细胞谱系分析和基因功能研究使用双点MARCM

摘要

这里，我们提出了一个协议，用于一个马赛克标记技术，它允许从一个共同的祖细胞在两种不同颜色来源的神经元的可视化。这有利于与出生约会单个神经元中不同个体的相同的神经元的能力，研究基因功能的神经谱系分析。

摘要

中号 osaic带有R epressible 有丝米 arker 一 nalysis（MARCM）是一种已被广泛应用在果蝇的神经生物学研究来描绘复杂的形态和内，否则无人盯防和泰然自若操纵基因功能的神经元亚群的积极镶嵌标签制度生物。在MARCM系统中产生遗传马赛克通过同源染色体之间的位点特异性重组内分裂前体细胞的有丝分裂过程中，以产生两个标记（MARCM克隆）和未标记的子细胞介导的。所述MARCM方法的扩展，称为双点MARCM（tsMARCM），标签都从具有两种不同颜色的共同祖先来源的双细胞。这种技术被开发，以使从两个半谱系有​​用信息的检索。通过综合分析对不同tsMARCM克隆的tsMARCM系统允许高分辨率神经系mapping至揭示从共同祖细胞产生的标记的神经元的确切出生顺序。此外，tsMARCM系统还通过允许不同动物的相同神经元的表型分析延伸基因功能的研究。在这里，我们将介绍如何应用tsMARCM系统，方便神经发育研究果蝇 。

引言

脑，由广大多样类型的神经元的，赋予动物感知，处理和来自外部世界的挑战的反应能力。成年果蝇中央脑的神经元被从神经干细胞的数量有限的派生，称为神经母细胞（NBS），开发^1,2中。大多数国家统计局参加在果蝇脑内神经发生不对称分裂产生自我更新国家统计局和神经节母细胞（系膜细胞）和系膜细胞然后再通过另一轮分裂产生分化成神经元³两个子细胞（ 图1A ）。由于神经元形态的复杂性，并确定具体的神经元，正面镶嵌标签技术，以阻遏细胞标记物（MARCM）马赛克分析相关的挑战，被发明使visualizat一个单一的神经元即神经元的一小部分出来的周边，未标记的神经元⁴的人口的离子。

MARCM利用翻转酶（FLP）/ FLP识别目标（FRT）系统介导携带阻抑基因，其表达通常抑制报道基因⁴的表达的杂合等位基因的分割前体细胞内的同源染色体之间的位点特异性重组。的有丝分裂后，重组染色体分成双细胞，使得一个单元包含阻抑基因的纯合等位基因，而另一个单元没有阻遏基因的记者的在该小区（和其后代）表现不再⁴受阻。三个克隆型态通常在MARCM实验中发现，当FLP在的NB或系膜是随机诱导:单细胞和双小区GMC克隆，其描绘在单细胞resolutio神经元形态n和多细胞-NB克隆，它揭示了从一个共同的NB（ 图1B）衍生的神经元的整个形态模式。该MARCM技术已在果蝇的神经生物学研究中得到了广泛应用，包括神经类型识别用于重建大脑宽布线网络，神经系分析了披露神经元，参与细胞命运规范基因功能表型特征的发展历史，以及神经元形态发生和分化研究^{5，6，7，8，9，10。}由于传统MARCM只标注诱导有丝分裂重组事件发生后两个子细胞（和系）中的一个，从侧无人盯防的潜在有用的信息丢失。这种限制妨碍了基本M的应用该切换细胞命运在快节奏的许多神经谱系的ARCM系统高分辨率分析或精密在不同动物^11,12相同的神经元基因功能分析。

双点MARCM（tsMARCM）是一种先进的系统，标签从共同祖衍生用两种不同颜色的神经元，从而使有用的信息从双细胞两侧的恢复，从而克服了原有MARCM系统¹¹的限制（ 图2A - 2C）。在tsMARCM系统中，两个RNA干扰（RNAi）为主抑制器是位于前体细胞内的同源染色体的反式位点，并且这些抑制剂的表达独立地抑制它们各自的记者（ 图2B）的表达。继通过FLP / FRT系统介导的位点特异性有丝分裂重组，在TWø基于RNAi的抑制成为分隔成两张细胞，以允许不同的记者（ 图2B）中的表达。两个克隆的图案，与多细胞-NB克隆相关的单细胞克隆和两个小区用GMC相关联的单细胞，通常见于一个tsMARCM实验（ 图2C）。信息从可利用作为另一侧上的参考双子细胞的一侧导出，使得到的高分辨率神经谱系分析，如出生约会标记的神经元，和用于精确调查在不同的动物相同的神经元表型分析神经基因功能^11,12。这里，我们提出一个步骤一步协议描述如何在果蝇进行tsMARCM实验，其可以通过其他实验室使用，以扩大其神经发育的研究（以及其它组织的发展，如适用）。

