Pluripotenti cellule staminali derivate cellule cardiache per la riparazione del miocardio

Riepilogo

Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.

Abstract

Le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) devono essere completamente in tipi cellulari specifici prima della somministrazione, ma i protocolli convenzionali per differenziare hiPSCs in cardiomiociti (hiPSC-CMS), cellule endoteliali (hiPSC-ECS), e cellule muscolari lisce (SMC) sono spesso limitata dalla bassa resa, la purezza, e / o di scarsa stabilità fenotipica. Qui, presentiamo protocolli innovativi per generare hiPSC-CM, -ECs e -SMCs sostanzialmente più efficiente rispetto ai metodi convenzionali, come pure un metodo per combinare iniezione di cellule con una patch citochina contenente creato sul sito di somministrazione. La patch migliora sia la conservazione delle cellule iniettate, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule vengano spremuto fuori del miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo prolungato. In un modello suino di infarto del danno da ischemia-riperfusione, il tasso di attecchimento è stato più di due volte maggiore quando lacellule sono state somministrate con la patch citochina contenente confronto alle cellule senza patch, e il trattamento con entrambe le celle e la patch, ma non solo con le cellule, è stato associato a miglioramenti significativi nella funzione cardiaca e dimensioni dell'infarto.

Introduzione

cellule staminali pluripotenti umane indotta (hiPSCs) sono tra gli agenti più promettenti per la terapia cellulare rigenerativa perché possono essere differenziati in una gamma potenzialmente illimitato e quantità di cellule che non sono rifiutato dal sistema immunitario del paziente. Tuttavia, la loro capacità di auto-replicazione e differenziazione può anche portare alla formazione di tumori e, di conseguenza, hiPSCs bisogno di essere completamente differenziate in tipi cellulari specifici, come i cardiomiociti (CMS), cellule endoteliali (ECS), e le cellule muscolari lisce (SMC ), prima della somministrazione. Uno dei metodi più semplici e più comuni di somministrazione delle cellule è iniezione intramiocardico diretta, ma il numero di cellule trapiantate che sono innestato dal tessuto miocardico nativo è eccezionalmente bassa. Gran parte di questo attrito può essere attribuito per l'ambiente citotossico del tessuto ischemico; tuttavia, quando le cellule staminali embrionali murine (CES) sono state iniettate direttamente nel miocardio di cuori illesi, oolo ~ 40% dei 5 milioni di cellule consegnati sono stati conservati per 3-5 ore ^1, il che suggerisce che una parte sostanziale delle cellule somministrate usciti dal sito di somministrazione, forse perché sono stati espulsi attraverso il percorso dell'ago dalle alte pressioni prodotte durante contrazione del miocardio.

Qui, vi presentiamo nuovi metodi e sostanzialmente più efficienti per la generazione di cardiomiociti hiPSC-derivati (hiPSC-CMS) ^2, le cellule endoteliali (hiPSC-ECS) ^3, e cellule muscolari lisce (SMC) ^4. In particolare, questo protocollo hiPSC-SMC è il primo a simulare la vasta gamma di caratteristiche morfologiche e funzionali osservate in somatica SMCs ⁵ indirizzando le cellule verso un fenotipo prevalentemente sintetico o contrattile SMC. Forniamo anche un metodo di consegna cellula che migliora il tasso di attecchimento di cellule iniettate creando una citochina contenente fibrina pATCH sul sito di iniezione. Il cerotto sembra migliorare sia la ritenzione cellulare, sigillando la traccia dell'ago per evitare che le cellule dalla esistente miocardio, e la sopravvivenza cellulare, rilasciando fattore di crescita insulino-simile (IGF) per un periodo di almeno tre giorni.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono eseguite in conformità con le linee guida animali della University of Alabama a Birmingham.

