多能干细胞衍生的心肌修复心肌细胞

摘要

我们提出三种新型和更有效的协议，用于人类诱导多能干细胞分化为心肌细胞，内皮细胞和平滑肌细胞，并且通过细胞注射补丁介导的细胞因子的递送组合提高移植细胞的植入的递送方法。

摘要

人类诱导多能干细胞（人iPS细胞）必须充分分化为给药前的特定细胞类型，但常规协议分化人iPS细胞为心肌细胞（hiPSC-CMS），内皮细胞（hiPSC-ECS）和平滑肌细胞（SMC）常常由低收率，纯度和/或表型稳定性差的限制。这里，我们提出用于产生hiPSC-CMS，-ECs是基本上比传统方法更有效的新颖的协议，和-SMCs，以及用于细胞注射超过施用部位产生一个含有细胞因子的贴剂组合的方法。贴剂提高了注射细胞的同时保留，通过密封针轨道，以防止细胞从被挤出心肌，和细胞存活，通过在较长时间内释放胰岛素样生长因子（IGF）。在心肌缺血再灌注损伤的猪模型，植入率超过两倍大于当细胞与含细胞因子的贴剂比较的细胞而不补丁，和治疗与细胞和贴片都施用，但不能与单独的细胞，用心脏功能和梗塞大小显著改善有关。

引言

人类诱导多能干细胞（人iPS细胞）是用于再生细胞治疗的最有前途的试剂中，因为它们可以分化成不由病人的免疫系统拒绝的细胞的潜在无限范围和数量。然而，它们的自我复制和分化能力也能导致肿瘤的形成，因此，人iPS细胞需要充分分化成特定的细胞类型，如心肌细胞（CMS），内皮细胞（EC），和平滑肌细胞（SMC ），给药前。之一的细胞给药的最简单和最常用的方法是直接的心肌内注射，但是这是由天然心肌组织嫁接移植细胞的数量是非常低的。许多这种消耗可以归因于缺血组织的细胞毒性的环境;然而，当鼠胚胎干细胞（ESC）是直接注入未受损伤心中的心肌Ó交付被保留为3-5小时^1，这表明施用的细胞的相当比例退出给药部位，这可能是因为它们是由过程中产生的高压通过针轨道挤出5百万细胞的唯一一句〜40％心肌收缩。

这里，我们提出新颖的和基本上更有效的方法，用于产生hiPSC衍生的心肌^{（hiPSC-CMS）2，}内皮细胞^{（hiPSC-ECS）3，}和平滑肌细胞^{（SMC）4。}值得注意的是，此hiPSC-SMC协议是第一模仿广泛的通过引导细胞向一个主要合成的或收缩的SMC表型在体平滑肌⁵观察到的形态和功能特征。我们还提供细胞递送的方法，其通过创建一个含有细胞因子的血纤维蛋白p提高注射细胞的植入率ATCH在注射部位。补丁似乎改善两种细胞保留，通过密封针轨道，以防止细胞从离开心肌，和细胞存活，通过在一段至少三天的释放胰岛素样生长因子（IGF）。

研究方案

所有的实验过程符合阿拉巴马大学伯明翰大学的动物指导进行。

1.区分iPS细胞成hiPSC-CMS

1. 外套预冷生长因子减少的凝胶状蛋白混合物6孔板于4℃过夜的孔中。吸使用前胶状蛋白质混合物。在5％CO ₂和37℃下在mTeSR1介质补充有10μM的ROCK抑制剂播种人iPS细胞到预涂覆板，和培养的细胞（每孔1×10 ^5个细胞）。
2. 每日刷新介质直到细胞达到90％汇合;然后，生长因子减少的胶状蛋白质混合物添加到培养基（0.5毫克胶状蛋白质每6孔板混合物，每孔2毫升培养基），并培养所述细胞为5％的CO ₂和37℃两天。
   1. 要更换介质，轻轻地从经真空培养皿与吸出培养基出触摸的细胞，并使用移液管添加新介质。
3. 通过更换用补充有RPMI1640培养基培养基引发分化生长因子减少的凝胶状蛋白混合物，B27没有胰岛素，和100ng / ml的激活素A;培养的细胞在5％CO ₂和37℃下24小时。
4. 替换已补充有B27没有胰岛素的RPMI1640培养基，10纳克/毫升的骨形态发生蛋白4（BMP-4），和10ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的介质;培养的细胞在5％CO ₂和37℃下96小时。
5. 替换用RPMI1640培养基补充有B27培养基并继续培养细胞在5％CO ₂和37℃;刷新介质每3天。
6. 观察开始分化后，在显微镜下收缩细胞〜3天的簇。收集集群后〜7天观察第一收缩和Hanks平衡盐溶液洗。
   1. 分离聚集细胞在板在含100U / ml胶原酶IV 10分钟，在37ºC轻轻摇动Hanks缓冲液培养他们。然后，5分钟加入乙二胺四乙酸（EDTA）0.25％胰蛋白酶。
   2. 中和用在RPMI / B27培养基10％胎牛血清的酶溶液中，然后悬浮细胞在RPMI / B27培养基。
   3. 由血球计数细胞的数目。培养在5％CO ₂和37℃至少3小时10 cm的培养皿的细胞中，这将允许非心肌细胞粘附于培养皿的表面上。
7. 收集细胞悬浮液，其中包含hiPSC-CMS，并通过在凝胶状蛋白质混合物涂覆的表面培养它们维持细胞（约1×10 ⁶每10cm培养皿的细胞）。