研究方案

1.建立使用所需转基因^11，13 tsMARCM准备苍蝇

1. 生成tsMARCM准备苍蝇从被个别苍蝇进行¹¹转基因的原始版本（ 见表1）。进行标飞遗传交叉方案中，其中先前已经描述的，通过将多个转基因在相同的飞股^13。
   1. 在一种亲本系，组装FRT ^40A，UAS - mCD8 :: GFP（第一报告，mCD8 :: GFP的转基因;转基因的表达是上游激活序列的启动子控制，其产生的膜-拴系记者下所述RNAi对大鼠簇0的表达;绿色荧光蛋白融合的分化8蛋白的小鼠群），和UAS-rCD2RNAi（抑制第二记者表达的抑制的˚F分化2，rcd2）在^第 2 ^次染色体的左臂。地点 组织特异性-GAL4驱动在X或^第三染色体，如果可能的话。
   2. 在另一亲本系，组装FRT ^{40A，UAS-rCD2} :: RFP的转基因（第二记者，rCD2 :: RFP;另一膜-拴系的记者由具有红色荧光蛋白融合rCD2蛋白），和UAS-GFPRNAi （抑制mCD8 :: GFP表达的抑制;针对GFP表达的RNA干扰）的2 ^次染色体的左臂。放置热休克（HS）-FLP或组织specific- FLP在X或^第三染色体，如果可能的话。
2. 生成tsMARCM就绪苍蝇从由个人蝇¹⁴进行转基因的新版本（ 见表1）。进行标飞的遗传交叉方案中，已经描述previously，通过将多个转基因在同一飞股票^13。
   1. 在一个亲本线，组装FRT位点和UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i（mCD8 :: GFP和抑制rCD2表达:: RFP抑制器的组合转基因）的转基因一起的同一手臂第2 ^次或^第 3 ^次的染色体（FRT和UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i的转基因的适当对表1中所示）。放置组织特异性-GAL4司机比所选择的FRT位点的染色体，其他可能的话染色体。
   2. 在另一亲本系，组装FRT位点和UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi（rCD2的其他组合的转基因:: RFP和抑制mCD8 :: GFP表达的抑制）在同一臂的转基因第2 ^次或^第 3号染色体（适当对FRT的转基因的和UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi在表1中所示）。代替HS-FLP或大于所选择的FRT位点的染色体，其他可能的话染色体组织特异性-FLP。

2.跨tsMARCM准备飞往生成tsMARCM无性系后代

1. 跨tsMARCM就绪苍蝇（ 如，放10-15雄蝇从步骤1.1.1或1.2.1和20-30处女女步骤1.1.2或1.2.2一起飞）在飞食品小瓶新鲜对小瓶的壁订做酵母膏。
2. 保持在25℃的交叉tsMARCM就绪蝇2天收集受精卵之前提高交配的机会。
3. 频繁交叉tsMARCM就绪蝇转移到新鲜yeasted小瓶避免拥挤（点击向下的苍蝇或使用二氧化碳麻醉苍蝇便于转移;通过保持不超过80-100受精卵在一个10毫升飞食品L为了避免过多的孵幼虫）。
4. 培养tsMARCM动物（ 即，受精卵; tsMARCM动物的基因型的一个例子，如在图3中使用的，是HS-FLP ^[22]，w / w的; UAS-mCD8 :: GFP，UAS-rCD2RNAi，FRT ^40A ，GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP，UAS-GFPRNAi，FRT ^40A + +）已在25℃下被放置在串行传送小瓶直到他们开发到所需阶段（ 例如，胚胎，幼体，或蛹）。
5. 放置包含tsMARCM动物在相同发育阶段到37℃水浴10，20，30，40所传送的小瓶中，50分钟，以确定热休克的最佳时间诱导FLP的表达，以产生感兴趣tsMARCM克隆。如果跳过这一步在tsMARCM实验中使用组织specific- FLP（HS-FLP是首选的神经系分析;对于这种偏好的原因先前已被描述¹⁵）。
   注:使用在未来tsMARCM实验热休克的最佳时间，如果感兴趣的更多tsMARCM克隆想重复步骤2.5;通常，更多的FLP表达在诱导HS-FLP ^[22]相比于HS-FLP ^[1]具有相同的热休克的时间。
6. 文化在25℃的热震惊tsMARCM动物，直到他们达到合适的发育阶段，然后进行第3步。

3.准备，着色漆，和粉煤灰山含脑克隆tsMARCM

1. 准备钳保护的菜肴。混合部分A（30克）和有机硅弹性体套件，带活性炭（0.25克）B部分（3克）。将混合物倒入合适的菜肴。
2. 解剖幼虫，蛹，或成人的脑袋上使用通过解剖显微镜观察的镊子保护盘钳在1×磷酸盐缓冲盐水的tsMARCM动物（PBS）中的。注:为飞大脑解剖协议已经说明此前¹⁶ ribed。
3. 固定在玻璃斑点板用含有1×PBS中的4％甲醛在室温下20分钟的飞大脑。处理在该玻璃斑点板为以下步骤剩余的飞大脑。
4. 冲洗苍蝇大脑中（含1×PBS中1％的Triton X-100）1％PBT，每洗三次，每次30分钟，以1％的PBT（漂洗三次:删除PBT和快速添加新PBT;清洗:除去PBT，添加新的PBT和孵化在新的PBT使用定轨振荡器）飞大脑。
5. 孵育初级抗体的混合物飞大脑在4℃或在室温下4小时过夜。初级抗体的混合物的一个例子是大鼠抗CD8抗体（1:100）:含有与小鼠抗Bruchpilot（BRP），以1％的PBT抗体（1:50），兔抗DsRed的抗体（800 1） 5％正常山羊血清（NGS）。
6. 冲洗飞大脑，用1％的PBT三次，然后把它们洗干净三次，每次30分钟，用1％的PBT。
7. 孵育次级抗体的混合物飞大脑在4℃或在室温下4小时过夜。二次抗体的混合物的一个例子是与绿色荧光染料（1:800）缀合的山羊抗大鼠IgG抗体，山羊抗兔IgG抗体有黄色荧光染料（1:800）缀合，和山羊抗小鼠IgG抗体结合有远红色荧光染料（1:800）在含有5％NGS 1％的PBT。
8. 冲洗飞大脑，用1％的PBT三次，然后把它们洗干净三次，每次30分钟，用1％的PBT。它们安装在与抗淬火试剂的微滑动。戴上微型滑动微型玻璃盖覆盖和保护的苍蝇大脑。密封使用透明指甲油微玻璃盖和微滑动的边缘。存储这些装并密封在4℃飞大脑标本。

4.取，处理和分析tsMARCM克隆的荧光图像

1. 捕捉tsMARCM克隆fr的荧光图像嗡使用选择的共聚焦显微镜系统在步骤3.8中创建的样品。
2. tsMARCM共焦荧光图像的项目堆叠成二维，使用具有所选择的共焦显微镜系统提供的图像处理软件扁平的图像（ 见图3B - 3E，3G - 3J，3L - 30， 和3Q - 3T为扁平的例子共聚焦荧光图像）。
3. 计数使用适当的图像处理软件（在ImageJ的¹⁷ 如在"细胞计数"功能tsMARCM克隆的多细胞-NB边的细胞数，参见图3E，3J，3O，和3T用于小区的例子神经元的体）。

结果

该tsMARCM系统已被用于通过检索来自共同的NB衍生的神经元的重要信息，以促进神经谱系分析和基因功能研究。该系统已被用于识别大部分（如果不是全部）的神经元类型，确定每个神经元类型的细胞数量，并确定使用tsMARCM这些神经元的出生顺序^{11，12，18（}见讨论部分的详细说明开展神经系...

讨论

该议定书中的关键步骤

步骤1.1.1，1.2.1，2.3，2.5和3.2是获得良好tsMARCM结果是至关重要的。不表达在神经祖细胞GAL4组织特异性-GAL4驱动是优选的步骤1.1.1和1.2.1。避免过度拥挤在步骤2.3在飞食品小瓶生长的动物。因为感应延迟，FLP的在热休克的表达水平，和神经祖细胞（ 即，NBS和系膜）的平均分割时间是未知的，这是最好的，以改变热休克的时间（10，20，30 ，40，和50...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones