Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Özet

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Özet

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) tamamen kardiyomiyositlerde (hiPSC-CMS), endotel hücreleri (hiPSC-EC), ve düz kas hücreleri (SMC'lere) içine hiPSCs ayrıştırılması için uygulamadan önce, özel hücre tipleri, fakat geleneksel protokolleri ayırt edilmelidir genellikle düşük verim, saflık ve / veya zayıf fenotipik stabilitesi ile sınırlıdır. Burada, yeni hiPSC CMS, -ECs üretilmesi için protokoller ve -SMCs esas itibarıyla geleneksel yöntemlere göre daha verimli, hem de uygulama alanı üzerine oluşturulan bir sitokin içerikli bir flaster ile hücre enjeksiyonu birleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Yama uzun bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard sıkılmış olan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, enjekte edilen hücrelerin tutma hem de arttırır. miyokardiyal iskemi-reperfüzyon hasarının domuz modelinde olarak bütünleşme oranı daha yüksek, iki kat daha fazla olduğunuHücreler hücreleri ve yama hem sitokin içeren yama olmadan hücrelere kıyasla yama ve tedavi ile uygulanmıştır, fakat tek başına hücreleri ile, kalp fonksiyonu ve infarkt önemli iyileşmeler ile ilişkilidir.

Giriş

onlar hastanın bağışıklık sistemi tarafından reddedilmesi olmayan hücrelerin bir potansiyel olarak sınırsız aralığı ve miktar içine ayırt edilebilir, çünkü insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) rejeneratif hücre tedavisi için en umut verici ajanlar arasında yer almaktadır. (SMC'lere Bununla birlikte, kendi kendine replikasyon ve farklılaşması için kendi kapasitesi, tümör oluşumuna neden olabilir ve bunun sonucunda, hiPSCs tamamen bu kardiyomiyositlerde (CMS), endotel hücreleri (EC), ve düz kas hücreleri gibi özel hücre tipleri, ayırt edilmesi gereken ), uygulamadan önce. Hücre yönetiminin en basit ve en yaygın yöntemlerden biri direkt intramiyokardiyal enjeksiyon, ancak yerli miyokard dokusu ile aşılanan nakledilen hücrelerin sayısı son derece azdır. Bu yıpratma çok iskemik doku sitotoksik ortamına bağlanabilir; Ancak, fare embriyonik kök hücreler (EKH) iken yaralanmamış kalplerin, myokarddan içine doğrudan enjekte ouygulanan hücrelerin önemli bir bölümünün onlar esnasında üretilen yüksek basınçlar tarafından iğne izi aracılığıyla sıkılmış, belki de yönetim sitesine çıkıldı düşündürmektedir 3-5 saat ¹ için tutuldu teslim 5 milyon hücre nly ~ 40% miyokard kasılma.

Burada, hiPSC türetilmiş kardiyomiyositlerde (hiPSC CMS) ^2, endotel hücrelerinin (hiPSC-EC) ³ ve düz kas hücreleri (SMC'lere) ⁴ oluşturmak için yeni ve büyük ölçüde daha etkili yöntemler sunar. Özellikle, bu hiPSC-SMC protokol ağırlıklı sentetik veya kontraktil SMC fenotip doğru hücreleri yönlendirerek somatik DKH'lerde ⁵ gözlenen morfolojik ve fonksiyonel özelliklerinin geniş taklit etmek ilk. Ayrıca, bir sitokin içeren fibrin s oluşturarak enjekte edilen hücrelerin melezleşmesi hızını artırır, hücre dağıtım için bir yöntem sağlarEnjeksiyon sitesi üzerinden atch. Yama, en az üç günlük bir süre boyunca insülin benzeri büyüme faktörü (IGF) serbest bırakarak, miyokard çıkan hücreler önlemek için iğne parça, ve hücre yaşamını mühürlenerek, her iki hücre tutmanın geliştirilmesi görünmektedir.

Protokol

Tüm deney prosedürleri Birmingham Alabama Üniversitesi Hayvan Rehberine uygun olarak yapılmaktadır.

1. hiPSC-CM'ler içine hiPSCs Farklılaşan

1. Kaplayın, gece boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ile 6 delikli bir plakanın deliklerine. Kullanmadan önce, jelatinimsi protein karışımı aspire. % 5 _CO2 ve 10 uM ROCK inhibitörü ile 37 ° C mTeSR1 orta ek hücreleri (oyuk başına 1 x 10 ⁵ hücre) önceden kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, ve kültür.
2. Hücreler% 90 izdiham ulaşana kadar her gün orta yenile; Daha sonra,% 5 _CO2 ve 37 ° C'de iki gün süre ile ortam (0.5 mg, jelatinimsi Protein 6-çukurlu plaka başına karışımı, oyuk başına 2 ml'lik ortam) ve kültür hücreleri büyüme faktörü azaltılmış jelatinimsi bir protein karışımı ekleyin.
   1. orta değiştirmek için, yavaşça vakum yoluyla petri ile gelen orta dışarı emmekdışarı hücrelerin dokunmadan, ve bir transfer pipet kullanarak yeni orta ekleyin.
3. ile desteklenmiş RPMI1640 ortam maddesi ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık başlatın insülin olmadan jelatinimsi protein karışımı, B27 Büyüme faktörü indirgenmiş ve 100 ng / ml Aktivin A; Kültür% 5 _CO2 ve 24 saat boyunca 37 ° C'de hücre.
4. , RPMI1640 insülin olmayan B27 ile takviye edilmiş ortam, 10 ng / ml olan kemik morfojenik protein 4 (BMP-4), ve 10 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile orta yerine Kültür% 5 _CO2 ve 96 saat boyunca 37 ° C'de hücre.
5. B27 ile takviye edilmiş RPMI1640 ortam maddesi ile orta takın ve% 5 _CO2 ve 37 ° C 'de kültür hücreleri devam etmektedir; her 3 günde bir orta yenileyin.
6. farklılaşma başlatarak 3 gün sonra ~ mikroskop altında hücrelerin yakalanma kümeleri gözlemleyin. ~ 7 gün ilk kasılmaları gözlemledikten sonra kümeleri toplayın ve Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi yıkayın.
   1. hafifçe çalkalanarak 37 ° C'de 10 dakika süreyle 100 U / ml kolajenaz IV ihtiva eden Hanks tamponu içerisinde onları kuluçka plaka kümelenmiş-hücreleri ayırmak; Daha sonra, 5 dakika boyunca etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.25 tripsin ekleyin.
   2. RPMI / B27 ortamında% 10 fetal bovin serumu ile enzim çözeltisi nötralize ve RPMI / B27 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
   3. hemasitometre hücrelerinin sayısını. Kültür olmayan kardiyomiyosit hücreler kültür kaplarına yüzeyine yapışır sağlayacak% 5 _CO2 ve en az 3 saat 37 ° C'de en az 10 cm yemekleri hücreleri.
7. HiPSC-CMS içeren hücre süspansiyonu, toplamak ve jelatinli protein karışımı -kaplı yüzeye kültürleme yoluyla (10 cm çanak başına ⁶ ila 10 x 1 civarında hücreleri) hücreleri korumak.

2. hiPSC-EC içine hiPSCs Farklılaşan

1. th inkübe edilerek tek hücre içine hiPSC popülasyonu ayrıştırmaları% 5 _CO2 ve 5 dakika için 37 ° C 'de maddesi kenetleme em. Taze mTeSR1 ortamı içeren 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarın.
2. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 10 uM ROCK inhibitörü ile takviye edilmiş ortam içinde mTeSR1 tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre ile hücre yoğunluğu belirlemek.
3. 24 oyuklu plakanın bir oyuğuna 20 NIH birim / ml trombin çözeltisi 250 ul ekle.
4. 12.5 mg / ml fibrinojen çözeltisi 250 ul 1 x 10 ⁶ hiPSCs ekleyin. Ve trombin yüklü de hücre-ihtiva eden fibrinojen çözeltisi 250 ul ilave edin. Karışım dakika içinde bir hiPSC içeren fibrin iskele oluşturacak şekilde katılaşmaya gözlemleyin.
5. cam kapak forseps ile bir 6-yuvalı plaka oyuklarına katılaştırılmış hücre içeren iskele aktarın ve insülin olmadan% 2 B27 ile takviye 2 mi EBM2 ortamında iskeleleri kültürlenmesiyle farklılaşma başlatılması, aktivin-A (50 ng / mi) çözündürüldü, ve BMP-4, 24 saat için (25 ng / ml),% 5 CO de 2 37 ° C.
   1. nazikçe hücreleri dokunmadan vakum yoluyla eski orta emerek orta değiştirin. İnsülin olmadan B27 ile takviye edilmiş yeni EBM2 orta, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF, 50 ng / ml), eritropoietin (EPO, 100 ng / ml), ve transforme edici büyüme faktörü ß1 (TGFβ1, 10 ng / ml) ve kültür ekleme % 5 iskeleleri _CO2 ve 48 saat boyunca 37 ° C.
   2. Orta ve kültür% 5 _CO2 ve başka bir 48 saat süre ile 37 ° C 'de iskeleleri yenile; Daha sonra, orta 200 U kollajenaz IV (100 U / ml) eklenerek iskele hücreleri bırakın.
   3. Sonra yayımlanmış hücreleri aşağı doğru döndürün. B27, VEGF-A (50 ng / ml) ve SB-431542 (10 uM)% 2 ile takviye edilmiş 2 mi EGM2-OG ortamı orta yerine; iki günde orta yenileyin.
   4. 100 U / ml kolajenaz IV hücreleri ayırmak yaklaşık 10 gün sonra (~ farklılaşma başlatıldıktan sonra 14. günde, yani, h) izoleAkış sitometrisi ile farklılaşmış hücre popülasyonundan iPSC-EC AT özel markör proteinlerin ekspresyonu için analiz (örneğin, CD31, CD144) ^3.
   5. Kurulmuş bir protokole ³ yoluyla izole hiPSC-ECS genişletin.

3. hiPSC-SMC'ler içine hiPSCs Farklılaşan

1. Jelatinimsi protein karışımı ile kaplanmış plakalar üzerine hiPSCs tohum, kültür mTeSR1 ortamı içinde hücreler,% 5 _CO2 ve 37 ° C'de, gün ortam değişiklikleri ile, birbirine karışana kadar (yaklaşık 2 gün).
2. 3 gün RPMI1640 ortam maddesi ve% 2 B27 artı insülin CHIR99021 (5 uM) ve BMP-4 (10 ng / ml) ile hücreleri kültürleyerek mezodermal soyundan hücreler içine farklılaşmasını başlatın.
3. Ağırlıklı sentetik fenotip hiPSC-SMC'ler üretmek için:
   1. Kültür, VEGF-A (25 ng / ml), RPMI1640 me fibroblast büyüme faktörü p (FGFβ, 5 ng / ml) ile hücrelerin dium ve% 2 B27 eksi insülin,% 5 _CO2 ve 4 gün boyunca 37 ° C.
   2. Kültür, VEGF-A, hücreler (25 ng / ml), FGFβ% 5 _CO2 ve 37 ° C'de RPMI-1640 ortamı içinde (5 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin 2 gün ° C.
   3. Kültür trombosit türevli büyüme faktörü p (PDGFβ, 10 ng / ml), TGFβ% 5 _CO2 ve 37 ° RPMI1640 (3 ng / ml) ve% 2 B27 artı insülin hücreler 4 gün boyunca ° C.
4. Ağırlıklı kasılma fenotip hiPSC-SMC'ler üretmek için:
   1. Kültür 4 RPMI1640 VEGF-A ile günde (25 ng / ml) ve FGFβ (5 ng / ml) ve% 2 B27 eksi insülin hücreleri.
   2. Kültür RPMI1640 ve% 2 B27 artı insülin PDGFβ (5 ng / ml) ve TGFβ (2.5 ng / ml) ile 7 gün hücreler.
5. ~ 6 gün RPMI1640 metabolik ortam içeren laktat (4 mM) içinde kültürlenmesi ile son hiPSC-SMC popülasyonları arındırın.

jove_title "> 4. IGF-içeren Mikroküreler oluşturma

1. Isı Zeytin yağı bir su banyosu içinde 45 ° C arasındadır.
2. Isı 50 ° C'ye% 10 jelatin çözeltisi 5 mi.
3. zeytin yağı, karışmaya jelatin ekleyin ve bir su banyosu buz ilave edilerek 5 ° C'ye kadar hızlı bir şekilde soğutulur.
4. Yirmi beş dakika sonra, mikro küre oluşumunu uyarmak için, zeytin yağı soğutulmuş (4 ° C) aseton ilave edin.
5. 5 de sıcaklığını muhafaza 1 saat boyunca ° C; daha sonra, zeytin yağı çıkarmak için önceden soğutulmuş asetonla onları 5 kez yıkayın, mikro küreler toplamak ve 4 ° C'de kurumaya izin verin.
6. çapraz bağlama uyarılması için gece boyunca 4 ° C 'de% 70 etanol ve% 0.25 glutaraldehid çözeltisi içinde küreler tekrar süspansiyon ve daha sonra 100 mM glisin Karışımı nötralize.
7. Saat 30 dakika boyunca 5 ug IGF ve% 0.1 sığır serum albümini ihtiva eden ₂ O damıtılmış 15 ul 5 mg mikro-küreler karıştırılarak mikrosferler olarak yüklenebilir IGF.

5. Hücre Yaralanma Sitesi üzerinde yama oluşturma ve enjekte

1. 1 ml Minimum Essential Medium (MEM) birlikte hiPSC kaynaklı SMC'lere (1 milyon dolar) CMS (2 milyon), ve ECS (1 milyon dolar) Askıya.
2. 1 mi fibrinojen çözeltisi (25 mg / ml) içinde mikro-5 mg süspanse edin.
3. Hücre-içeren çözelti, fibrinojen / mikro küre çözeltisi ile bir şırınga ve trombin çözeltisinin 1 ml'si ile üçüncü bir şırınga ile bir şırınga doldurun (80 NIH birim / mi, 2 ul 400 mM _CaCl2, 200 mM ε-aminokaproik ile desteklenmiş asit).
4. Cerrahi ² daha önce açıklandığı gibi inen koroner arter sol ön ligasyonu yoluyla domuz kalbinde miyokard enfarktüsü neden olur.
   NOT: Kısa, dişi Yorkshire domuz olarak (~ 13 kg, yaş 45 gün) Telazol / Xylazine (4.4 mg / kg) kas içi enjeksiyon ile sedasyon edilir ve izofluran (% 0.5-5) ile genel anestezi altında entübe. Bir ^4. IntercOstal torakotomi ve maruz kaldığı inen koroner arter anterior bırakılır. koroner arter 60 dakika boyunca bağlanması ile tıkanır ve daha sonra bağ kaldırılır. Hemen elektriksel defibrilasyon ventriküler fibrilasyon durumunda gerçekleştirilir.
5. domuz kalplerin infarkt bölgenin epikarda bir steril plastik halka (~ 2.5 cm) yerleştirin ve sonra aynı anda ringe kürecik / fibrinojen ve trombin çözümleri enjekte edin.
6. Karışım (~ 30 sn) kuvvetlendirmek için izin ve sonra hücrelerin infarkt miyokard içine katılaşmış karışımın içinden hücre içeren şırınga iğne takın ve enjekte. 3-0 ya da 2-0 monocryl sütür hayvan boyutuna bağlı olarak kas katmanları, deri altı dokusu ve göğüs duvarı kapatın. Buprenorfin 0.01-0.02 mg / kg kas içi enjeksiyon her 8 saatte bir ameliyat sonrası ilk 3 gün ağrıyı kontrol etmek için kullanılır.
7. kardiyak manyetik rezonans kardiyak fonksiyonu değerlendirmekcerrahi işlem, bir hafta ve cerrahi işlem ^{2, 3, 4} sonraki dört hafta önce görüntüleme (MRG). Son MRG çalışmalarından sonra, hayvan kurban ve histoloji ve moleküler analiz ^{2, 3, 4} için kalpleri işlemek.

Sonuçlar

Farklılaştırılmış hiPSC-CM'ler, -ECs ve -SMCs karakterizasyonu

HiPSCs ayırıcı ^{kapasitesi, 4, 2 3} değerlendirildi. Sitometri son hiPSC-CM nüfusun saflık% 90 (Şekil 1A, 1B, panel B1) aşabilir düşündürmektedir kardiyak troponin T (cTnT) ifade analizleri Akış. Hemen hemen bütün hüc...

Tartışmalar

hiPSC-CM'ler gelişmiş Verim / Saflık

CM'ler içine insan kök hücreleri farklılaştırarak için geleneksel protokoller genellikle düşük verim ve saflık ile sınırlıdır; Örneğin, hESC CM'ler sadece 35-66% yavaş miyozin ağır zincir ya da cTnT ⁶ dile Percoll ayrılması ve kardiyak vücut oluşumu yoluyla elde edilmiştir. Ayırt hiPSC-CM popülasyonlarının saflığı esasen promotere işlevsel olarak bağlanmış olan bir raportör geninin s...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H