1. Differenziazione hiPSCs in hiPSC-CMS

1. Cappotto dei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con pre-raffreddata fattore di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa a 4 ° C per tutta la notte. Aspirare miscela proteica gelatinosa prima dell'uso. Seed i hiPSCs sulle piastre pre-verniciato, e la cultura nelle cellule (1 x 10 ⁵ cellule per pozzetto) al 5% di CO ₂ e 37 ° C in mTeSR1 supplemento mezzo con inibitore ROCK 10 micron.
2. Aggiornare la media giornaliera fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza; poi, aggiungere fattore di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa al mezzo (miscela 0,5 mg gelatinosa proteine per 6 pozzetti, 2 ml di mezzo per pozzetto), e la cultura le cellule per 5% di CO ₂ e 37 ° C altri due giorni.
   1. Per sostituire il mezzo, delicatamente succhiare il mezzo dalla capsula di Petri con sottovuotoout toccare le cellule, e aggiungere nuovo mezzo utilizzando una pipetta di trasferimento.
3. Avviare differenziazione sostituendo il mezzo con il mezzo RPMI1640 supplementato con fattori di crescita ridotto miscela proteica gelatinosa, B27 senza insulina, e 100 ng / ml Activin A; cultura le cellule a 5% di CO ₂ e 37 ° C per 24 ore.
4. Sostituire il mezzo con il mezzo RPMI1640 che è stato integrato con B27 senza insulina, 10 ng / ml proteina ossea morfogenetica 4 (BMP-4), e 10 Fattore ng / ml base di crescita dei fibroblasti (bFGF); cultura le cellule a 5% di CO ₂ e 37 ° C per 96 ore.
5. Sostituire il supporto con il mezzo RPMI1640 integrato con B27 e continuare la cultura le cellule a 5% di CO ₂ e 37 ° C; aggiornare il mezzo ogni 3 giorni.
6. Osservare gruppi di contrarre le cellule sotto il microscopio ~ 3 giorni dopo l'inizio della differenziazione. Raccogliere i cluster ~ 7 giorni dopo la prima osservazione contrazioni e lavarli in Hanks soluzione salina bilanciata.
   1. Dissociare il cellule raggruppate nella piastra incubandoli in tampone Hanks contenente 100 U / ml di collagenasi IV per 10 min a 37 ° C con delicata agitazione; quindi, aggiungere 0,25% tripsina in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 5 min.
   2. Neutralizzare soluzione enzimatica con il 10% di siero fetale bovino in RPMI medio / B27 e risospendere le cellule in medium / B27 RPMI.
   3. Contare il numero di cellule emocitometro. Culture cellule sui piatti 10 cm al 5% di CO ₂ e 37 ° C per almeno 3 ore, che consentano alle cellule non cardiomiociti ad aderire alla superficie del piatto cultura.
7. Raccogliere la sospensione cellulare, che contiene il hiPSC-CM, e mantenere le cellule (circa 1 x 10 ⁶ cellule per 10 cm Piatto) da essi coltura su una superficie Rivestiti miscela proteica gelatinosa.

2. Differenziare hiPSCs in hiPSC-EC

1. Dissociare la popolazione hiPSC in singole cellule incubando °em con chelanti agente al 5% di CO ₂ e 37 ° C per 5 min. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente mezzo mTeSR1 fresco.
2. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno mTeSR1 integrato con inibitore ROCK 10 micron. Determinare la densità cellulare con un emocitometro.
3. Aggiungere 250 ml di 20 unità NIH / ml soluzione di trombina ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
4. Aggiungere 1 x 10 ⁶ hiPSCs a 250 microlitri di una / soluzione di fibrinogeno ml 12,5 mg. E aggiungere i 250 ml di soluzione di fibrinogeno cella contenente la trombina-caricato bene. Osservare la miscela solidificare per formare una impalcatura di fibrina hiPSC contenenti all'interno di min.
5. Trasferire i, ponteggi cellule contenenti solidificati nei pozzetti di una piastra da 6 pozzetti con la pinza di vetro di copertura, e avviare la differenziazione coltivando i ponteggi in 2 ml di mezzo EBM2 integrato con il 2% B27 senza insulina, activin-A (50 ng / ml), e BMP-4 (25 ng / ml) per 24 ore a 5% CO 2 e 37 ° C.
   1. Sostituire il mezzo attraverso delicatamente succhiando il mezzo di vecchia via del vuoto senza toccare le cellule. Aggiungere nuovo mezzo EBM2 integrato con B27 senza insulina, fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF, 50 ng / ml), eritropoietina (EPO, 100 ng / ml), e trasformando β1 fattore di crescita (TGFβ1, 10 ng / ml), e la cultura ponteggi a 5% di CO ₂ e 37 ° C per 48 ore.
   2. Aggiornare medio e coltura scaffold al 5% di CO ₂ e 37 ° C per altre 48 ore; quindi, rilasciare le cellule dal scaffold aggiungendo 200 U collagenasi IV (100 U / ml) al mezzo.
   3. Spin giù le cellule dopo che sono stati rilasciati. Sostituire il mezzo con 2 ml di mezzo EGM2-MV supplementato con 2% di B27, VEGF-A (50 ng / ml), e SB-431.542 (10 mM); aggiornare il mezzo ogni due giorni.
   4. Circa 10 giorni dopo (cioè, il ~ 14 ° giorno dopo la differenziazione stato avviato), dissociare le cellule con 100 U / ml di collagenasi IV, isolare hiPSC-EC dalla popolazione di cellule differenziate tramite citometria a flusso analizza per l'espressione di EC-specifiche proteine marker (ad esempio, CD31, CD144) ^3.
   5. Espandere l'isolato hiPSC-EC tramite un protocollo stabilito ^3.

3. Differenziare hiPSCs in hiPSC-SMC

1. Seed i hiPSCs su piatti che sono stati rivestiti con miscela proteica gelatinosa, e la cultura nelle cellule in terreno mTeSR1 al 5% di CO ₂ e 37 ° C, con variazioni medie giornaliere, fino confluenti (~ 2 giorni).
2. Avviare differenziazione in cellule mesodermal lineage-coltivando le cellule con CHIR99021 (5 mM) e BMP-4 (10 ng / ml) in terreno RPMI1640 e 2% B27 più insulina per 3 giorni.
3. Per produrre hiPSC-SMC con un fenotipo prevalentemente sintetico:
   1. Cultura le cellule con VEGF-A (25 ng / ml), fattore di crescita dei fibroblasti (β FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me dium e 2% B27 meno insulina al 5% di CO ₂ e 37 ° C per 4 giorni.
   2. Cultura le cellule in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in terreno RPMI1640 e 2% B27 più insulina al 5% di CO ₂ e 37 ° C per 2 giorni.
   3. Cultura le cellule β fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ (3 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 più insulina al 5% di CO ₂ e 37 ° C per 4 giorni.
4. Per produrre hiPSC-SMC con un fenotipo prevalentemente contrattile:
   1. Cultura le cellule per 4 giorni con VEGF-A (25 ng / ml) e FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 meno insulina.
   2. Cultura le cellule per 7 giorni con PDGFβ (5 ng / ml) e TGFβ (2,5 ng / ml) in RPMI1640 e 2% B27 più insulina.
5. Purificare le popolazioni finali hiPSC-SMC coltivando le cellule in lattato (4 mm) contenente RPMI1640 medio metabolica per ~ 6 giorni.

jove_title "> 4. Creare le microsfere IGF contenenti

1. olive calore olio a 45 ° C in un bagno d'acqua.
2. Calore 5 ml di soluzione di gelatina al 10% a 50 ° C.
3. Aggiungere la gelatina per l'olio d'oliva, mescolare, e poi rapidamente raffreddare a 5 ° C aggiungendo ghiaccio bagnomaria.
4. Venticinque minuti dopo, aggiungere refrigerata (4 ° C) acetone per l'olio di indurre la formazione microsfere.
5. Mantenere la temperatura a 5 ° C per 1 ora; poi, raccogliere le microsfere, lavarli 5 volte con acetone pre-raffreddata a rimuovere l'olio d'oliva, e lasciarli asciugare a 4 ° C.
6. Risospendere le microsfere in una soluzione di etanolo al 70% e lo 0,25% glutaraldeide notte a 4 ° C per indurre reticolazione e quindi neutralizzare la miscela con 100 mM glicina.
7. Carico IGF nelle microsfere miscelando 5 mg microsfere con 15 microlitri distillata H ₂ O contenente 5 mg IGF e lo 0,1% di albumina sierica bovina per 30 min.

5. Creare la patch sul sito di lesione e l'iniezione delle Cellule

1. Sospendere il hiPSC di derivazione CM (2 milioni), SMC (1 milione), e ECS (1 milione) insieme in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
2. Sospendere 5 mg di microsfere in 1 ml di soluzione di fibrinogeno (25 mg / ml).
3. Riempire una siringa con la soluzione di cellule contenente, un'altra siringa con la soluzione di fibrinogeno / microsfere, e una terza siringa con 1 ml di soluzione di trombina (80 unità NIH / ml, integrati con 2 microlitri 400 mM CaCl ₂ e 200 mM ε-aminocaproic acido).
4. Chirurgicamente indurre infarto del miocardio nel cuore suina tramite legatura delle discendente anteriore dell'arteria coronaria come descritto in precedenza ^2.
   NOTA: In breve, femmina Yorkshire suina (~ 13 kg, 45 giorni di età) sono sedati con l'iniezione intramuscolare di Telazol / xylazina (4,4 mg / kg), e intubati in anestesia generale con isoflurano (0,5-5%). Un 4 ^° interctoracotomia ostal viene eseguito e lasciato coronaria discendente anteriore è esposto. L'arteria coronarica è occlusa da una legatura per 60 minuti e poi la legatura viene rimosso. defibrillazione elettrica Immediatamente viene eseguita in caso di fibrillazione ventricolare.
5. Posizionare un anello di plastica sterile (~ 2,5 centimetri) sul epicardio della regione infartuata di cuori suini, e poi iniettare contemporaneamente le soluzioni microsfere / fibrinogeno e trombina sul ring.
6. Lasciare la miscela a solidificare (~ 30 sec), e quindi inserire l'ago della siringa cella contenente attraverso la miscela solidificata nel miocardio infartuato e iniettare le cellule. Chiudere gli strati muscolari, il tessuto sottocutaneo, e la parete toracica con 3-0 o 2-0 monocryl sutura a seconda delle dimensioni degli animali. Buprenorfina 0,01-0,02 mg kg iniezione / intramuscolare ogni 8 ore sarà utilizzato per controllare il dolore per i primi 3 giorni dopo l'intervento.
7. Valutare la funzione cardiaca utilizzando una risonanza magnetica cardiacaImaging (MRI) prima della procedura chirurgica, una settimana e quattro settimane dopo la procedura chirurgica ^{2, 3, 4.} Dopo gli studi di risonanza magnetica finali, sacrificare l'animale ed elaborare i loro cuori per istologia e analisi molecolare ^{2, 3, 4.}

Risultati

Caratterizzazione di differenziata hiPSC-CM, -ECs, e -SMCs

La capacità differenziale hiPSCs stati valutati ^{2, 3, 4.} Flusso analizza citometria di T (cTnT) espressione troponina cardiaca suggeriscono che la purezza della popolazione finale hiPSC-CM può superare il 90% (Figura 1A, 1B, pannello B1). Quasi...

Discussione

Migliorata la resa / purezza di hiPSC-CMS

protocolli convenzionali per differenziare le cellule staminali umane in CM sono spesso limitati da una bassa resa e la purezza; per esempio, solo 35-66% di hESC-CM ottenuto tramite Percoll separazione e la formazione del corpo cardiaco espresso lento catena pesante della miosina o cTnT ^6. La purezza delle popolazioni hiPSC-CM differenziate può essere sostanzialmente aumentata selezionando per l'espressione di un gene report...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H