.
4. Placez la souris dans un IVIS avec des cônes de nez individuels administration isoflurane. Placer la souris dans la position couchée sur le dos avec des éléments d'espacement entre les deux pour minimiser le signal à des souris adjacentes. Un maximum de cinq souris peut être imagée à un moment donné.
5. Mesurer et analyser les intensités bioluminescentes 3 minutes après l'injection luciférine.
   1. Après l'initialisation de l'IVIS comme décrit à l'étape 3.2.1, sélectionnez "luminescent", "1 deuxième« temps d'exposition, et binning "Medium".
   2. Cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer imaging. Assurez-vous d'effectuer chaque image à la fois cohérente (3 min) après l'injection de luciférine.
   3. Après l'image est acquise, une fenêtre d'image et de la palette d'outils apparaît. Cliquez sur "Outils de retour sur investissement" et sélectionnez "1", "2", "3", "4", ou "5" de l'icône de cercle, correspondant au nombre de souris imagées.
   4. Pour définir les régions d'intérêt (ROI), le tour de la zone de signal du signal luminescent dans la cavité abdominale de la souris, puis cliquez sur «mesures» du retour sur investissement comme une unité arbitraire de l' efficacité énergétique ((photons / s / cm ² / stéradian) / (uW / cm ^2)). Assurez-vous d'avoir un cercle de retour sur investissement supplémentaire de l'arrière-plan.
6. À quatre semaines après l'injection et avant le sacrifice animal, effectuer Diffuse luminescent Imaging Tomography (DLIT) en utilisant IVIS pour évaluer la charge tumorale et la distribution en utilisant la reconstruction 3D en temps réel des intensités bioluminescentes de colonies individuelles tumorales.
   1. Anesthetize les souris et injecter luciférine, comme décrit à l'étape 5.2.4. DLIT est réalisée sur une souris à la fois.
   2. Après l'initialisation de l'IVIS, comme décrit à l'étape 3.2.1, sélectionnez "Assistant d'imagerie", "bioluminescence", et cliquez sur "Suivant". Sélectionnez "DLIT" et cliquez sur "Suivant". Sélectionnez sondes "Firefly" et cliquez sur "Suivant". Sélectionnez l'image sujet "de la souris", paramètre d'exposition "Auto", le champ de vision "C-13 cm", et "0,5 cm" hauteur sujet, et cliquez sur "Suivant". Cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'imagerie.
   3. Après l'image est acquise, sélectionnez l'onglet "DLIT Reconstruction 3D" et le "Analyser" onglet et cliquez sur "Reconstruire" pour générer l'image 3D de reconstruction.
   4. Cliquez sur "Outils" et "Animation 3D". Sélectionnez "CCW Spin sur l'axe Y" dans la fenêtre d'animation 3D. Cliquez sur "Enregistrer" et "Enregistrer" dans un fichier de format .mov.

Imagerie 6. Ex Vivo Fluorescent

1. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale alors anesthésié, ou selon les directives institutionnelles à 4 - 6 semaines après les injections de la rate.
2. Récolter le foie. Faire une incision horizontale de gauche à flanc droit. Saisissant le processus xiphoïde avec un pick-up, disséquer le falciforme, la veine hépatique et la veine cave inférieure.
   1. Disséquer le ligament droit hépato, le ligament hépato-duodénal, et le ligament hépato-gauche, en prenant soin de ne pas blesser le lobe caudé tout en disséquant le ligament hépato. Après la récolte, le foie, enlever la vésicule biliaire, car cela va afficher autofluorescence. Prenez note de tous les tumeurs extra-hépatiques supplémentaires présents.
3. Prenez note des numéros et tailles de tumeurs du foie présente macroscopiquement, et placer les foies récoltés dans DPBS.
   NOTE: Les tumeurs sont macroscopiquement visibles à l'oeil nucomme des tumeurs blanches (pour un exemple représentatif, voir la figure 4).
4. Avant de placer sur la feuille d'imagerie, prenez chaque foie et enlever délicatement l'excès de liquide en tamponnant sur une serviette en papier.
5. Mesurer les intensités de fluorescence de chaque colonie de la tumeur en utilisant le IVIS.
   1. Sélectionnez "Fluorescence", "4 secondes" temps d'exposition, binning "Medium", "2" F / stop, "535" filtre d'excitation, et le filtre "580" d'émission. Cliquez sur le bouton "Acquérir" pour démarrer l'imagerie.
   2. Après l'acquisition de l'image, recherchez la fenêtre d'image et de la palette d'outils. Cliquez sur "Outils de retour sur investissement" et sélectionnez "1" de l'icône du cercle. Pour définir ROIs, encercler la zone de signal de colonies tumorales individuelles sur l'image, puis cliquez sur «mesures» du retour sur investissement comme une unité arbitraire de l' efficacité énergétique ((photons / s / cm ² / stéradian) / (uW / cm ²⁾ ). Assurez-vous d'avoir un cercle de retour sur investissement supplémentaire de l'arrière-plan.
6. Calculer le volume total de la tumeur en supposant que ce soit une sphère. Le volume tumoral = 4 x π xr ^03/03 (r = rayon). Calculer la fraction de cellules de colonies tumorales de formage (Fc) que le nombre de tumeurs dans le foie, divisé par le nombre de cellules injectées splenically.
7. Calculer le nombre total de cellules par colonie (= x) de l'approximation linéaire de l'étape 3.3. Calculer le nombre de divisions cellulaires (= Y) que Y = log ₂ X et Td comme Td (jour) = 28 / Y.

Résultats

Le but de cette expérience était d'établir un modèle animal cohérent et facilement reproductible avec le potentiel pour la quantification en série de la charge tumorale in vivo métastatique et pour l'estimation de la fréquence de colonisation et de la cinétique de développement de métastases hépatiques de croissance. Les figures 2 à 6, avec des légendes, sont fournis à partir de notre précédente publication sous une licence Creative Comm...

Discussion

Le modèle animal présenté dans le rapport actuel est basé sur deux grandes approches. Tout d' abord, afin d'assurer la capacité d'observer des clones métastatiques avec des propensions différentes à coloniser et proliférer dans le foie, un panel de lignées très hétérogènes de cellules monoclonaux a été établie, plutôt que d' un cancer non fractionnée lignée cellulaire établie ^12,13. L'approche monoclonal pour le développement de métastases est justifiée par des donn...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter