Le analisi delle cellule lignaggio e studi la funzione del gene Impiegando doppi loco MARCM

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di etichettatura mosaico che permette la visualizzazione dei neuroni derivati ​​da una cellula progenitrice comune in due colori distinti. Questo facilita l'analisi lignaggio neurale con la capacità di singoli neuroni nascita aggiornamento e la funzione del gene studiando negli stessi neuroni di diversi individui.

Abstract

M osaic un nalisi con una r epressible c ell m Arker (MARCM) è un sistema di etichettatura mosaico positivo che è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici per descrivere morfologie intricate e di manipolare la funzione dei geni in sottoinsiemi di neuroni all'interno altrimenti non marcato e imperturbabile organismi. mosaici genetici generati nel sistema MARCM sono mediati attraverso la ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di divisione delle cellule precursori per la produzione di entrambi marcati (cloni marcm) e cellule figlie non marcate durante la mitosi. Una estensione del metodo MARCM, chiamato twin-spot MARCM (tsMARCM), etichette sia delle cellule gemelle derivate da un progenitore comune con due colori distinti. Questa tecnica è stata sviluppata per consentire il reperimento di informazioni utili da entrambe le emi-linee. Con completo Analizzando diverse coppie di cloni tsMARCM, il sistema consente di tsMARCM ad alta risoluzione neurale lignaggio Mapping di rivelare l'esatto nascita ordine dei neuroni marcati prodotte dalle cellule progenitrici comuni. Inoltre, il sistema tsMARCM estende anche studi di funzione genica consentendo l'analisi fenotipica dei neuroni identici di diversi animali. Qui, descriviamo come applicare il sistema tsMARCM per facilitare gli studi di sviluppo neurale in Drosophila.

Introduzione

Il cervello, costituito da un vasto numero e diversi tipi di neuroni, dota gli animali con la capacità di percepire, di processo e rispondere alle sfide provenienti dal mondo esterno. I neuroni dell'adulto Drosophila cervello centrale sono derivati da un numero limitato di cellule staminali neurali, chiamati neuroblasti (NBS), durante lo sviluppo ^{1, 2.} La maggior parte di NBS partecipare a neurogenesi cerebrale in Drosophila sottoposti divisione asimmetrica per generare NBs auto-rinnovamento e cellule madri gangliari (GMC), e le GMCs poi passare attraverso un altro giro di divisione per la produzione di due cellule figlie che si differenziano in neuroni ³ (Figura 1A ). A causa della complessità della morfologia neuronale e le sfide connesse con l'identificazione neuroni specifici, una tecnologia positiva etichettatura mosaico, analisi mosaico con un marker delle cellule reprimibile (MARCM), è stato inventato per consentire la visualizatione di un singolo neurone o un piccolo sottoinsieme di neuroni dalla popolazione di neuroni circostanti, senza etichetta ^4.

MARCM utilizza il sistema / target riconoscimento FLP (FRT) mediare ricombinazione sito-specifica tra cromosomi omologhi all'interno di una cella di divisione precursore portando un allele eterozigote di un gene repressore, la cui espressione normalmente inibisce l'espressione di un gene reporter ⁴ flippase (FLP). Dopo la divisione mitotica, i cromosomi ricombinanti sono segregati in cellule gemelle, tale che una cella contiene alleli omozigoti del gene repressore e l'altra cella ha repressore gene-espressione del reporter in quella cella (ei suoi discendenti) non è più bloccato ^4. Tre modelli clonali si trovano di solito in un esperimento MARCM quando FLP è stocasticamente indotta in NBs o GMCs: unicellulari e due celle-GMC cloni, che raffigurano la morfologia dei neuroni a resolutio cella singolan, e multi-cellulare-NB cloni, che rivelano interi modelli morfologici di neuroni derivati da una NB comune (Figura 1B). La tecnica MARCM è stato ampiamente applicato in Drosophila studi neurobiologici, compresa l'identificazione di tipo neuronale per ricostruire le reti di cablaggio in tutto il cervello, neurali lignaggio analisi per rivelare la storia dello sviluppo dei neuroni, la caratterizzazione fenotipica delle funzioni dei geni coinvolti nella determinazione del fato cellulare, e la morfogenesi neuronale e differenziazione studia ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Poiché MARCM convenzionale etichetta solo una delle due cellule figlie (e linee) dopo l'evento di ricombinazione mitotica indotta, informazioni potenzialmente utili dal lato marcato viene persa. Questa limitazione osta all'applicazione della base MSistema ARCM a ad alta risoluzione le analisi di molti lignaggi neuronali che si attivano destino delle cellule in tempo veloce o per la precisione di analisi delle funzioni dei geni nei neuroni identici di diversi animali ^{11, 12.}

