Erweiterte Tiermodell für Colorectal Metastase in der Leber: Imaging-Techniken und Eigenschaften des metastasierten Clones

Zusammenfassung

The ability of metastatic clones to colonize distant sites depends on their proliferation capacity and/or their ability to survive in the host microenvironment without significant proliferation. Here, we present an animal model that allows quantitative visualization of both types of liver colonization by metastatic clones.

Zusammenfassung

Patienten mit einer begrenzten Anzahl von Lebermetastasen und langsam Progressionsraten können erfolgreich mit lokalen Behandlungsansätze ^1,2 behandelt werden. Es ist jedoch wenig über die Heterogenität der Lebermetastasen bekannt und Tiermodellen der Lage, die Entwicklung individueller metastatischen Kolonien Auswertung benötigt. Hier präsentieren wir eine erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Fähigkeit bietet, um quantitativ die Entwicklung individueller Tumor Klone in der Leber zu visualisieren und deren Wachstumskinetik und Kolonisierung Effizienz abzuschätzen. Wir erzeugten eine Reihe von monoklonalen Derivate von HCT116 menschlichen Zellen Darmkrebs stabil markiert mit Luciferase und tdTomato und unterschiedliche Wachstumseigenschaften besitzen. Mit einer splenic Injektion durch eine Splenektomie gefolgt sind die meisten dieser Klone können Lebermetastasen zu erzeugen, aber mit unterschiedlichen Frequenzen der Kolonisierung und unterschiedlichen Wachstumsraten. Unter Verwendung der In Vivo Imaging System (IVIS) ist es möglich , die Entwicklung mit Metastasierung in vivo lumineszente und ex vivo Fluoreszenzabbildung sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Zusätzlich stellt Diffuse Leucht Imaging Tomography (DLIT) eine 3D - Verteilung von Lebermetastasen in vivo. Ex - vivo - Fluoreszenz - Bildgebung des geernteten Lebern quantitative Messungen einzelner hepatischen metastatischen Kolonien liefert, so dass für die Auswertung der Häufigkeit der Leber Kolonisierung und die Wachstumskinetik von Metastasen. Da das Modell zu klinisch beobachtet Lebermetastasen ähnlich ist, kann es als eine Modalität dienen Genen assoziiert mit Lebermetastasierung und zur Prüfung Potential ablative oder adjuvanten Behandlung von Leber-Metastasen nachzuweisen.

Einleitung

Patienten mit Lebermetastasen von primären Darmkrebs (CRC) durch eine schlechte Prognose gekennzeichnet. Die 5-Jahres - Überlebensrate für die primäre nonmetastatic CRC (Phasen I - III) - 88% ^3,4, während Patienten mit Lebermetastasen (Stadium IV) haben eine 5-Jahres - Überlebensrate von nur 8 - als 75 auf 12% geschätzt ^{5 , 6.} Patienten mit metastasiertem stellen jedoch eine heterogene Gruppe, mit einer unterschiedlichen Anzahl von Metastasen und verschiedenen Wiederholungszeiten präsentiert. Klinische Beobachtungen zeigen , dass die Anzahl der Metastasen (die Fähigkeit zur Besiedelung oder Häufigkeit der Kolonisierung proportional sein kann) und die Größe einer einzelnen Metastasierung (proportional zum lokalen Wachstumsrate) sind unabhängige prognostische Faktoren ^1,7. Mit anderen Worten hängt der Erfolg von metastasierendem Klone die Leber Kolonisierung auf zwei Haupteigenschaften: ihre Fähigkeit, in der Leber-Mikroumgebung zu wachsen und ihre Fähigkeit, zu verbreiten und zu überleben.

Das Designvon erfolgreichen klinischen Modelle mit der Fähigkeit zur Erfassung und die Eigenschaften von metastasierendem Klone Quantifizierung drastisch unser Verständnis von Lebermetastasen Biologie und bieten ein effektives Werkzeug für die Gestaltung von potentiellen therapeutischen Ansätze zu verbessern. Modellen experimenteller Lebermetastasen wurden ^8,9 bereits berichtet, aber keiner von ihnen die Fähigkeit bereitgestellt Eigenschaften einzelner Klone metastatic quantitativ zu erfassen und zu beschreiben , sowohl in vivo als auch ex vivo.

