Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Resumo

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Resumo

Os pacientes com um número limitado de metástases hepáticas e taxas lentas de progressão podem ser tratadas com sucesso com o tratamento local se aproxima ^{de 1,2.} No entanto, pouco se sabe sobre a heterogeneidade das metástases do fígado, e modelos animais capazes de avaliar o desenvolvimento de colónias metastáticas individuais são necessários. Aqui, apresentamos um modelo avançado de metástases hepáticas que fornece a capacidade de visualizar quantitativamente o desenvolvimento de clones tumorais individuais no fígado e estimar sua cinética de crescimento e eficiência de colonização. Geramos um painel de derivados monoclonais de células de câncer colorretal humano HCT116 estavelmente marcadas com luciferase e tdTomato e possuindo diferentes propriedades de crescimento. Com a injecção do baço seguido de uma esplenectomia, a maioria destes clones são capazes de gerar metástases hepáticas, mas com diferentes frequências de colonização e taxas de crescimento diferentes. Usando o Syste In vivo de imagensm (IVIS), é possível visualizar e quantificar o desenvolvimento de metástase com luminescente in vivo e ex vivo imagiologia fluorescente. Além disso, difusa luminescentes tomografia (DLIT) proporciona uma distribuição 3D de metástases do fígado in vivo. Ex vivo imagem fluorescente de fígados colhidos fornece medições quantitativas de colónias metastáticas hepáticas individuais, permitindo a avaliação da frequência de colonização do fígado e as cinéticas de crescimento de metástases. Uma vez que o modelo é semelhante a metástases hepáticas clinicamente observados, pode servir como uma modalidade para a detecção de genes associados com a metástase do fígado e para testar potenciais tratamentos ablativos ou adjuvantes para a doença metastática fígado.

Introdução

Os pacientes com metástases do fígado a partir de cancros colorectais primários (CRC) são caracterizados por um mau prognóstico. A taxa de sobrevida em 5 anos para primários não-metastáticos CRC (fases I - III) é estimado como 75 - 88% ^3,4, enquanto os pacientes com metástases hepáticas (estágio IV) têm uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 8 - 12% ^{5 , 6.} No entanto, os doentes metastáticos representam um grupo heterogêneo, apresentando-se com diferentes números de metástases e diferentes tempos de recorrência. As observações clinicas indicam que o número de metástases (o qual pode ser proporcional à capacidade de colonização ou frequência de colonização) e o tamanho de uma única metástase (proporcional à taxa de crescimento local) constituem factores de risco independentes, ^1,7. Em outras palavras, o sucesso de clones que colonizam metastáticos do fígado depende de duas propriedades importantes: a sua capacidade de crescer e a sua capacidade para difundir e sobreviver no microambiente do fígado.

O designde modelos clínicos de sucesso com a capacidade de capturar e quantificar as propriedades metastáticas de clones pode melhorar drasticamente a nossa compreensão da biologia do fígado e metástases fornecer uma ferramenta eficaz para o desenho de potenciais abordagens terapêuticas. Todos os modelos de metástase hepática experimental foram previamente relatado ^8,9, mas nenhum deles desde que a capacidade de capturar e descrever as propriedades dos clones metastáticos individuais tanto in vivo e ex vivo quantitativamente.

Aqui, apresentamos um novo modelo, avançado de metástase do fígado que inclui a geração de clones de tumor com diferentes eficiências de colonização fígado e propriedades de crescimento. Utilizou-se uma combinação de dupla-marcação das células cancerosas com a luciferase e a proteína fluorescente tdTomato com a geração de linhas celulares monoclonais que têm diferenças intrínsecas na capacidade metastática. Neste modelo experimental, os dados indicam que o desenvolvimento demetástases do fígado pode ser descrito em termos de frequência e tempo de duplicação de colonização (Td), o que é consistente com as observações clínicas. A natureza quantitativa deste modelo torna facilmente adotáveis ​​para a descoberta de drogas e fins de diagnóstico.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Chicago (Protocolo # 72213-09) e realizado em condições estéreis.

1. Preparações

1. Adicione 500 mL de meio para a cultura de células tumorais HCT116: Modified Eagle Médium da Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina.
2. Autoclave os instrumentos a serem utilizados para o modelo de injecção baço, incluindo 3 - 4 toalhas cirúrgicas, gazes, dois captadores Adson pequenas, um controlador de agulha, dois pares de tesouras, uma pequena braçadeira, e 3 microclips, a 251 ° F durante 20 min .
3. Prepare anestesia pós-operatório para os ratinhos, a ser administrada por via subcutânea, após a injecção do baço. Dilui-se 2-4 ug de buprenorfina em 500 ul de solução salina normal a 0,9 por ratinho.
4. Preparar alíquotas de 150 mg / 150 mL de luciferina de pirilampo para injecções intraperitoneais During os ensaios de bioluminescência. Armazenar a -20 ° C e protegido da luz.

2. Geração de luciferase / tdTomato-rotulados monoclonais celular Lines ^10,11

1. Descongelar e manter as células HCT116 do cancro colo-rectais humanos e 293FT células de rim embrionário humano em DMEM com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina, e 100 mg / ml de estreptomicina. Manter em cultura em 5% de CO ₂ e 37 ° C.
2. Produção de um lentivírus de título elevado.
   1. Em D 1, a placa 10 - 12 x 10 ⁶ 293FT células entre a passagem 3 e 10 em placas de cultura celular de 15 cm em 18 ml de DMEM completo (cDMEM) com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina e aminoácidos não essenciais 1% . Incubar a 37 ° C e 5% de CO _2.
   2. Em D 2, transfectar as células com a seguinte solução de transfecção:
      1. Para cada prato, utilizar o seguinte: uma mistura de ADN de 37,5 ug de pFUG lentiviral vector inserido com a luciferase (Luc2) e tdTomatoconstrói ¹¹ (uma oferta do Dr. Geoffrey Greene na Universidade de Chicago), 25 ug de pCMVΔ8.74, e 12,5 ug de pMD2.G ressuspensas num total de 1062 mL de H ₂ O. estéril Adicionar 188 uL de 2 M de _CaCl2.
      2. Adicionar 1250 mL de solução salina 2x tamponada com Hepes (HBS, Hepes 50 mM, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, e NaCl 180 mM, pH 7,12) para a solução de ADN / _CaCl2, uma gota de cada vez, enquanto se fazia borbulhar bolhas através do solução com uma pipeta.
      3. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min, e em seguida, adicionar 15,5 mL de RT cDMEM e cloroquina para fazer uma concentração final de 25 uM.
   3. Aspirar a mídia em cada prato de 293FT células e substituir com a solução de transfecção. Adicionar 16 ml da solução de transfecção lentamente, como as células plaqueadas desalojar facilmente.
   4. Em D 3, após 8-16 h, remover a solução de transfecção e lave as células uma vez com fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS), novamente Taking cuidado para não desalojar as células. Substituir a mídia com 18 mL de cDMEM fresco com Hepes 10 mM.
      NOTA: mova lentamente pratos, aspirar a solução de transfecção, e adicionar os meios de comunicação através da parede lateral de placas de modo a não desalojar as células.
   5. Em D 4, às 48 h desde o momento da transfecção, recolher os meios de comunicação a partir das placas por aspiração lentamente com uma pipeta, de modo a não desalojar as células. Centrifugar os meios recolhidos a 300 xg durante 5 minutos para precipitar o grande detritos celulares.
   6. Filtra-se o sobrenadante viral utilizando um filtro de 0,45 um balão e centrifugação utilizando um rotor SW-28 durante 2 h a 50000 xg e 4 ° C com baixa ligação às proteínas. Decantar o sobrenadante imediatamente após a conclusão da centrifugação e secar o interior do tubo com o limpa pára-brisas.
   7. Ressuspender o sedimento viral em 50 uL de meio de soro reduzido (RSM) com 1% de FBS. As aliquotas podem ser guardadas a -80 ° C para uso futuro (estoque viral).
3. Transduzir o lentivírusES em células HCT116 e gerar um painel de clones tdTomato-positivos.
   1. Placa as células HCT-116 a uma densidade de 1 x 10 ⁵ em placas de 24 poços 1 d antes da infecção viral.
   2. Diluir 40 uL de vírus ressuspenso (a partir de 2.2.7) em 4 ml de RSM (diluição 1: 100) com 1% de penicilina / estreptomicina e 8 ug / mL de polibreno (CRSM).
   3. No dia da infecção, lavar as células uma vez com DPBS, e então adicionar 250 ul de vírus diluído a partir do passo 2.3.2 a cada poço. Incuba-se durante 4 h a 37 ° C e _CO2 a 5% e, em seguida, adicionar 1 ml de cDMEM a cada poço; incubar a 37 ° C e 5% de _CO2 durante 48-72 h.
   4. Ressuspender as células com 1 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, e em seguida adicionar 1 ml de cDMEM para neutralizar a tripsina. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga e pelete a 300 xg durante 4 min. Lava-se a pelete 3x em 1 mL de Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS) mais 2% de FBS.
   5. Ressuspender o sedimento do passo 2.3.4com tampão FACS (2% ECF e EDTA 2 mM em PBS) a uma suspensão de uma única célula a 1 x 10 ⁶ células / ml.
   6. Ordenar as células HCT116 tdTomato-positivos usando um classificador de células, gating para células PE-positivas (excitação / emissão: 556/585 nm). Crescer as células recolhidas em cerca de 10 cm de placa em 5% de CO ₂ e 37 ° C para gerar células HCT116 tdTomato-positiva parentais (Figura 1A).
   7. Ressuspender as células HCT116 tdTomato-positiva parentais de 2.3.6 com 8 ml de tripsina a 0,05% e EDTA 0,53 mM, durante 3-5 min, e em seguida, adicionar 8 mL de cDMEM para neutralizar a tripsina.
      1. Transferir as células para um tubo de 50 mL e de pelotas a 300 xg durante 4 min. Remover o sobrenadante e diluir as células HCT116 tdTomato-positiva parentais para uma célula por 200 uL no cDMEM (Figura 1B).
   8. Placa de uma única célula (200 uL da diluição) por poço numa placa de 96 cavidades, com 5% de CO ₂ e 37 ° C (Figura 1C).
   9. Cresça monoclones individuais em frascos de 5% de CO ₂ e 37 ° C. (Figura 1D).

3. A calibração da intensidade de fluorescência de sinal em função do número de células

1. Placa as células HCT-116 transfectadas, agora referidos como HCT116-L2T, a uma densidade de 0, 10 ^3, 2 x 10 ^4, 3 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 7 x 10 ^4, 9 x 10 ⁴ e 10 ⁵ células / poço em placas de 96 poços em triplicado para cada densidade.
2. Após 5 horas de incubação, as quantificar tdTomato intensidades fluorescentes utilizando IVIS ^10.
   1. Clique no ícone do software de imagem na área de trabalho para iniciar o software. Clique no botão "Iniciar" para inicializar o sistema de imagem. Depois de terminar a inicialização (que leva cerca de alguns minutos), selecione "fluorescência", "4 segundos" tempo de exposição, binning "Medium", "2" F / stop ", 535" filtro de excitação,e "580" filtro de emissão.
   2. Coloque a placa de 96 poços na estação de imagens e clique em "Adquirir" para iniciar a geração de imagens. Depois que a imagem é adquirida, clique em "Ferramentas de ROI" na paleta de ferramentas e selecione 12 x 8 a partir do ícone de fenda.
   3. Criar 12 x 8 fendas para cobrir a área de sinal na imagem da placa de 96 poços e clique na guia medições. Observe uma janela com uma tabela de medições de ROI com unidades de fótons por s por esterradiano por centímetro quadrado (fótons / s / sr / cm ^2).
3. Construir um gráfico de dispersão com o argumento (eixo X) igual ao número de células e a função (eixo Y) que representa a intensidade do sinal. Calcular curvas de regressão utilizando um software de análise de dados para calcular a quantidade de células correspondentes à unidade de intensidade fluorescente (Figura 2) ^10.