Twin-loco MARCM (tsMARCM) è un sistema avanzato che etichette neuroni derivati da un progenitore comune con due colori distinti, che permette il recupero delle informazioni utili da entrambi i lati delle celle gemelle, superando la limitazione del sistema MARCM originale ¹¹ ( Figura 2A - 2C). Nel sistema tsMARCM, due interferenza RNA (RNAi) a base di soppressori sono situati trans siti di cromosomi omologhi all'interno di una cellula precursore, e l'espressione di tali soppressori inibiscono in maniera indipendente l'espressione dei rispettivi reporter (Figura 2B). A seguito di site-specific ricombinazione mitotica mediata attraverso il sistema FLP / FRT, la TWsoppressori o basati RNAi diventare segregati in cellule gemelle per consentire l'espressione del reporter distinti (Figura 2B). Due modelli clonali, cella singola associata con cloni unicellulari e due celle-GMC associati con cloni multi-cellulari-NB, sono in genere visti in un esperimento tsMARCM (Figura 2C). Informazioni derivato da un lato delle celle singoli possono essere utilizzati come riferimento per l'altro lato, consentendo ad alta risoluzione analizza neurale lineage, come nascita-incontra i neuroni marcati, e fenotipica analisi dei neuroni identici in diversi animali per l'indagine precisa della funzione del gene neurale ^{11, 12.} Qui, vi presentiamo un protocollo passo-passo che descrive come condurre un esperimento tsMARCM, che può essere utilizzato da altri laboratori per ampliare gli studi di sviluppo neurale (nonché lo sviluppo di altri tessuti, se del caso) in Drosophila.

Protocollo

1. Costruire tsMARCM-ready mosche Uso del Required transgeni ^{11, 13}

1. Generare la versione originale di mosche tsMARCM-ready da transgeni che vengono effettuate da singoli mosche ¹¹ (vedi tabella 1). Condurre programmi di incrocio standard di mosca genetiche, che sono stati descritti in precedenza, mettendo più transgeni nelle stesse scorte Fly ^13.
   1. In una linea parentale, assemblare i transgeni di FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (primo giornalista, mCD8 :: GFP, espressione del transgene è sotto il controllo del promotore upstream sequenza di attivazione, che produce un reporter membrana legato del gruppo murino di differenziazione 8 proteina fusa con la proteina fluorescente verde), e UAS-rCD2RNAi (il soppressore che inibisce l'espressione del secondo giornalista, l'RNAi contro l'espressione di cluster di ratto of differenziazione 2, RCD2) sul braccio sinistro del cromosoma 2 ^nd. Posto conducente -GAL4 sulla X o 3 ^° cromosoma, se possibile specifici tessuti.
   2. In altra linea dei genitori, assemblare i transgeni di FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (il secondo giornalista, RCD2 :: RFP, l'altro giornalista membrana-tethered composto da RCD2 proteina fusa con la proteina fluorescente rossa), e UAS-GFPRNAi (il soppressore che inibisce l'espressione di mCD8 :: GFP; RNAi contro l'espressione di GFP) sul braccio sinistro del cromosoma 2 ^nd. Posizionare heat-shock (HS) -FLP o FLP tessuto-specific- sulla X o 3 ^° cromosoma, se possibile.
2. Generare la nuova versione di mosche tsMARCM-ready da transgeni che vengono effettuate da singoli mosche ¹⁴ (vedi tabella 1). Condurre mosca genetica schemi di incrocio standard, che sono stati descritti previously, mettendo più transgeni nelle stesse scorte Fly ^13.
   1. In una linea parentale, assemblare i transgeni di un sito FRT ed UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (un transgene combinato di mCD8 :: GFP e il soppressore che inibisce l'espressione di RCD2 :: RFP) insieme nello stesso braccio il 2 ^° o 3 ^° cromosoma (coppie appropriate di transgeni di FRT e UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i vengono riportati in Tabella 1). Posizionare conducente tessuto-specifico GAL4 sui cromosomi diversi cromosoma del sito FRT prescelto, se possibile.
   2. In altra linea parentale, assemblare i transgeni di un sito FRT ed UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (l'altra transgene combinato di RCD2 :: RFP e il soppressore che inibisce l'espressione di mCD8 :: GFP) nello stesso braccio dei 2 ^° o 3 ^° cromosomiche (appropriate coppie di transgeni di FRT e UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi sono indicati nella Tabella 1). Inserire hs-FLP o tessuto-specifici FLP su cromosomi diversi cromosoma del sito FRT prescelto, se possibile.

2. Croce tsMARCM pronto vola a generare cloni tsMARCM a loro progenie

1. Mosche Croce tsMARCM-ready insieme (ad esempio, mettere 10-15 mosche maschio dal punto 1.1.1 o 1.2.1 e 20-30 femmina vergine vola dal punto 1.1.2 o 1.2.2 insieme) in un flaconcino fly-cibo con fresco pasta di lievito -made sulla parete del flaconcino.
2. Mantenere le incrociate mosche tsMARCM-ready a 25 ° C per 2 giorni per migliorare le possibilità di accoppiamento prima di raccogliere uova fecondate.
3. trasferire Spesso i incrociate mosche tsMARCM-ready in flaconcini appena yeasted per evitare affollamento (toccare le mosche o utilizzare anidride carbonica per anestetizzare le mosche per facilitare il trasferimento; tenere non più di 80-100 uova fecondate in 10 mL fly-alimentare tramiteL Per evitare troppi larve tratteggiata).
4. Culture gli animali tsMARCM (vale a dire, uova fecondate, un esempio del genotipo di animali tsMARCM, utilizzato in figura 3, è hs-FLP ^[22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) che sono state previste nelle fiale in serie trasferiti a 25 ° C fino a quando si sviluppano alle fasi desiderata (ad esempio, gli embrioni, larve, o pupe).
5. Posizionare le fiale trasferite che contengono animali tsMARCM allo stesso stadio di sviluppo in un bagno 37 ° C acqua per 10, 20, 30, 40, e 50 minuti per determinare il tempo ottimale di heat-shock che induce l'espressione di FLP per generare la cloni tsMARCM di interesse. Ignorare questo passaggio se FLP tessuto-specific- viene utilizzato nell'esperimento tsMARCM (hs-FLP è preferito per lignaggio neurale analisi, le ragioni di questa preferenza sono stati descritti in precedenza ¹⁵).
   NOTA: Ripetere il passaggio 2,5 utilizzando il tempo ottimale di heat-shock in esperimenti tsMARCM successivi se più tsMARCM cloni di interesse sono ricercati; in generale, più l'espressione FLP è indotta in hs-FLP ^[22] rispetto al hs-FLP ^[1] con lo stesso tempo di calore-shock.
6. Cultura le calore scioccato animali tsMARCM a 25 ° C fino a quando non hanno raggiunto la fase di sviluppo appropriato, quindi passare al punto 3.

3. Preparare, Mordente, e Brains Monte Fly contenenti tsMARCM cloni

1. Preparare piatti pinze-protezione. Miscelare la parte A (30 g) e la parte B (3 g) del Kit elastomero di silicone con carbone attivo (0,25 g). Versare il composto in piatti appositi.
2. Sezionare larvali, pupa, o cervello adulto fuori degli animali tsMARCM in 1x PBS (PBS) utilizzando una pinza su un piatto pinze protezione viste attraverso un microscopio dissezione. NOTA: Un protocollo per la dissezione mosca cervello è stato discribed in precedenza ^16.
3. Fissare il cervello mosca in un posto piatto di vetro con 1x PBS contenente 4% di formaldeide a temperatura ambiente per 20 min. Elaborare i cervelli volano in questo posto piatto di vetro per il resto dei passaggi.
4. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT (1x PBS contenente 1% Triton X-100) e lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno in 1% PBT (risciacquo: rimuovere PBT e aggiungere nuovi PBT rapidamente; lavare: rimuovere PBT, aggiungere nuove PBT, e incubare il cervello mosca nel nuovo PBT utilizzando un agitatore orbitale).
5. Incubare le cervelli mosca con la miscela di anticorpi primari notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente. Un esempio della miscela di anticorpi primari è rat anticorpo anti-CD8 (1: 100), coniglio anticorpo anti-DsRed (1: 800), e Bruchpilot anti-anticorpo di topo (BPA) (1:50) in 1% PBT contenente 5% di siero normale di capra (NGS).
6. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT, e poi lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno con 1% PBT.
7. Incubare cervello mosca con la miscela di anticorpi secondari notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente. Un esempio della miscela di anticorpi secondari è anticorpi IgG di capra anti-topo coniugato con colorante verde fluorescente (1: 800), anticorpi IgG anti-coniglio di capra coniugato con giallo colorante fluorescente (1: 800), e di capra anti-topo anticorpi IgG coniugato con lontano-rosso-colorante fluorescente (1: 800) in 1% PBT contenente il 5% NGS.
8. Risciacquare il cervello volare tre volte con 1% PBT, e poi lavarli tre volte per 30 minuti ciascuno con 1% PBT. montarli su un micro diapositiva con un reagente anti-tempra. Mettere un vetro di copertura micro sul micro vetrino per coprire e proteggere il cervello mosca. Sigillare i bordi del micro vetrino di copertura in vetro e micro con smalto trasparente. Memorizzare questi montati e sigillati volare campioni di cervello a 4 ° C.

4. Prendere, di processo, e analizzare le immagini fluorescenti di tsMARCM cloni

1. Cattura immagini fluorescenti di cloni fr tsMARCMom i campioni creati nel passaggio 3,8 utilizzando il sistema di microscopia confocale di scelta.
2. Pile progetto di tsMARCM immagini fluorescenti confocale in due dimensioni, immagini appiattite utilizzando il software di elaborazione delle immagini fornito con il sistema di microscopia confocale di scelta (vedi Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, e 3Q - 3T per esempi di appiattito immagini fluorescenti confocale).
3. Contare il numero di cellule dei lati multi-cellulare-NB dei cloni tsMARCM utilizzando un software di elaborazione delle immagini appropriata (ad esempio, la funzione "Cell Counter" in ImageJ ^17; vedi Figura 3E, 3J, 3O e 3T per gli esempi della cellula corpi dei neuroni).

Risultati

Il sistema tsMARCM è stato utilizzato per facilitare neurale lignaggio analisi e studi la funzione del gene per il recupero delle informazioni importanti sui neuroni derivati ​​da NBs comuni. Il sistema è stato utilizzato per identificare la maggior parte (se non tutti) i tipi neuronali, determinare il numero di cellule di ogni tipo neuronale, e accertare la nascita di ordine di questi neuroni ^{11, 12,}

Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

I passi 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 e 3.2 sono fondamentali per ottenere buoni risultati tsMARCM. Driver -GAL4 tessuto-specifica che non esprimono GAL4 in progenitori neurali sono preferiti per passi 1.1.1 e 1.2.1. Evitare di sovraffollamento gli animali cresciuti in fiale fly-alimentari nella fase 2.3. Poiché la latenza di induzione, il livello di espressione di FLP upon heat-shock, e il tempo medio di divisione dei progenitori neurali

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones