תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

Summary

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

Abstract

תאים אנושיים המושרה גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) חייב להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים לפני הממשל, אך פרוטוקולים קונבנציונאלי להבחנה hiPSCs לתוך cardiomyocytes (hiPSC-CMS), תאי אנדותל (hiPSC-ECS), ותאי שריר חלק (SMCs) הם בדרך כלל מוגבל על ידי תשואה, טוהר נמוך, ו / או יציבות פנוטיפי עניה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולי רומן להפקה hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs כי הם משמעותיים יותר יעילים מאשר שיטות קונבנציונליות, כמו גם שיטה משלבת הזרקת תא עם טלאי ציטוקינים המכילים נוצרו על האתר של ממשל. המדבקה משפר הן את שימור של התאים מוזרקים, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני סחט של שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה ארוכה. במודל החזירים של פגיעה איסכמיה-רה-פרפוזיה בשריר הלב, קצב engraftment היה יותר משני-לקפל יותר כאשרתאים נוהלו עם המדבקה המכיל ציטוקינים בהשוואה לתאים ללא תיקון, וטיפול בשני התאים ואת התיקון, אך לא עם התאים לבד, היה קשור לשיפור בתפקוד לב וגודל אוטם.

Introduction

אדם מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (hiPSCs) הם בין סוכני המבטיחים ביותר עבור טיפול בתאי משובים כי הם יכולים להיות מובחנים לתוך מגוון בלתי מוגבל פוטנציאל וכמות התאים שאינם נדחה על ידי המערכת החיסונית של החולה. עם זאת, את יכולת שכפול עצמי והבחנה יכול גם להוביל להיווצרות גידולים, וכתוצאה מכך, hiPSCs צריך להיות מובחן במלואו לתוך סוגי תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes (CMS), תאי האנדותל (EC), ותאי שריר חלק (SMCs ), לפני מתן. אחת השיטות הפשוטות והנפוצות ביותר של ממשל תא הוא הזרקת intramyocardial ישירה, אך מספר תאים מושתלים כי הם engrafted ידי רקמת שריר לב הוא היליד נמוך באופן חריג. הרבה התשה זו ניתן לייחס לסביבה ציטוטוקסיות של הרקמה איסכמי; עם זאת, כאשר תאי גזע בעכברים עובריים (ESCs) מוזרקים היו ישירות לתוך שריר הלב של לב וללא כל פגע, only ~ 40% של 5 מיליון התאים נמסרים נשמרו במשך 3-5 שעות ^1, אשר טוענת כי חלק ניכר של התאים המנוהלים יצא אתר הממשל, אולי משום שהם היו סחטו דרך מסלול המחט ידי בלחצים הגבוהים הנוצרים במהלך התכווצות שריר הלב.

כאן, אנו מציגים שיטות חדשניות והרבה יותר יעילות להפקה cardiomyocytes hiPSC הנגזרת (hiPSC-CMS) ^2, תאי אנדותל (hiPSC-ECS) ^3, ותאי שריר חלק (SMCs) ^4. יש לציין, פרוטוקול hiPSC-SMC זה הוא ראשון לחקות את המגוון הרחב של מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים שנצפו סומטיים SMCs ⁵ על ידי הפניית התאים כלפי פנוטיפ SMC סינטטי או תנועתיים בעיקרה. כמו כן אנו מספקים שיטה של ​​משלוח תא המשפר את קצב engraftment של התאים מוזרקים על ידי יצירת p הפיברין המכילים ציטוקיניםAtch על הזריקה. המדבקה מופיע כדי לשפר הן החזקת התא, על ידי איטום המסלול מחט כדי למנוע את התאים מפני היציאה שריר הלב, והישרדות התא, על ידי שחרור גורם גדילה דמוי אינסולין (IGF) על פני תקופה של שלושה ימים לפחות.

Protocol

כל הפרוצדורות מבוצעות בהתאם להנחיות בעלי חיים מאוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם.

1. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-CMS

1. מעיל הבארות של צלחת 6-היטב עם תערובת חלבונים דביקות מראש מקורר צמיחה פקטור-מופחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. לשאוב את תערובת חלבונים הדביקה לפני השימוש. זרעי hiPSCs לצלחות מראש מצופה, ותרבות התאים (1 x 10 ⁵ תאים לכל טוב) ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס mTeSR1 תוספת בינונית עם מעכב ROCK 10 מיקרומטר.
2. רענן המדיום יומי עד התאים מגיעים 90 מפגש%; אז, להוסיף תערובת חלבונים דביקה-מופחת צמיחת פקטור אל (תערובת חלבונים דביקה 0.5 מ"ג לכל צלחת 6-היטב, 2 בינוני מיליליטר לכל טוב) הבינונית, ותרבות התאים למשך 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס ימים נוספים.
   1. כדי להחליף את המדיום, בעדינות למצוץ את מדיום מצלחת פטרי באמצעות ואקום עםנגיעת התאים החוצה, ולהוסיף מדיום חדש בעזרת פיפטה העברה.
3. ליזום בידול על ידי החלפה הבינונית עם בינוני RPMI1640 בתוספת-גורם גדילה מופחת תערובת חלבונים דביקה, B27 ללא אינסולין, ו -100 ng / ml Activin A; תרבות התאים ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
4. החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 כי כבר השלימו עם B27 ללא אינסולין, 10 ng / morphogenic העצם מ"ל חלבון 4 (BMP-4), ו -10 גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי ng / ml (bFGF); תרבות התאים ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס במשך 96 שעות.
5. החלף בינוני עם בינוני RPMI1640 בתוספת B27 ולהמשיך תרבות התאים ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס; לרענן את בינונית כל 3 ימים.
6. שימו לב אשכולות להידבקות התאים תחת המיקרוסקופ ~ 3 ימים ממועד קבלת בידול. אסוף את האשכולות ~ 7 ימים לאחר התבוננות התכווצויות ראשונה ולשטוף אותם הנקס מאוזן תמיסת מלח.
   1. לנתק את התאים-התקבצו את הצלחת על ידי דוגרים אותם במאגר הנקס המכיל 100 U / IV collagenase מ"ל במשך 10 דקות ב 37 ºC עם רעד עדין; אז, להוסיף טריפסין 0.25% בחומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) במשך 5 דקות.
   2. לנטרל את פתרון האנזים עם בסרום שור עוברי 10% בטווח בינוני RPMI / B27 ואז resuspend תאים במדיום RPMI / B27.
   3. ספירת התאים על ידי hemocytometer. התרבות התאים על צלחות 10 ס"מ ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 3, אשר יאפשר את התאים הלא-cardiomyocyte לדבוק פני השטח של המנה תרבות.
7. אסוף את ההשעיה תא, אשר מכיל את hiPSC-CMS, ולשמור על תאים (בסביבות 1 x 10 ⁶ תאים לכל 10 ס"מ צלחת) על ידי culturing אותם על משטח מצופה תערובת חלבונים דביקות.

2. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-ECS

1. לנתק את אוכלוסיית hiPSC לתוך תאים בודדים ידי דוגרי הem עם chelating סוכן ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מעביר את תאי צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר המכיל בינוני mTeSR1 טרי.
2. ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות. Resuspend התאים בינוני mTeSR1 בתוספת 10 מיקרומטר מעכב ROCK. לקבוע את צפיפות התאים עם hemocytometer.
3. הוסף 250 μl של 20 יחידות NIH / פתרון תרומבין מ"ל אחד טוב של צלחת 24 גם.
4. הוסף 1 x 10 ⁶ hiPSCs 250 μl של פתרון פיברינוגן 12.5 מ"ג / מ"ל. ולהוסיף 250 μl של פתרון פיברינוגן התא המכיל את תרומבין טעון היטב. שים את התערובת לחזק להקים פיגום הפיברין המכיל hiPSC בתוך דקות.
5. מעבירים את הקרושה, פיגומים התא המכיל לתוך הבארות של צלחת 6-היטב עם מלקחיים מכסה זכוכית, וליזום בידול על ידי culturing הפיגומים ב 2 מ"ל בינוני EBM2 בתוספת 2% B27 ללא אינסולין,-A Activin (50 ng / מ"ל), ו- BMP-4 (25 ng / ml) עבור 24 שעות ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
   1. החלף את המדיום ידי ומוצץ את המדיום הישן בעדינות באמצעות ואקום בלי לגעת תאים. הוסף בינוני EBM2 חדש בתוספת B27 ללא אינסולין, גורם (vascular endothelial growth VEGF, 50 ng / ml), אריתרופואטין (EPO, 100 ng / ml), ו β1 גורם גדילה הפיכה (TGFβ1, 10 ng / ml), ותרבות פיגומים ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
   2. רענן המדיום ותרבות הפיגומים ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס במשך 48 אחר שעה; אז, שחרר את התאים מן הפיגום על ידי הוספת 200 IV collagenase U (100 U / ml) למדיום.
   3. ספין למטה התאים לאחר פרסומם. החלף בינוני עם 2 מ"ל בינוני EGM2-MV בתוספת 2% של B27,-A VEGF (מ"ל / 50 נ"ג), ו SB-431,542 (10 מיקרומטר); לרענן את בינונית כל יומיים.
   4. כ -10 ימים לאחר מכן (כלומר, על ~ יום 14 לאחר בידול יזמה), לנתק את התאים עם 100 U / IV collagenase מ"ל, לבודד hiPSC-ECS מקרב אוכלוסיית תאים מובחנים באמצעות-cytometry זרימה מנתח עבור ביטוי של חלבונים סמן ספציפי EC (למשל, CD31, CD144) ^3.
   5. הרחב את hiPSC-ECS המבודדת באמצעות פרוטוקול ³ הוקם.

3. ההתמיינות hiPSCs לתוך hiPSC-SMCs

1. זרעי hiPSCs לצלחות כי כבר מצופות תערובת חלבונים דביקה, ותרבות התאים הבינוני mTeSR1 ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס, עם שינויים בינוניים יומיים, עד ומחוברות (~ 2 ימים).
2. ליזום בידול לתאי השושלת mesodermal ידי culturing התאים עם CHIR99021 (5 מיקרומטר) ו- BMP-4 (10 ng / ml) במדיום RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין במשך 3 ימים.
3. כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ סינתטי בעיקר:
   1. התרבות התאים עם-A VEGF (מ"ל / 25 נ"ג), β גורם גדילה פיברובלסטים (FGFβ, 5 ng / ml) ב RPMI1640 לי dium, ואינסולין מינוס 2% B27 ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים.
   2. התרבות התאים-A VEGF (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) במדיום RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO ₂ ו -37 ° צלזיוס למשך 2 ימים.
   3. תרבות תאי β גורם גדילה הנגזרות טסיות (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ (3 ng / ml) ב RPMI1640, ו -2% B27 בתוספת אינסולין 5% CO ₂ ו -37 ° צלזיוס למשך 4 ימים.
4. כדי לייצר hiPSC-SMCs עם פנוטיפ התכווצות בעיקר:
   1. התרבות התאים במשך 4 ימים עם-A VEGF (25 ng / ml) ו FGFβ (5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 מינוס אינסולין.
   2. התרבות התאים למשך 7 ימים עם PDGFβ (5 ng / ml) ו TGFβ (2.5 ng / ml) ב RPMI1640 ו -2% B27 בתוספת אינסולין.
5. לטהר את אוכלוסיות hiPSC-SMC הסופי על ידי culturing התאים לקטט (4 מ"מ) המכיל בינוני מטבולית RPMI1640 עבור ~ 6 ימים.

jove_title "> 4. יצירת מיקרוסכמות IGF-המכיל

1. זית מחממים שמן ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
2. מקצה 5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 10% ל -50 מעלות צלזיוס.
3. מוסיפים את הג'לטין אל שמן, מערבבים זית, ולאחר מכן לצנן במהירות עד 5 מעלות צלזיוס על ידי הוספת קרח על אמבט מים.
4. עשרים וחמש דקות מאוחר יותר, להוסיף מצונן (4 ° C) אצטון על שמן זית כדי לגרום להיווצרות microsphere.
5. לשמור על טמפרטורה של 5 מעלות צלזיוס במשך שעה 1; אז, לאסוף את microspheres, לשטוף אותם 5 פעמים עם אצטון מראש מקורר כדי להסיר את שמן הזית, ולאפשר להם אוויר יבש על 4 מעלות צלזיוס.
6. Resuspend את microspheres בתמיסה של אתנול 70% ו glutaraldehyde 0.25% לילה בשעה 4 ° C. כדי לגרום cross-linking, ולאחר מכן לנטרל את התערובת עם 100 גליצין מ"מ.
7. IGF טען לתוך microspheres ידי ערבוב 5 microspheres מ"ג עם 15 μl מזוקקים H ₂ O המכיל IGF 5 מיקרוגרם ו -0.1% אלבומין בסרום שור למשך 30 דקות.

5. יצירת הרטייה על האתר של פציעה ו הזרקת התאים

1. להשעות את CMS הנגזרות hiPSC (2 מיליון), SMCs (1 מיליון), ו ECS (1 מיליון) יחד 1 מ"ל מינימום בינוני Essential (MEM).
2. להשעות 5 מ"ג של microspheres בתמיסה 1 מ"ל פיברינוגן (25 מ"ג / מ"ל).
3. מלאו מזרק אחד עם תמיסה המכילה תאים, מזרק אחר עם הפתרון פיברינוגן / microsphere, ומזרק השלישי עם 1 מ"ל של תמיסת תרומבין (80 יחידות NIH / מ"ל, בתוספת 2 μl 400 מ"מ CaCl ₂ ו -200 מ"מ ε-aminocaproic חוּמצָה).
4. בניתוח לגרום לאוטם שריר הלב בלב החזירים באמצעות קשירת השמאלי הקדמי היורד לב כלילית כפי שתואר קודם לכן ^2.
   הערה: בקיצור, החזירים יורקשייר נקבה (~ 13 ק"ג, 45 ימים של גיל) מורדמים עם זריקה תוך שרירית של Telazol / Xylazine (4.4 מ"ג / ק"ג), חובר לצינור בהרדמה כללית עם isoflurane (0.5-5%). A 4 ^th intercפתיחת בית החזה ostal מתבצע והשאיר הקדמי היורד לב כלילית חשופה. העורק הכלילי הוא occluded ידי ליגטורה למשך 60 דקות ולאחר מכן המיתר מוסר. דפיברילציה חשמל מיידית מבוצעת במקרה של פרפור חדרים.
5. מקם טבעת פלסטיק סטרילית (~ 2.5 סנטימטרים) על epicardium האזור האוטם של לבבות חזירים, ולאחר מכן בעת ​​ובעונה אחת להזריק פתרונות microsphere / פיברינוגן תרומבין לזירה.
6. אפשר תערובת כדי לחזק (~ 30 שניות), ולאחר מכן להכניס את המחט של המזרק המכיל תאים באמצעות תערובת הקרושה לתוך שריר הלב אוטם ולהזריק את התאים. סגור את שכבות השריר, הרקמה התת עורית, ואת בית החזה עם 3-0 או 2-0 תפר Monocryl בהתאם לגודל החיה. עצירות 0.01-0.02 מ"ג / זריקה תוך שרירית ק"ג כל 8 שעות ישמש לשלוט בכאב עבור 3 הימים הראשונים לאחר הניתוח.
7. הערכת תפקוד הלב באמצעות תהודה מגנטית של הלבהדמיה (MRI) לפני הליך כירורגי, שבוע אחד וארבעה שבועות לאחר ההליך הכירורגי ^{2, 3, 4.} לאחר מחקרי MRI הסופיים, להקריב את החיה ולעבד לבם היסטולוגיה וניתוח מולקולרי ^{2, 3, 4.}

תוצאות

אפיון של הבדיל hiPSC-CMS, -ECs, ו -SMCs

קיבולת ההפרש של hiPSCs הוערכה ^{2, 3, 4.} Cytometry זרימה ניתוח לב טרופונין T (cTnT) ביטוי מראים כי טוהר האוכלוסייה hiPSC-CM הסופי יכול...

Discussion

תשואה / טוהר משופר של hiPSC-CMS

פרוטוקולים קונבנציונליים להבחנה תא גזע אנושי לתוך CMS מוגבלים לעתים קרובות על ידי תשואה נמוכה וטוהר; למשל, רק 35-66% של hESC-CMS שהושגו באמצעות הפרדת Percoll היווצרות גוף לב הביעו שרשרת כבדת שרירן איטית או cTnT

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H