Hier präsentieren wir eine neue, erweiterte Modell von Lebermetastasen, die die Erzeugung von Tumor-Klone mit verschiedenen Leber Kolonisation Effizienzen und Wachstumseigenschaften umfasst. Wir verwendeten eine Kombination von Doppel-Markierung von Krebszellen mit Luciferase und tdTomato fluoreszierendes Protein mit der Erzeugung von monoklonalen Zelllinien, die intrinsische Unterschiede in metastatischen Kapazität. In diesem experimentellen Modell zeigen die Daten, dass die Entwicklung vonLebermetastasen kann in Bezug auf die Frequenz und Kolonisierung Verdopplungszeit (Td) beschrieben, die mit klinischen Beobachtungen konsistent ist. Die quantitative Natur dieses Modells macht es für die Wirkstoffforschung und diagnostische Zwecke leicht einnehmbaren.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Chicago (Protokoll # 72213-09) und durchgeführt unter sterilen Bedingungen genehmigt.

1. Vorbereitungen

1. Machen 500 ml Medium für die Kultur von Tumorzellen HCT116: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin.
2. Autoklaven die Instrumente für die Milz Injektion Modell verwendet werden, einschließlich der 3-4 chirurgische Handtücher, Gaze, zwei kleine Adson Pickups, eine Nadel-Treiber, zwei Paare von Schere, eine kleine Klammer und 3 microclips, bei 251 ° C für 20 min .
3. Vorbereitung postoperativen Anästhesie für die Mäuse subkutan nach der Milz Injektion verabreicht werden. Verdünnte 2 bis 4 & mgr; g von Buprenorphin in 500 & mgr; l von 0,9 normaler Kochsalzlösung pro Maus.
4. Bereiten Sie Teilmengen von 150 ug / 150 ul von Glühwürmchen-Luciferin für die intraperitoneale Injektionen during die Biolumineszenz-Assays. Lagerung bei -20 ° C und vor Licht schützen.

2. Erzeugung von Luciferase / tdTomato-markierten monoklonalen Zellinien ^10,11

1. Auftau und HCT116 menschlichen Darmkrebszellen und 293FT humanen embryonalen Nierenzellen in DMEM mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin aufrechtzuerhalten. Pflegen in Kultur bei 5% CO ₂ und 37 ° C.
2. Produzieren einen hohen Titer Lentiviren.
   1. Auf D 1, Platte 10 bis 12 x 10 ⁶ 293FT Zellen zwischen dem Kanal 3 und 10 in 15 cm Zellkulturschalen in 18 ml komplettem DMEM (cDMEM) mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 1% nicht - essentielle Aminosäuren . Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Auf D 2, die Zellen unter Verwendung der folgenden Transfektion Lösung transfizieren:
      1. Für jedes Gericht, verwenden Sie die folgende: eine DNA-Mischung von 37,5 ug pFUG lentiviralen Vektor mit der Luciferase eingesetzt (Luc2) und tdTomatoKonstrukte ¹¹ (an der University of Chicago , ein Geschenk von Dr. Geoffrey Greene), 25 ug pCMVΔ8.74 und 12,5 ug pMD2.G in insgesamt 1062 ul sterilem H ₂ O resuspendiert Hinzufügen 188 & mgr; l 2 M CaCl _2.
      2. Hinzufügen 1.250 & mgr; l 2x Hepes-gepufferter Saline (HBS, der 50 mM Hepes, 1,5 mM Na ₂ HPO ₄ und 180 mM NaCl, pH 7,12) an die DNA / CaCl & _sub2 ; -Lösung, ein Tropfen zu einer Zeit, während Blasen Blasen durch die Lösung mit einer Pipette.
      3. bei RT inkubieren 20 min und dann 15.5 ml RT cDMEM hinzufügen und Chloroquin in einer Endkonzentration von 25 uM zu machen.
   3. Absaugen Medien in jeder Schale von 293FT Zellen und mit der Transfektion Lösung ersetzen. In 16 ml der Transfektion Lösung langsam, da die plattierten Zellen leicht entfernen.
   4. Am D 3 nach 8 bis 16 h, die Transfektionslösung entfernen und die Zellen einmal mit Dulbecco-Phosphat-gepufferter Saline (DPBS) waschen, nochmals Taking kümmern sich nicht um die Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie die Medien mit 18 ml frischem cDMEM mit 10 mM Hepes.
      HINWEIS: Langsam Gerichte bewegen, die Transfektion Lösung absaugen und die Medien durch die Seitenwand der Platten hinzufügen, um nicht die Zellen zu entfernen.
   5. Auf D 4 bei 48 h von dem Zeitpunkt der Transfektion, sammeln das Medium aus den Schalen von langsam mit einer Pipette angesaugt, um nicht um die Zellen zu entfernen. Zentrifuge die gesammelten Medien bei 300 xg für 5 min die große Zelltrümmer zu präzipitieren.
   6. Filtriere den viralen Überstand ein 0,45 um Niederproteinbindungs ​​Saugflasche und Zentrifuge unter Verwendung eines SW-28-Rotor für 2 h bei 50.000 xg und 4 ° C verwendet wird. Den Überstand umfüllen unmittelbar nach der Zentrifugation beendet und trocknen Sie die Innenseite des Rohres mit Wischern.
   7. Resuspendieren der viralen Pellet in 50 & mgr; l Reduzierte Serum Medium (RSM) mit 1% FBS. Aliquots können für die zukünftige Verwendung (Virusstamm) bei -80 ° C gelagert werden.
3. Transduzieren die Lentivirenes in den HCT116 Zellen und eine Gruppe von tdTomato-positive Klone erzeugen.
   1. Platte die HCT116 - Zellen in einer Dichte von 1 x 10 ⁵ in 24 - Well - Platten 1 d vor der Virusinfektion.
   2. Verdünne 40 & mgr; l der resuspendierten Virus (aus 2.2.7) in 4 ml RSM (1: 100 Verdünnung) mit 1% Penicillin / Streptomycin und 8 ug / ml Polybren (CRSM).
   3. Am Tag der Infektion, waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS, und dann wurden 250 & mgr; l des verdünnten Virus von Schritt hinzufügen 2.3.2 zu jeder Vertiefung. Inkubieren für 4 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ und dann 1 mL cDMEM in jede Vertiefung; 72 h - bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 48 inkubieren.
   4. Resuspendieren der Zellen mit 1 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA, und füge dann 1 ml cDMEM um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet bei 300 g für 4 min. Waschen Sie das Pellet 3x in 1 ml Balanced Salt Solution (HBSS) plus 2% FBS "Hanks.
   5. Das Pellet aus Schritt 2.3.4mit FACS Puffer (2% FBCs und 2 mM EDTA in PBS) in eine Einzelzellsuspension mit 1 x 10 ⁶ Zellen / mL.
   6. Sortieren Sie die tdTomato-positive HCT116 Zellen einen Zellsortierer verwenden, Gating für PE-positive Zellen (Anregung / Emission: 556/585 nm). Wachsen die gesammelten Zellen in einer 10-cm - Schale in 5% CO ₂ und 37 ° C parentalen tdTomato-positive HCT116 - Zellen (1A) zu erzeugen.
   7. Resuspendieren der elterlichen tdTomato-positive HCT116 Zellen aus 2.3.6 mit 8 ml 0,05% Trypsin und 0,53 mM EDTA 3 - 5 min, und dann 8 ml cDMEM fügen Sie das Trypsin zu neutralisieren.
      1. Übertragung der Zellen auf eine 50 ml-Röhrchen und Pellets bei 300 × g für 4 min. Entfernen Sie den Überstand und verdünnen die elterliche tdTomato-positive HCT116 Zellen auf 1 Zelle pro 200 ul in cDMEM (1B).
   8. Platte , die eine einzelne Zelle (200 & mgr; l der Verdünnung) pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen bei 5% CO ₂ und 37 ° C (Abbildung 1C).
   9. Wachsen einzelnen Monoklone in Flaschen mit 5% CO ₂ und 37 ° C. (1D).

3. Kalibrierung von Fluoreszenzsignalintensität als Funktion der Anzahl von Zellen

1. Platte die HCT116 - Zellen transfiziert, jetzt bezeichnet als HCT116-L2T, bei einer Dichte von 0, 10 ^3, 2 x 10 ^4, 3 x 10 ^5, 5 x 10 ^4, 7 x 10 ^4, 9 x 10 ⁴ und 10 ⁵ Zellen / Well in 96 - Well - Platten in dreifacher Ausführung für jede Dichte.
2. Nach 5 h Inkubation quantifizieren die tdTomato Fluoreszenzintensitäten IVIS unter Verwendung von ^10.
   1. Klicken Sie auf das Bild Software-Symbol auf dem Desktop, um die Software zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Initialisieren" das Abbildungssystem zu initialisieren. Nach der Initialisierung beendet (die über wenige Minuten dauert), wählen Sie "Fluoreszenz", "4 Sekunden" Belichtungszeit "Medium" Binning "2" F / Stop, "535" Anregungsfilter,und "580" Emissionsfilter.
   2. Legen Sie die 96-Well-Platte auf der Abbildungsstation und klicken Sie auf "Acquire" Imaging zu starten. Nachdem das Bild aufgenommen wird, klicken Sie auf "ROI-Tools" in der Werkzeugpalette und 12 x 8 aus dem Schlitz Symbol.
   3. Erstellen Sie 12 x 8 Schlitze den Bereich des Signals auf das Bild der 96-Well-Platte und klicken Sie auf die Registerkarte Messungen zu decken. Beachten Sie ein Fenster mit einer Tabelle von ROI - Messungen mit Einheiten der Photonen pro s pro Steradiant pro Quadratzentimeter (Photonen / s / sr / cm ^2).
3. Konstrukt ein Streudiagramm mit dem Argument (X-Achse) gleich der Anzahl der Zellen und die Funktion (Y-Achse), die Signalintensität. Berechnen Regressionskurven eine Datenanalyse - Software unter Verwendung der Menge von Zellen zu berechnen , auf die Einheit der Fluoreszenzintensität entspricht (Abbildung 2) ^10.

4. Tiermodell von Lebermetastasen

1. Sobald die HCT116-L2T Zellen erreichen 70- 80% Konfluenz, bereiten sie ca. 1 h vor der Milz Injektion. Dissoziieren die Zellen 0,05% Trypsin in 0,53 mM EDTA unter Verwendung von 3 bis 5 min und dann neutralisiert sie mit einer gleichen Menge von cDMEM. Achten Sie darauf, gründlich zu pipettieren Verklumpungen zu vermeiden.
2. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler.
3. Resuspendieren der Zellen in 1x DPBS auf eine Konzentration von 1,2 bis 2 x 10 ⁶ Zellen / 100 & mgr; l. Achten Sie darauf, um die Zellen zu pipettieren und resuspendieren gründlich Verklumpungen zu vermeiden.
4. Halten Sie die Zellen auf Eis bis zur Injektion, gelegentlich sie in der Röhre Resuspendieren.
5. Bevor die Mäuse betäubt, liefern eine präoperativen anästhetische und Flüssigkeits Bolus durch subkutane Injektion von 500 & mgr; l des Buprenorphin Mischung in Schritt 1.3 beschrieben. Verabreichen Sie die gleiche Dosis von zusätzlichen Buprenorphin Mischung zweimal täglich, bis Anzeichen von Schmerzen (eingeschränkter Mobilität, gebeugte Gestalt, das Versagen der Bräutigam, Stimmgebung bei der Handhabung) gelöst haben.
6. Anästhesieren 6- bis 8-Wochen--old weibliche athymische Nacktmäuse mit 2% Isofluran in Sauerstoff in einer Anästhesie Kammer. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Einklemmen des Schwanzes vollständig unter Narkose sind. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Übertragen Sie jede narkotisierten Maus auf einen einzelnen Bugnase für die Milz Injektion. Vor dem Einschnitt sollte jede Maus mit einem sterilen Operationstuch bedeckt sein.
7. Identifizieren Sie die Milz als einen violetten Bereich von außen durch die Haut auf der linken Flanke der Nacktmäuse gesehen. Mit microdissection Schere, machen eine 8 mm linke Flanke Einschnitt auf der Haut gerade über der Milz.
   1. Dann heben Sie auf der Bauchdecke und einen kleinen Schnitt machen. Damit Luft in die Bauchhöhle, so daß die inneren Organe von der Inzisionsstelle bewegen. Vergrößern Sie die Bauchdecke Schnitt auf etwa 5 mm.
   2. Setzen Sie die Milz vorsichtig mit einem Wattestäbchen Druck um den Einschnitt Anwendung. Bei Bedarf kann das Pankreas Fett Mann sanftipulated mit der Exposition zu helfen, um nicht die Milz zu verletzen.
8. injizieren langsam 100 & mgr; l Zellen mit einer 1 ml-Spritze mit einer 27 G-Nadel in die Spitze des freiliegenden Milz verwendet. Injizieren Sie langsam, über einen Zeitraum von mindestens 30 - 60 s, extraLeberTumoren zu vermeiden.
9. Legen Sie eine Mikroclip auf der Milz vor der Nadel am Ende der Injektion Entfernen Leckage des injizierten Zellsuspension zu verhindern.
10. Lassen Sie den Mikroclip an Ort und Stelle für 5 min.
11. 5 min Nacheinspritzung, führen Sie eine Splenektomie eine Hand Kauterisierungsvorrichtung zur Hämostase verwendet wird. Präparieren Sie die Milzhilus, von der vorderen Seite zu starten. Wenn große Gefäße Sezieren, pre-Koagulieren der proximalen Seite der Gefäße mit angrenzenden Fettgewebe, cautery Verwendung starke Blutungen zu vermeiden.
    HINWEIS: Methoden zur Hämostase: gerinnen die blutende Stelle direkt mit Kauter, für 3 Druck auf die blutende Stelle bewerben - 5 min oder Naht-abzubinden die blutende Stelle mit einem 5-0 Seidenkrawatte.
12. Schließen Sie den Flankenschnitt jeder Maus in zwei Schichten. Zuerst schließen Sie die Bauchdecke mit einem 5-0 resorbierbaren geflochtenen Naht (zB Vicryl) in einer einzigen horizontalen Stich. Als nächstes schließen Sie die Haut ein 4-0 nicht resorbierbaren Monofilamentnahtmaterial (zB Prolene), wiederum mit einer einzigen horizontalen Stich.
13. Reinigen Sie alle Instrumente, die von 70% Isopropanol Sprühen sterilen Bedingungen zwischen jedem Verfahren zu halten.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Tiere erwärmt werden, während sie aus der Narkose erwachen. Überwachen Sie alle Mäuse postoperativ, bis sie die ambulante werden und wieder in den normalen Aktivität. Typischerweise ist die Wiederherstellungszeit ca. 3 - 5 min. Lassen Sie keine Tiere unbeaufsichtigt, bis sie genügend Bewusstsein wiedererlangt haben Brustlage zu halten. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt hat.

5. In vivo - Biolumineszenz - Bildgebung

1. Führen Sie Abbildung aufwöchentlich wechselnde in Biolumineszenz im Laufe der Zeit zu messen und zu quantifizieren.
2. Platzieren Mäuse in einer Anästhesiekammer und anästhesieren sie mit 2% Isofluran in Sauerstoff. Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Kneifen die Schwänze vollständig unter Narkose sind. Verwenden Sie Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Als nächstes intraperitoneal jeder Maus mit 150 ul der vorgefertigtes injizieren Glühwürmchen-Luciferin aus Schritt 1.4.
4. Legen Sie die Mäuse in einem IVIS mit einzelnen Bugspitze Isofluran verabreicht wird. Legen Sie die Mäuse in der Rückenlage mit Abstandshalter zwischen das Signal an benachbarten Mäuse zu minimieren. Maximal fünf Mäuse können auf einmal abgebildet werden.
5. Messen und Biolumineszenz-Intensitäten 3 min nach dem Luciferin Injektion zu analysieren.
   1. Nach dem IVIS initialisiert, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben, wählen Sie "Leuchtende", "1 Sekunde" Belichtungszeit, und "Medium" Binning.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" imagin zu startenG. Stellen Sie sicher, jeder Abbildungs ​​bei einer konsistenten Zeit (3 min) nach dem Luciferin Einspritzung durchzuführen.
   3. Nachdem das Bild aufgenommen wird, wird ein Bildfenster und Werkzeugpalette angezeigt werden. Klicken Sie auf "ROI-Tools" und wählen Sie "1", "2", "3", "4" oder "5" aus dem Kreis-Symbol, entsprechend der Anzahl der Mäuse abgebildet.
   4. Um Regions of Interest (ROIs), umrunden den Signalbereich des Leuchtsignals in der Bauchhöhle der Maus zu definieren, und klicken Sie dann auf "Messungen" der ROI als eine beliebige Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm ² / Steradiant) / (& mgr; W / cm ^2)). Achten Sie darauf, einen zusätzlichen ROI Kreis Hintergrund zu haben.
6. Verwendung von Echtzeit-3D-Rekonstruktion von Biolumineszenz-Intensitäten einzelner Tumorkolonien Nach vier Wochen nach der Injektion und vor dem Tieropfer, führen Diffuse Lumineszenzlampen Imaging-Tomographie (DLIT) IVIS mit der Tumorbelastung und Verteilung zu bewerten.
   1. Anesthetize die Mäuse und Luciferin injizieren, als 5.2.4 in Schritt beschrieben. DLIT wird zu einem Zeitpunkt auf einer Maus durchgeführt.
   2. Nach dem IVIS Initialisierung, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben, wählen Sie "Imaging-Assistent", "Biolumineszenz", und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "DLIT" und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Firefly" Sonden und klicken Sie auf "Weiter". Wählen Sie "Maus" Bild Thema "Auto" Belichtungsparameter, "C-13 cm" Sichtfeld, und "0,5 cm" subject Höhe, und klicken Sie auf "Weiter". Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" Imaging zu starten.
   3. Nachdem das Bild aufgenommen wird, wählen Sie die "DLIT 3D-Rekonstruktion" Tab und die "Analyse" und klicken Sie "Rekonstruieren", um die 3D-Rekonstruktion Bild zu erzeugen.
   4. Klicken Sie auf "Extras" und "3D-Animation". Wählen Sie "Spin CCW auf der Y-Achse" in der 3D-Animationsfenster. Klicken Sie auf "Record" und "Speichern" in eine .mov-Format-Datei.

6. Ex - vivo - Fluoreszenz - Bildgebung

1. Opfern, um die Mäuse durch Genickbruch während betäubt, oder gemäß gültiger Richtlinien bei 4 - 6 Wochen nach den Injektionen Milz.
2. Ernten Sie die Leber. Machen Sie einen horizontalen Schnitt von links nach rechts flankieren. Ergreifung des Xiphoidbasis mit einem Pickup, sezieren die falciform, die Lebervene und die untere Hohlvene.
   1. Präparieren Sie die richtige hepatorenal Band, das Ligamentum hepatoduodenale, und die linke hepatorenal Band, dabei nicht den Lobus caudatus zu verletzen, während das Ligamentum hepatoduodenale sezieren. Nach der Leber Ernte, entfernen Sie die Gallenblase, da dies Autofluoreszenz wird angezeigt. Notieren Sie alle zusätzlichen extraLeberTumoren vorhanden.
3. Beachten Sie die Anzahl und Größe von Lebertumoren vorhanden makroskopisch, und legen Sie die geernteten Lebern in DPBS.
   HINWEIS: Die Tumore sind makroskopisch sichtbar für das bloße Augeals weiße Tumore (für ein repräsentatives Beispiel, siehe Abbildung 4).
4. Vor der Platzierung auf dem Abbildungsblatt, nehmen Sie jede Leber und sanft überschüssige Flüssigkeit entfernen, indem Sie auf einem Papiertuch abtupfen.
5. Messen Sie die Fluoreszenzintensitäten von jedem Tumor Kolonie des IVIS verwendet wird.
   1. Wählen Sie "Fluoreszenz", "4 Sekunden" Belichtungszeit "Medium" Binning "2" F / Stop, "535" Anregungsfilter und "580" Emissionsfilter. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Erfassen" Imaging zu starten.
   2. Nachdem das Bild zu erwerben, das Bildfenster und Werkzeugpalette finden. Klicken Sie auf "ROI-Tools" und wählen Sie "1" aus dem Kreis-Symbol. So definieren ROIs, umrunden den Signalbereich der einzelnen Tumorkolonien auf das Bild, und klicken Sie dann auf "Messungen" der ROI als eine beliebige Einheit der Strahlungswirkungsgrad ((Photonen / s / cm ² / Steradiant) / (& mgr; W / cm ²⁾ ). Achten Sie darauf, einen zusätzlichen ROI Kreis Hintergrund zu haben.
6. Berechnen Sie die gesamte Tumorvolumen durch die Annahme, es eine Kugel sein. Das Tumorvolumen = 4 x π xr ^3/3 (r = Radius). Berechnen des Anteils der Tumorkoloniebildenden Zellen (Fc), wenn die Anzahl von Tumoren in der Leber durch die Anzahl von Zellen unterteilt splenically injiziert.
7. Berechnen Sie die Gesamtzellzahl pro Kolonie (= X) aus der linearen Näherung aus Schritt 3.3. Berechnen Sie die Anzahl der Zellteilungen (= Y) als Y = ₂ X anmelden und die Td als Td (Tag) = 28 / Y.

Ergebnisse

Das Ziel dieses Experiments war es, eine kohärente und leicht reproduzierbare Tiermodell mit dem Potential für die serielle Quantifizierung des in vivo metastatischen Tumorlast und für die Abschätzung der Frequenz und Kolonisierung Wachstumskinetik der Entwicklung von Lebermetastasen herzustellen. Figuren 2-6, mit Legenden sind aus unserer früheren Veröffentlichung unter einer Creative Commons CC-BY - Lizenz ¹⁰ zur Verfügung gestellt.

Diskussion

Das Tiermodell im aktuellen Bericht dargestellt basiert auf zwei Hauptansätze. Erstens, um die Fähigkeit zu beobachten metastatic Klone mit unterschiedlichen Neigungen zu gewährleisten zu kolonisieren und in der Leber, eine Gruppe von sehr heterogenen monoklonalen Zelllinien wurde festgestellt, anstatt einer etablierten unfraktioniertem Krebszelllinie ^12,13 vermehren. Der monoklonale Ansatz Entwicklung zur Metastasierung wird durch die jüngsten genomischen Daten ¹⁴ gerechtfertigt und wurde erfo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System	Caliper Life Sciences	124262	In Vivo imaging system
LivingImage 4.0 Software	Caliper Life Sciences	128165	Imaging software
VAD-MGX Research Anesthetic Machine	Vetamac	VAD-MGX	Inhalation anesthesia machine
DMEM	Gibco	11965-118	Cell culture reagents
DPBS	Gibco	14190250	Cell culture reagents
Penicillin/Streptomycin, liquid (10,000 units penicillin;10,000 μg streptomycin)	Invitrogen	15140163	Cell culture reagents
HBSS	ThermoFisher	24020117	Cell culture reagents
Buprenex Injection (0.3 mg/mL)	Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.	12496-0757-5	Buprenorphine hydrochloride
Gemini Cautery System	Braintree Scientific	GEM 5917	Hand-held cautery for splenectomy
Micro Clip; Straight; 70 Grams Pressure; 1.5 mm Clip Width; 10 mm Jaw Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5426	Hemoclip: Hemostasis instruments after spleen injection
D-luciferin, potassium salt	Goldbio Technology	LUCK-1G	Luciferin potassium salt
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Reduced Serum Medium
TC20 Automated Cell Counter	BIO-RAD	1450102	Automatic cell counter
JMP10 software	SAS Institute		Data analysis software
BD FACSAria II cell sorter	BD Biocsiences		Cell sorter