Плюрипотентных стволовых клеток, полученных клеток сердца для инфарктом Ремонт

Резюме

Мы представляем три новых и более эффективных протоколов дифференцировки человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры и способ доставки, который улучшает приживление пересаженных клеток путем объединения инъекции клеток с патч-опосредованной доставки цитокина.

Аннотация

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток перед введением, но обычные протоколы для дифференциации hiPSCs в кардиомиоциты (hiPSC-КМВ), эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС), и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) часто ограничена низким выходом, чистотой, и / или плохой стабильности фенотипической. Здесь мы представляем новые протоколы для генерации hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs, которые могут быть значительно более эффективными, чем традиционные методы, а также способ объединения инъекции клеток с цитокинами, содержащий патч, созданный по месту введения. Пластырь улучшает как удерживание инжектированных клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от вытесняют из миокарда и выживаемости клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение длительного периода. В свином модели повреждений миокарда после ишемии-реперфузии, скорость приживления была более чем в два раза больше, когдаКлетки вводили с цитокинами, содержащий пластырь по сравнению с клетками без пластыря, и лечение обоими клетками и пластыря, но не с одним только клетками, было связано со значительным улучшением функции сердца и размера инфаркта.

Введение

Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) являются одними из наиболее перспективных агентов для регенеративной клеточной терапии, потому что они могут быть дифференцированы в потенциально неограниченного круга и количества клеток, которые не отторгаются иммунной системой пациента. Тем не менее, их способность к самовоспроизведению и дифференциации может также привести к образованию опухоли и, следовательно, hiPSCs должны быть полностью дифференцируются в специфические типы клеток, такие как кардиомиоциты (КМВ), эндотелиальные клетки (ПАУ) и клеток гладкой мускулатуры (СМЦ ), перед введением. Одним из наиболее простых и наиболее распространенных способов введения клеток является прямым интрамиокардиальной инъекции, но количество трансплантированных клеток, которые привиты нативным ткани миокарда является исключительно низким. Большая часть этого истирания может быть связано с цитотоксической среды ишемизированной ткани; Однако, когда мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) вводили непосредственно в миокарде неповрежденных сердца, оолько ~ 40% из 5 миллионов клеток доставленных были сохранены в течение 3-5 ч ^1, что свидетельствует о том , что значительная часть вводимых клеток покинул сайт администрации, возможно , потому , что они были вытеснены через игольное дорожки с помощью высоких давлений , создаваемых в ходе инфаркт сокращение.

Здесь мы представляем новые и значительно более эффективные методы для генерации hiPSC полученных из кардиомиоцитов (hiPSC-КМВ) ^2, эндотелиальные клетки (hiPSC-ЭКС) ^3, и клетки гладкой мускулатуры (СМЦ) ^4. Следует отметить, что этот протокол hiPSC-SMC является первым , чтобы имитировать широкий спектр морфологических и функциональных характеристик , наблюдаемых в соматической SMCs ^5, направляя клетки к преимущественно синтетическим или сократительной фенотипа SMC. Мы также предлагаем способ доставки клеток, что повышает скорость приживления клеток, инъецированных путем создания цитокинами, содержащей фибрин-рATCH над местом инъекции. Пластырь по-видимому, улучшить и удержания клеток, путем герметизации след иглы, чтобы предотвратить клетки от выхода из миокард, и выживаемость клеток, освободив инсулиноподобного фактора роста (ИФР) в течение по крайней мере трех дней.

протокол

Все экспериментальные процедуры выполняются в соответствии с Руководством животных Университета штата Алабама в Бирмингеме.

1. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-CMs

1. Покрывают лунки 6-луночного планшета с предварительно охлажденный фактора роста сниженном желатиновой белковой смеси при 4 ° С в течение ночи. Аспирируйте желеобразную смесь белка перед использованием. Семя hiPSCs на предварительно покрытых пластинами и культуры клеток (1 × 10 ⁵ клеток на лунку) в 5% CO ₂ и 37 ° C в mTeSR1 среде добавки с ингибитором ROCK 10 мкМ.
2. Обновите среду ежедневно до тех пор, пока клетки не достигают 90% слияния; Затем, добавить фактора роста-уменьшенную желеобразную смесь белка в среде (0,5 мг желатиновой смеси белка на 6-луночный планшет, 2 мл среды на лунку), и культуру клеток в течение 5% CO ₂ и 37 ° С еще два дня.
   1. Для замены среды, аккуратно высасывают среду из чашек Петри с помощью вакуума свне касаясь клетки, и добавить новую среду с помощью пипетки передачи.
3. Инициирование дифференциацию путем замены среды с RPMI1640, дополненной фактором роста пониженным желеобразную смесь белка, B27 без инсулина, и 100 нг / мл активин А; культивирования клеток в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 24 ч.
4. Заменить среду с RPMI1640, который дополнен B27 без инсулина, 10 нг / мл белка костного морфогенетического 4 (BMP-4), и 10 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF); культивирования клеток в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 96 часов.
5. Заменить среду с RPMI1640 , дополненную В27 и продолжают культивирования клеток в 5% CO ₂ и 37 ° С; обновить среду каждые 3 дня.
6. Отметим, кластеры заражения клеток под микроскопом ~ 3 дня после начала дифференцировки. Сбор кластеров ~ 7 дней после того, как первые наблюдения за сокращениями и промойте их в Hanks сбалансированным солевым раствором,
   1. Диссоциировать кластерные-клеток в пластине путем выдержки их в термостате в Hanks-буфере, содержащем 100 ед / мл коллагеназы IV в течение 10 мин при 37 ° С при осторожном встряхивании; Затем, добавьте 0,25% трипсина в этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 5 мин.
   2. Нейтрализовать раствор фермента с 10% фетальной телячьей сыворотки в среде RPMI / B27 среды, а затем клетки вновь суспендируют в среде RPMI / B27 среды.
   3. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Культуры клеток на 10 см чашки на 5% CO ₂ и 37 ° С в течение не менее 3 ч, что позволит некардиомиоцитов клеткам прилипать к поверхности культуры блюдо.
7. Сбор клеточной суспензии, которая содержит hiPSC-КМВ, и поддержания клеток (около 1 × 10 ⁶ клеток на 10 см блюдо) при культивировании их на желатиновой смеси белков -покрытие поверхности.

2. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-КЭ

1. Диссоциируют население hiPSC на отдельные клетки путем инкубирования тысEM с хелатирующим агентом , в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 5 мин. Передача клетки в центрифужную пробирку 15 мл свежей среды, содержащей mTeSR1.
2. Спин вниз клетки при 200 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в среде, дополненной mTeSR1 с ингибитором ROCK 10 мкМ. Определить плотность клеток с помощью гемоцитометра.
3. Добавить 250 мкл 20 NIH ед / мл раствора тромбина в одну лунку 24-луночного планшета.
4. Добавляют 1 х 10 ⁶ hiPSCs до 250 мкл 12,5 мг / мл раствора фибриногена. И добавьте 250 мкл клеточного раствора, содержащего фибриноген с тромбином нагруженных хорошо. Заметим, смесь затвердевает с образованием hiPSC-содержащей фибрин эшафот в течение мин.
5. Перенесите затвердевший клеток, содержащих каркасы в лунки 6-луночного планшета с покровным стеклом щипцов, и инициируют дифференцировку культивированием подмости на 2 мл среды EBM2 дополненной 2% B27 без инсулина, активин-А (50 нг / мл), и ВМР-4 (25 нг / мл) в течение 24 ч при 5% CO 2 и 37 ° C.
   1. Замените среду, осторожно высасывая старую среду с помощью вакуума, не касаясь клетки. Добавить новый EBM2 среду, дополненную B27 без инсулина, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, 50 нг / мл), эритропоэтин (ЭПО, 100 нг / мл) и трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF 1, 10 нг / мл) и культуры каркасы на 5% CO ₂ и 37 ° C в течение 48 часов.
   2. Обновите среду и культуру каркасах на 5% CO ₂ и 37 ° С в течение еще 48 часов; Затем, освободить клетки от эшафота добавлением 200 U коллагеназы IV (100 ед / мл) в среде.
   3. Спин вниз клетки после того, как они будут освобождены. Заменить среду с 2 мл среды EGM2-MV, дополненной 2% B27, VEGF-A (50 нг / мл) и SB-431542 (10 мкМ); обновить среду каждые два дня.
   4. Примерно через 10 дней (то есть, на ~ 14 день после того, как дифференцировка было начато), диссоциируют клеток с 100 ед / мл коллагеназы IV, изолируют чIPSC-КЭ из популяции дифференцированных клеток с помощью проточной цитометрии анализа для экспрессии EC-специфических белков - маркеров (например, CD31, CD144) ^3.
   5. Разверните изолированные hiPSC-ECs с помощью установленного протокола ^3.

3. Дифференциация hiPSCs в hiPSC-SMCs

1. Семя hiPSCs на тарелки , которые были покрыты желатиновой белковой смеси, и культуры клеток в mTeSR1 среде на уровне 5% CO ₂ и 37 ° C, с ежедневными средними изменениями, до конфлюэнтного (~ 2 дня).
2. Инициирование дифференцировки в мезодермальный-линии дифференцировки клеток при культивировании клеток с CHIR99021 (5 мкМ) и BMP-4 (10 нг / мл) в среде RPMI1640, и 2% B27 плюс инсулина в течение 3-х дней.
3. Для получения hiPSC-СМЦ с преимущественно синтетическим фенотипа:
   1. Культуры клеток с VEGF-A (25 нг / мл), фактора бета роста фибробластов (FGFβ, 5 нг / мл) в RPMI1640 меня DIUM, и 2% B27 минус инсулин в 5% CO ₂ и 37 ° С в течение 4 дней.
   2. Культуры клеток в VEGF-A (25 нг / мл), FGFβ (5 нг / мл) в среде RPMI1640, и 2% В27 плюс инсулин в 5% CO ₂ и 37 ° C в течение 2-х дней.
   3. Культуры клеток в тромбоцитарный фактор роста бета (PDGFβ, 10 нг / мл), TGF - beta (3 нг / мл) в RPMI1640, и 2% B27 плюс инсулина на уровне 5% CO ₂ и 37 ° C в течение 4-х дней.
4. Для получения hiPSC-СМЦ с преимущественно сократительной фенотипа:
   1. Культуры клеток в течение 4 дней с VEGF-A (25 нг / мл) и FGFβ (5 нг / мл) в RPMI 1640 и 2% В27 минус инсулина.
   2. Культуры клеток в течение 7 дней с PDGFβ (5 нг / мл) и TGF-beta (2,5 нг / мл) в RPMI1640 и 2% B27 плюс инсулина.
5. Очищают конечные популяции hiPSC-SMC культивированием клеток в лактат (4 мМ) RPMI1640, содержащей метаболическую среду в течение ~ 6 дней.

jove_title "> 4. Создание ИФР-содержащих микросферы

1. Тепло оливковое масло до 45 ° С в водяной бане.
2. Тепло 5 мл 10% раствора желатина до 50 ° С.
3. Добавить желатин в оливковое масло, перемешать, а затем быстро охлаждают до 5 ° С путем добавления льда на водяной бане.
4. Двадцать пять минут позже, добавьте охлажденную (4 ° С) ацетон в оливковом масле, чтобы вызвать образование микросфер.
5. Поддерживать температуру на уровне 5 ° С в течение 1 ч; Затем, собирают микросферы, мыть их 5 раз с помощью предварительно охлажденного ацетона, чтобы удалить оливковое масло, и дайте им высохнуть на воздухе при температуре 4 ° С.
6. Ресуспендируют микросфер в растворе 70% этанола и 0,25% глутаральдегида в течение ночи при температуре 4 ° С, чтобы вызвать образование поперечных связей, а затем нейтрализуют смесь с помощью 100 мМ глицина.
7. Нагрузка ИФР в микросферы путем смешивания 5 мг микросферы с 15 мкл дистиллированной H ₂ O , содержащей 5 мкг ИФР и 0,1% бычьего сывороточного альбумина в течение 30 мин.

5. Создание повязкой на месте повреждения и инъекционное клеток

1. Приостановить hiPSC производный CMs (2 млн), SMCS (1 миллион) и ECs (1 миллион) вместе в 1 мл Minimum Essential Medium (MEM).
2. Приостановка 5 мг микросфер в 1 мл раствора фибриногена (25 мг / мл).
3. Заполните один шприц с клеточным раствором , содержащим, еще один шприц с раствором фибриногена / микросферы, а третий шприц с 1 мл раствора тромбина (80 единиц NIH / мл, с добавлением 2 мкл 400 мМ CaCl ₂ и 200 мМ ε-аминокапроновая кислота).
4. Хирургически вызывают инфаркт миокарда в свином сердце через лигирования левой передней нисходящей коронарной артерии , как описано выше ^2.
   Примечание: Короче говоря, женский Yorkshire свиней (~ 13 кг, 45 дней возраста) седатированы с внутримышечной инъекцией Telazol / ксилазин (4,4 мг / кг), и интубацию под общим наркозом с изофлуран (0,5-5%). А 4 - ^й Intercostal торакотомии выполняется и левой передней нисходящей коронарной артерии подвергается. Коронарной артерии окклюзии с помощью лигатуры в течение 60 мин, а затем лигатуру удаляется. Непосредственная электрическая дефибрилляция выполняется в случае фибрилляция желудочков.
5. Поместите стерильную пластиковое кольцо (~ 2,5 см) на эпикарда инфарктом области свиного сердца, а затем одновременно вводят микросферы / фибриногена и тромбина решения в кольцо.
6. Дайте смеси затвердеть (~ 30 сек), а затем вставить иглу клеток, содержащих шприца через затвердевшей смеси в инфарктом миокарда и вводят клетки. Закройте мышечные слои, подкожные ткани и стенки грудной клетки с 3-0 или 2-0 Monocryl швом в зависимости от размера животного. Бупренорфин 0,01-0,02 мг / кг внутримышечной инъекции через каждые 8 ​​ч будет использоваться для контроля боли в течение первых 3-х дней после операции.
7. Оценка функции сердца с использованием сердечного магнитного резонансатомография (МРТ) перед хирургической процедуры, через неделю и через четыре недели после хирургической процедуры ^{2, 3, 4.} После заключительных исследований МРТ, принести в жертву животное и обрабатывать их сердца для гистологического и молекулярного анализа ^{2, 3, 4.}

Результаты

Характеристика дифференцированной hiPSC-КМВ, -ECs и -SMCs

Дифференциальная емкость hiPSCs оценивали ^{2, 3, 4.} Проточная цитометрия анализ экспрессии кардиального тропонина Т (cTnT) свидетельствуют о ...

Обсуждение

Повышение доходности / Чистота hiPSC-CMs

Обычные протоколы для дифференциации человеческих стволовых клеток в CMs часто ограничены низким выходом и чистотой; например, только 35-66% ЭСК-CMs получают путем разделения перколла и формирования сердечной тела выражается медленную тяж...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H