2.区分iPS细胞成hiPSC-ECS

1. 通过培养第解离hiPSC人口成单个细胞时间与在5％CO ₂和37℃5分钟螯合剂。转移细胞到含新鲜mTeSR1培养基15ml离心管中。
2. 降速细胞在200×g离心5分钟。重悬在补充有10微米ROCK抑制剂在mTeSR1培养基中的细胞。确定与血球细胞密度。
3. 加入250微升20 NIH单位/ ml凝血酶溶液至24孔板的一个孔中。
4. 加1×10 ⁶人iPS细胞以250微升12.5毫克/毫升纤维蛋白原溶液。与250微升的含细胞的纤维蛋白原溶液添加到凝血酶加载好。观察混合物固化以形成分钟内含hiPSC纤维蛋白支架。
5. 传送固化，含细胞的支架与盖玻璃镊子一个6孔板的孔中，和通过培养补充有没有胰岛素的2％B27在2ml EBM2培养基支架发起分化，激活素A（50毫微克/毫升）和BMP-4在5％的CO（25毫微克/毫升）24小时 2℃和37℃。
   1. 轻轻吸出经真空旧媒体不接触电池更换培养基。添加补充有B27没有胰岛素新EBM2培养基，血管内皮生长因子（VEGF，50纳克/毫升），促红细胞生成素（EPO，100纳克/毫升），和转化生长因子β1（TGFβ1，10纳克/毫升）中，并培养_的 CO ₂和37℃下48小时的支架为5％。
   2. 刷新培养基和培养在5％CO ₂和37℃另外48小时的支架;然后，加入200单位胶原酶IV（100单位/毫升）对介质释放从支架的细胞。
   3. 降速细胞之后发布。用补充有B27，VEGF-A（50毫微克/毫升）和SB-431542（10μM）的2％2毫升EGM2-MV培养基更换培养基;刷新介质每两天。
   4. 大约10天后（ 即在14〜分化日开始后），游离细胞用100 U / ml胶原酶IV，隔离ħiPSC的内皮细胞从通过流式细胞分化的细胞的种群分析了EC特异性标志蛋白的表达（ 例如 ^{，CD31，CD144）3。}
   5. 通过已建立的协议³展开隔离hiPSC-ECS。

3.区分iPS细胞成hiPSC，平滑肌细胞

1. 种子的人iPS细胞上已经涂覆有凝胶状蛋白质混合物，其板，以及培养中mTeSR1培养基中的细胞在5％CO ₂和37℃，用每日介质的变化，直到汇合（〜2天）。
2. 通过在RPMI1640培养基和2％B27加上胰岛素与CHIR99021（5μM）和BMP-4（10毫微克/毫升）培养细胞3天开始分化成中胚层谱系的细胞。
3. 为了生产hiPSC，校董会由于主要是合成型:
   1. 培养细胞VEGF-A（25纳克/毫升），成纤维细胞生长因子β（FGFβ，5毫微克/毫升）的RPMI1640我 dium和2％B27减去胰岛素在5％CO ₂和37℃下4天。
   2. 培养细胞中的VEGF-A（25毫微克/毫升），FGFβ（5毫微克/毫升）的RPMI1640培养基，2％B27加上胰岛素在5％CO ₂和37 °下进行2天。
   3. 培养的细胞在血小板衍生的生长因子β（PDGFβ，10纳克/毫升），TGFβ（3纳克/ ml）的RPMI1640培养基，2％B27加上胰岛素在5％CO ₂和37 °下进行4天。
4. 为了生产hiPSC-校董会与主要收缩型:
   1. 培养的细胞在RPMI1640 4天的VEGF-A（25毫微克/毫升）和FGFβ（5毫微克/毫升）和2％B27减去胰岛素。
   2. 培养的细胞在RPMI1640和2％B27加上胰岛素7天PDGFβ（5毫微克/毫升）和TGFβ（2.5纳克/毫升）。
5. 通过在含有〜6天RPMI1640代谢平台乳酸盐（4毫摩尔）培养细胞纯化的最终hiPSC-SMC的人群。

jove_title"> 4。创建的含IGF的微球

1. 热橄榄油在水浴45℃。
2. 保温5毫升10％的明胶溶液至50℃。
3. 明胶加入橄榄油，搅拌，然后通过加入冰水浴快速冷却到5℃。
4. 二十五分钟后，冷却（4℃）丙酮添加到橄榄油以诱导形成微球。
5. 保持5温度 ℃下1小时;然后，收集微球，用预冷却的丙酮洗5次以除去橄榄油，并且允许它们风干，在4℃。
6. 悬浮的微球在70％乙醇和0.25％戊二醛溶液在4℃过夜以诱导交联，然后中和用100mM甘氨酸的混合物。
7. 负载的IGF成微球混合5毫克微球15微升蒸馏水含有5μg的IGF和0.1％牛血清白蛋白30分钟₂ O。

5.创建了损伤部位的修补程序和注射的细胞

1. 在1毫升的最低基本培养基（MEM）一起暂停hiPSC衍生的CMS（2元），平滑肌细胞（100万），和ECS（100万）。
2. 暂停在1ml的纤维蛋白原溶液（25毫克/毫升）5毫克微球。
3. 填充一个针筒与含细胞溶液，用纤维蛋白原/微球体溶液另一注射器，并用1ml的凝血酶溶液的第三注射器（80 NIH单位/ ml，补充有2微升400mM的_氯化钙和200mM的ε氨基己酸）。
4. 通过左前为²如前所述冠状动脉前降支结扎手术诱发心肌梗死心脏的猪。
   注:简单地说，女性约克夏猪（〜13千克，45日龄）的镇静与Telazol /甲苯噻嗪（4.4毫克/千克）的肌内注射，并用异氟烷（0.5-5％）全身麻醉下插管。 A 4 ^日 interc执行ostal开胸手术，左冠状动脉前降支被暴露。冠状动脉被结扎60分钟闭塞，然后结扎被除去。立即电除颤在室颤的情况下进行的。
5. 猪心脏的梗死区的心外膜无菌塑料圈（约2.5厘米）的位置，然后同时注入微球/纤维蛋白原和凝血酶的解决方案成环。
6. 允许该混合物凝固（〜30秒），然后通过固化的混合物插入含细胞注射器的针头插入梗死心肌和注入细胞。关闭肌肉层，皮下组织，与胸壁与取决于动物大小3-0或2-0 Monocryl缝线。丁丙诺啡0.01-0.02毫克/公斤肌注，每8小时将用于控制疼痛为手术后的第3天。
7. 使用心脏磁共振评估心脏功能之前的外科手术，一周和手术过程^2，3，4四周后成像（MRI）。最终MRI研究后，牺牲动物和处理他们的组织学和分子分析^2，3，4心。

结果

差异化hiPSC-CMS，-ECs和-SMCs表征

人iPS细胞的鉴别能力进行了评价^2，3，4。流式细胞仪分析肌钙蛋白T（cTnT）的表达表明，最终hiPSC-CM人口的纯度超过90％（ 图1A，1B，面板B1）。几乎所有的细胞中的表达的慢肌球蛋白重链（ 图1B，

讨论

hiPSC-CMS的改善的产量/纯度

为了区分人类干细胞到cms传统的协议通常是由低产量和纯度的限制;例如，通过珀分离和心体形成得到的hESC的CM的只是35-66％表达慢肌球蛋白重链或肌钙蛋白^6。分化hiPSC-CM群体的纯度可大幅增加通过选择已连接于启动子的报道基因的表达的CM-特异性蛋白^7，8，9，但这...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H