4. Modelo Animal de metástases hepáticas

1. Uma vez que as células HCT116-L2T chegar a 70- 80% de confluência, prepará-los aproximadamente 1 h antes da injecção de baço. Dissociar as células usando tripsina a 0,05% em EDTA 0,53 mM durante 3 - 5 minutos, e, em seguida, neutralizá-los com uma quantidade igual de cDMEM. Certifique-se de pipetar cuidadosamente para evitar aglomeração.
2. Contar as células com um contador de células automático.
3. Ressuspender as células em 1X DPBS para uma concentração de 1,2 - 2 x 10 ⁶ células / 100 ul. Certifique-se de pipeta e voltar a suspender as células cuidadosamente para evitar aglomeração.
4. Manter as células em gelo até injecção, ocasionalmente, ressuspendendo-as no tubo.
5. Antes de se anestesiar os ratos, fornecer um anestésico pré-operatória e de bolus fluido por injecção subcutânea de 500 ul da mistura de buprenorfina descrito no passo 1.3. Administrar a mesma dose de mistura buprenorfina adicional duas vezes por dia até que os sinais de dor (mobilidade reduzida, estatura curvada, a falta de noivo, vocalização quando manuseado) ter resolvido.
6. Anestesiar de 6 a 8 semanasratinhos atímicos fêmea -old nu com 2% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de anestesia. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar a cauda. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia. Transfira cada rato anestesiado a um cone do nariz individual para a injeção baço. Antes da incisão, cada rato deve ser coberta com uma cortina cirúrgica estéril.
7. Identificar o baço como uma área de roxo visto externamente através da pele no flanco esquerdo dos ratinhos nus. Com uma tesoura de microdissecção, fazer uma incisão 8 milímetros flanco esquerdo sobre a pele um pouco acima do baço.
   1. Em seguida, levante a parede abdominal e fazer uma pequena incisão. Permitir que o ar no interior da cavidade abdominal, de modo a que os órgãos internos afastar-se do local da incisão. Aumentar a incisão da parede abdominal para aproximadamente 5 mm.
   2. Expor o baço através da aplicação de pressão suavemente em torno da incisão com um cotonete. Se necessário, a gordura pancreático pode ser suavemente homemipulated para ajudar com a exposição de modo a não prejudicar o baço.
8. Lentamente, injectar 100 ul de células usando uma seringa de 1 ml com uma agulha G 27, para a ponta do baço exposta. Injectar-se lentamente, ao longo de um período de pelo menos 30 - 60 s, para evitar tumores extra-hepáticas.
9. Coloque um microclipe no baço antes de remover a agulha no final da injecção para evitar a fuga da suspensão de células injectadas.
10. Deixe o microclipe no local por 5 min.
11. 5 min após a injecção, realizar uma esplenectomia usando um cautério de mão para hemostasia. Dissecar o hilo do baço, a partir do lado anterior. Ao dissecar grandes vasos, pré-coagulação do lado proximal do recipiente com o tecido adiposo adjacente, utilizando cautério para evitar o sangramento excessivo.
    NOTA: Os métodos para hemostasia: coagular o ponto de sangramento diretamente com cautério, aplicar pressão para o ponto de sangramento por 3-5 min, ou sutura-ligadura o ponto de sangramento com um empate 5-0 seda.
12. Fechar a incisão de flanco de cada murganho em duas camadas. Em primeiro lugar, fechar a parede abdominal com uma sutura absorvível 5-0 entrançada (por exemplo, Vicryl) num ponto horizontal. Em seguida, fechar a pele usando um 4-0 não absorvíveis sutura monofilamento (por exemplo, prolene), novamente com um único ponto horizontal.
13. Limpe todos os instrumentos por pulverização 70% isopropanol para manter condições estéreis entre cada procedimento.
    NOTA: Certifique-se os animais são aquecidos enquanto eles despertar da anestesia. Monitorar todos os ratos pós-operatório até se tornarem ambulatorial e voltar à atividade normal. Tipicamente, o tempo de recuperação é de aproximadamente 3-5 min. Não deixar os animais sem vigilância até que tenham recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.

5. In Vivo de Imagiologia bioluminescente

1. Realizar imagem emsemanalmente para medir e quantificar alterações na bioluminescência ao longo do tempo.
2. Coloque os ratos em uma câmara de anestesia e anestesiar-los com 2% de isoflurano em oxigênio. Confirmar que os ratos estão completamente sob anestesia por beliscar as caudas. Use vet pomada sobre os olhos para evitar a secura e sob anestesia.
3. Em seguida, intraperitoneal injetar cada rato com 150 mL da preprepared pirilampo luciferina a partir do passo 1.4.
4. Coloque a ratos em um IVIS com cones do nariz individuais administração de isoflurano. Coloque a ratinhos em posição supina com espaçadores entre eles para minimizar o sinal de ratinhos adjacentes. Um máximo de cinco ratinhos pode ser trabalhada de uma só vez.
5. Medir e analisar intensidades bioluminescentes 3 min após a injeção luciferina.
   1. Depois de inicializar o IVIS como descrito no passo 3.2.1, selecione "Luminescent", "um segundo" tempo de exposição e binning "Medium".
   2. Clique no botão "Adquirir" para iniciar imaging. Certifique-se de executar cada imagem em um tempo consistente (3 min) após a injeção luciferina.
   3. Depois que a imagem é adquirida, uma janela de imagem e paleta de ferramentas irá aparecer. Ferramentas clique "ROI" e selecionar "1", "2", "3", "4" ou "5", a partir do ícone de círculo, que corresponde ao número de ratinhos trabalhada.
   4. Para definir regiões de interesse (ROI), circule a área do sinal do sinal luminescente na cavidade abdominal do mouse e clique em "medidas" do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm ² / esferorradiano) / (uW / ^cm2)). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo.
6. No pós-injecção e antes de sacrifício de animais de quatro semanas, execute difusa luminescentes tomografia (DLIT) usando IVIS para avaliar a carga tumoral e distribuição usando em tempo real reconstrução 3D de intensidades bioluminescentes de colónias tumorais individuais.
   1. Anestesiar os ratos e injectar luciferina, tal como descrito no passo 5.2.4. DLIT é realizada em um rato de cada vez.
   2. Depois de inicializar o IVIS, conforme descrito na etapa 3.2.1, selecione "Assistente de Imagem", "bioluminescência", e clique em "Next". Selecione "DLIT" e clique em "Next". Escolha sondas "Firefly" e clique em "Next". Selecione "mouse" assunto de imagem, parâmetro de exposição "Auto", o campo "C-13 cm" de vista, e "0,5 cm" height assunto, e clique em "Next". Clique no botão "Adquirir" para iniciar a geração de imagens.
   3. Depois que a imagem é adquirida, selecione a guia "DLIT Reconstrução 3D" e "Analisar" e clique em "Reconstruir" para gerar a imagem reconstrução 3D.
   4. Clique em "Ferramentas" e "Animação 3D". Selecione "CCW rotação no eixo Y" na janela de animação 3D. Clique em "Record" e "Salvar" em um arquivo de formato .mov.

6. Ex Vivo Fluorescent Imagem

1. Sacrificar os ratos por deslocamento cervical, enquanto anestesiados, ou de acordo com as diretrizes institucionais em 4 - 6 semanas após as injecções de baço.
2. Colher o fígado. Faça uma incisão horizontal da esquerda para o flanco direito. Agarrando o processo xifóide com um captador, dissecar o falciforme, a veia hepática e da veia cava inferior.
   1. Dissecar o ligamento direito hepato-renal, o ligamento hepatoduodenal, eo ligamento hepato-renal esquerda, tomando cuidado para não ferir o lobo caudado, enquanto dissecando o ligamento hepatoduodenal. Após a colheita do fígado, remover a vesícula biliar, pois isso irá exibir autofluorescência. Tome nota de quaisquer tumores extra-hepáticas adicional presente.
3. Tome nota dos números e tamanhos de tumores hepáticos presente macroscopicamente, e colocar os fígados colhidos em DPBS.
   NOTA: Os tumores são macroscopicamente visível a olho nucomo tumores branco (para um exemplo representativo, ver Figura 4).
4. Antes da colocação na folha de imagem, tome cada fígado e remova cuidadosamente o excesso de líquido borrando em uma toalha de papel.
5. Medem-se as intensidades de fluorescência de cada colónia tumor utilizando o IVIS.
   1. Selecione "fluorescência", "4 segundos" tempo de exposição, binning "Medium", "2" F / stop ", 535" filtro de excitação, e "580" filtro de emissão. Clique no botão "Adquirir" para iniciar a geração de imagens.
   2. Depois de adquirir a imagem, localizar a janela de imagem e paleta de ferramentas. Clique em "Ferramentas de ROI" e selecione "1" a partir do ícone do círculo. Para definir ROIs, circule a área do sinal de colónias tumorais individuais sobre a imagem e clique em "medidas" do ROI como uma unidade arbitrária de eficiência radiante ((fótons / s / cm ² / esterradiano) / (mW / cm ²⁾ ). Certifique-se de ter um círculo ROI adicional do fundo.
6. Calcule o volume total do tumor, assumindo que ela seja uma esfera. O volume do tumor = 4 x π XR ^3/3 (r = radius). Calcula-se a fracção de células formadoras de colónias do tumor (Fc) como o número de tumores no fígado, dividido pelo número de células splenically injectado.
7. Calcule o número total de células por colónia (= X) a partir da aproximação linear a partir do passo 3.3. Calcule o número de divisões celulares (= Y) como Y = log ₂ X eo Td como Td (dia) = 28 / Y.

Resultados

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um modelo animal consistente e facilmente reproduzível com o potencial para a quantificação de série da carga tumoral metastático in vivo e para a estimativa da frequência de colonização e cinética de crescimento do desenvolvimento de metástases hepáticas. Figuras 2-6, com lendas, são fornecidos a partir de nossa publicação anterior sob uma licença Creative Commons CC-BY ^10.

Discussão

O modelo animal apresentado no relatório atual é baseada em duas abordagens principais. Em primeiro lugar, a fim de garantir a capacidade de observar os clones metastáticas com diferentes propensões para colonizar e proliferar no fígado, um painel de linhas celulares monoclonais altamente heterogénea foi estabelecida, ao invés de uma linha de células de cancro não fraccionada estabelecida ^12,13. A abordagem monoclonal para o desenvolvimento de metástase é justificada por dados genômicos recentes <...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter