Les cellules souches pluripotentes dérivées de cellules cardiaques pour réparation myocardique

Résumé

Nous présentons trois protocoles nouveaux et plus efficaces pour différencier les cellules souches pluripotentes humaines induites dans les cardiomyocytes, les cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses et une méthode de distribution qui permet d'améliorer la prise de greffe de cellules transplantées en combinant l'injection de cellules avec la livraison de cytokines pièce à médiation.

Résumé

Humaines induite par les cellules souches pluripotentes (hiPSCs) doivent être entièrement différenciées en types de cellules spécifiques avant l'administration, mais des protocoles classiques pour différencier hiPSCs en cardiomyocytes (hiPSC-SGC), les cellules endothéliales (hiPSC-CEs), et les cellules musculaires lisses (CML) sont souvent limitée par un faible rendement, la pureté, et / ou une mauvaise stabilité phénotypique. Ici, nous présentons de nouveaux protocoles pour générer hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs qui sont sensiblement plus efficaces que les méthodes conventionnelles, ainsi qu'une méthode pour combiner l'injection de cellules avec un patch contenant une cytokine créée sur le site de l'administration. Le patch améliore à la fois la rétention des cellules injectées, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules d'être pressé hors du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période prolongée. Dans un modèle porcin d'infarctus lésions d'ischémie-reperfusion, le taux de prise de greffe était plus de deux fois plus élevée lorsque lales cellules ont été administrés avec le patch contenant les cytokines sont comparés aux cellules sans correction, et un traitement avec à la fois les cellules et le patch, mais non avec les cellules seules, a été associée à une amélioration significative de la fonction cardiaque et la taille de l'infarctus.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines induites (les hiPSCs) sont parmi les agents les plus prometteurs pour la thérapie cellulaire régénérative, car ils peuvent être différenciées en une gamme potentiellement illimitée et la quantité de cellules qui ne sont pas rejetées par le système immunitaire du patient. Cependant, leur capacité d'auto-réplication et la différenciation peut aussi conduire à la formation de tumeurs et, par conséquent, hiPSCs doivent être pleinement différenciées en types de cellules spécifiques, tels que les cardiomyocytes (SGC), les cellules endothéliales (EC), et les cellules musculaires lisses (CML ), avant l'administration. Une des méthodes les plus simples et les plus courantes de l'administration des cellules est l'injection intra-myocardique directe, mais le nombre de cellules transplantées qui sont greffées par le tissu myocardique natif est exceptionnellement bas. Une grande partie de cette attrition peut être attribuée à l'environnement cytotoxique du tissu ischémique; Cependant, lorsque les cellules souches embryonnaires murines (CES) ont été injectés directement dans le myocarde des cœurs indemnes, oeul ~ 40% des 5 millions de cellules livrées ont été retenus pendant 3-5 h ^1, ce qui suggère qu'une proportion importante des cellules administrées a quitté le site d'administration, peut - être parce qu'ils ont été évincés par la piste de l' aiguille par les hautes pressions produites au cours de la contraction du myocarde.

Ici, nous présentons des méthodes nouvelles et sensiblement plus efficaces pour générer cardiomyocytes hiPSC dérivés (hiPSC-SGC) ^2, les cellules endothéliales (hiPSC-CEs) ^3, et les cellules musculaires lisses (CML) ^4. Notamment, ce protocole hiPSC-SMC est le premier à imiter le large éventail de caractéristiques morphologiques et fonctionnelles observées dans somatique CML ⁵ en dirigeant les cellules vers un phénotype SMC essentiellement synthétique ou contractile. Nous fournissons également une méthode de livraison de cellules qui améliore le taux de cellules injectées de greffe en créant un contenant cytokine-fibrine pATCH sur le site d'injection. Le patch semble améliorer à la fois la rétention des cellules, en obturant la voie de l'aiguille pour empêcher les cellules de sortir du myocarde, et la survie des cellules, en libérant le facteur de croissance analogue à l'insuline (IGF), pendant une période d'au moins trois jours.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sont réalisées en conformité avec les lignes directrices animales de l'Université d'Alabama à Birmingham.

1. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CMs

1. Revêtir les puits d'une plaque à 6 puits avec un mélange de protéines gélatineux prérefroidie aux facteurs de croissance réduite à 4 ° C pendant une nuit. Aspirer le mélange de protéines gélatineux avant utilisation. Ensemencer les hiPSCs sur les plaques pré-revêtues, et la culture des cellules (1 x 10 ⁵ cellules par puits) à 5% de CO ₂ et 37 ° C en milieu mTeSR1 supplément avec un inhibiteur de ROCK 10 pm.
2. Actualiser le moyen quotidien jusqu'à ce que les cellules atteignent 90% de confluence; Ensuite, ajouter le mélange de protéines gélatineux facteurs de croissance réduite dans le milieu (mélange 0,5 mg gélatineux de protéines par plaque à 6 puits, 2 ml de milieu par puits) et culture des cellules pendant 5% de CO ₂ et 37 ° C encore deux jours.
   1. Pour remplacer le milieu, aspirer délicatement le moyen de la boîte de Pétri via vide avecà toucher les cellules, et ajouter un nouveau milieu à l'aide d'une pipette de transfert.
3. Initier la différenciation en remplaçant le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de facteurs de croissance réduit mélange protéique gélatineuse, sans B27 insuline et 100 ng / ml d'activine A; la culture des cellules à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 24 heures.
4. Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 qui a été complémenté avec B27 sans insuline, 10 ng / ml de protéine morphogénique de l'os 4 (BMP-4), et le facteur 10 ng / ml de croissance basique des fibroblastes (bFGF); la culture des cellules à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 96 heures.
5. Remplacer le milieu par du milieu RPMI1640 additionné de B27 et poursuivre la culture des cellules à 5% de CO ₂ et 37 ° C; rafraîchir le milieu tous les 3 jours.
6. Observer des amas de cellules contracter sous le microscope ~ 3 jours après le début de la différenciation. Recueillir les grappes ~ 7 jours après la première observation des contractions et les laver dans une solution saline équilibrée de Hanks.
   1. Dissocier les cellules groupées dans la plaque en les incubant dans un tampon Hanks contenant 100 U / ml de collagénase IV pendant 10 min à 37 ° C en agitant doucement; puis, ajouter 0,25% de trypsine dans de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pendant 5 min.
   2. Neutraliser la solution d'enzyme avec 10% de sérum de fœtus bovin dans du RPMI / moyen B27, puis remettre en suspension les cellules dans du milieu RPMI / B27.
   3. Comptez le nombre de cellules par hémocytomètre. Cultiver les cellules sur les boîtes de 10 cm à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant au moins 3 heures, ce qui permettra aux cellules non cardiomyocytes à adhérer à la surface de la boîte de culture.
7. Recueillir la suspension cellulaire, qui contient le hiPSC CMS et maintenir les cellules (environ 1 x 10 ⁶ cellules par boîte de 10 cm) en les cultivant sur une surface du mélange revêtu de protéine gélatineux.

2. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CEs

1. Dissocier la population hiPSC en cellules isolées par incubation them avec un agent chélateur à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 5 min. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant du milieu mTeSR1 frais.
2. Isoler les cellules à 200 xg pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans un milieu mTeSR1 complété avec un inhibiteur de ROCK 10 uM. Déterminer la densité de cellules avec un hémocytomètre.
3. Ajouter 250 ul de 20 unités NIH / ml de solution de thrombine à un puits d'une plaque à 24 puits.
4. Ajouter 1 x 10 ⁶ hiPSCs 250 pi d'un / ml de solution de fibrinogène de 12,5 mg. Et ajouter 250 ul de solution de fibrinogène contenant des cellules à la thrombine ainsi chargé. Observer le mélange se solidifie pour former une fibrine échafaudage contenant de hiPSC au sein min.
5. Transférer les, échafauds contenant des cellules solidifiées dans les puits d'une plaque à 6 puits avec la pince de verre de couverture, et d'initier la différenciation en cultivant les échafauds dans 2 ml de milieu EBM2 additionné de 2% B27 sans insuline, activine A (50 ng / ml) et la BMP-4 (25 ng / ml) pendant 24 heures à 5% de CO 2 et 37 ° C.
   1. Remplacez le support en suçant doucement l'ancien milieu par le vide sans toucher les cellules. Ajouter un nouveau milieu EBM2 additionné de B27, sans insuline, facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF 50ng / ml), l'érythropoïétine (EPO, 100 ng / ml) et en transformant β1 de facteur de croissance (TGFβ1, 10 ng / ml) et de la culture le échafauds à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 48 h.
   2. Actualiser le moyen et la culture les échafauds à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant encore 48 heures; puis libérer les cellules de l'échafaudage par l'addition de 200 U de collagénase IV (100 U / ml) au milieu.
   3. Isoler les cellules après leur libération. Remplacer le milieu par 2 ml de milieu EGM2-MV supplémenté avec 2% de B27, le VEGF-A (50 ng / ml), et le SB-431542 (10 uM); rafraîchir le milieu tous les deux jours.
   4. Environ 10 jours plus tard (soit le ~ Jour 14 après différenciation a été lancé), dissocier les cellules avec 100 U / ml de collagénase IV, isoler hiPSC-ECs de la population de cellules différenciées par cytométrie de flux analyse pour l'expression de protéines marqueurs EC-spécifiques (par exemple, CD31, CD144) ^3.
   5. Développez le isolé hiPSC-CEs via un protocole établi ^3.

3. Différencier hiPSCs dans hiPSC-CML

1. Ensemencer les hiPSCs sur des plaques qui ont été enrobées avec le mélange protéique gélatineuse, et la culture des cellules dans un milieu mTeSR1 à 5% de CO ₂ et 37 ° C, avec des changements de milieu tous les jours, jusqu'à la confluence (~ 2 jours).
2. Initier la différenciation en cellules mésodermiques lignée en cultivant les cellules avec CHIR99021 (5 uM) et BMP-4 (10 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l'insuline pendant 3 jours.
3. Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype essentiellement synthétique:
   1. La culture des cellules avec le VEGF-A (25 ng / ml), de β du facteur de croissance des fibroblastes (FGFβ, 5 ng / ml) dans du RPMI1640 moi dium et 2% de B27 insuline à moins de 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 4 jours.
   2. La culture des cellules dans VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) dans du milieu RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l' insuline à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 2 jours.
   3. La culture des cellules en β du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFß (3 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27 , ainsi que l' insuline à 5% de CO ₂ et 37 ° C pendant 4 jours.
4. Pour produire hiPSC-CML avec un phénotype contractile principalement:
   1. La culture des cellules pendant 4 jours avec le VEGF-A (25 ng / ml) et FGFβ (5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de moins B27 insuline.
   2. La culture des cellules pendant 7 jours avec PDGFβ (5 ng / ml) et de la TGFß (2,5 ng / ml) dans RPMI 1640 et 2% de B27, ainsi que l'insuline.
5. Purifier populations finales hiPSC-SMC en cultivant les cellules dans du lactate (4 mM) contenant du milieu RPMI 1640 métabolique pendant environ 6 jours.

jove_title "> 4. Création des microsphères contenant de l'IGF-

1. Chauffer l'huile d'olive à 45 ° C dans un bain d'eau.
2. Chauffer 5 ml d'une solution de gélatine à 10% à 50 ° C.
3. Ajouter la gélatine à l'huile d'olive, mélanger, puis refroidir rapidement à 5 ° C en ajoutant de la glace pour le bain d'eau.
4. Vingt-cinq minutes plus tard, ajouter réfrigérée (4 ° C), de l'acétone à l'huile d'olive pour induire la formation de microsphères.
5. Maintenir la température à 5 ° C pendant 1 heure; puis, recueillir les microsphères, les laver 5 fois avec de l'acétone pré-refroidie pour éliminer l'huile d'olive, et leur permettre de sécher à l'air à 4 ° C.
6. Remettre en suspension les microsphères dans une solution de 70% d'éthanol et 0,25% de glutaraldéhyde pendant une nuit à 4 ° C pour induire la réticulation, puis neutraliser le mélange avec de la glycine 100 mM.
7. La charge de l' IGF dans les microsphères par mélange de 5 mg de microsphères avec 15 ul de H ₂ O distillée contenant 5 ug d' IGF et 0,1% d' albumine de sérum bovin pendant 30 minutes.

5. Création du Patch sur le site de la blessure et l'injection des cellules

1. Suspendre le CMs hiPSC dérivé (2 millions), CML (1 million), et endothéliales (1 million), ainsi que dans 1 ml du milieu essentiel minimum (MEM).
2. Suspendre 5 mg de microsphères dans 1 ml de solution de fibrinogène (25 mg / ml).
3. Remplir une seringue avec la solution contenant des cellules, une autre seringue contenant la solution de fibrinogène / microsphère, et une troisième seringue avec 1 ml de solution de thrombine (80 unités NIH / ml, supplémenté avec 2 ul de 400 mM de _CaCl2 et 200 mM de ε-aminocaproïque acide).
4. Chirurgicalement induire un infarctus du myocarde dans le cœur du porc par ligature de antérieure gauche artère coronaire descendante comme décrit précédemment ^2.
   NOTE: En bref, femelle porcine Yorkshire (~ 13 kg, 45 jours d'âge) sont sous sédation avec une injection intramusculaire de Telazol / xylazine (4,4 mg / kg), et intubés sous anesthésie générale avec de l'isoflurane (0,5-5%). Une 4 ^ème intercthoracotomie ostal est réalisée et antérieure gauche artère coronaire descendante est exposée. L'artère coronaire est obstruée par une ligature pendant 60 minutes, puis la ligature est retirée. defibrillation électrique est effectuée immédiatement dans le cas de la fibrillation ventriculaire.
5. Placer un anneau en plastique stérile (~ 2,5 cm) sur l'épicarde de la région infarcie des coeurs de porc, puis injecter simultanément les solutions microsphère / fibrinogène et de thrombine dans l'anneau.
6. Laisser le mélange se solidifier (~ 30 sec), puis insérez l'aiguille de la seringue contenant des cellules à travers le mélange solidifié dans le myocarde infarci et injecter les cellules. Fermez les couches musculaires, du tissu sous-cutané, et la paroi thoracique avec 3-0 ou 2-0 Monocryl suture selon la taille de l'animal. Buprénorphine 0,01-0,02 mg / injection intramusculaire kg toutes les 8 heures sera utilisé pour contrôler la douleur pour les 3 premiers jours après la chirurgie.
7. Évaluer la fonction cardiaque en utilisant une résonance magnétique cardiaque(IRM) avant une intervention chirurgicale, d' une semaine et quatre semaines après l'intervention chirurgicale ^{2, 3, 4.} Après les études d'IRM finales, sacrifiez l'animal et le traitement de leurs coeurs pour histologie et analyse moléculaire ^{2, 3, 4.}

Résultats

Caractérisation des Differentiated hiPSC-CMs, -ECs et -SMCs

La capacité différentielle de hiPSCs ont été évaluées ^{2, 3, 4.} Débit analyse cytométrie de la troponine T cardiaque (cTnT) expression suggèrent que la pureté de la finale population hiPSC-CM peut dépasser 90% (figure 1A, 1B, panneau ...

Discussion

Amélioration de rendement / pureté de hiPSC-CMs

protocoles classiques pour la différenciation des cellules souches humaines dans CMs sont souvent limitées par un faible rendement et la pureté; par exemple, juste 35-66% des CSEh-CMs obtenu par Percoll séparation et la formation du corps cardiaque exprimé myosine lente chaîne lourde ou cTnT ^6. La pureté des populations hiPSC-CM différenciées peut être sensiblement augmentée en sélectionnant pour l'express...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H