Çift nokta MARCM kullanılması Hücre Lineage Analizleri ve Gen Fonksiyonu Çalışmaları

Özet

Burada, iki ayrı renk ortak bir progenitör hücreden türetilen nöron görselleştirme izin veren bir mozaik etiketleme tekniği için bir protokol mevcut. Bu, farklı bireylerin aynı nöronlarda doğum kalma bireysel nöronların kapasitesi ve eğitim gen fonksiyonu ile sinir soy analizi kolaylaştırır.

Özet

M r epressible c ell m arker bir nalysis (MARCM) yaygın karmaşık morfolojileri tasvir ve aksi takdirde işaretlenmemiş ve soğukkanlı içinde nöronların alt kümelerinin genlerin işlevini işlemek için Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanan bir pozitif mozaik etiketleme sistemi osaic organizmalardır. MARCM sisteminde üretilen genetik mozaik mitoz sırasında her iki işaretlenmiş (MARCM klonları) ve işaretlenmemiş yavru hücrelere üretilmesi için ön-madde bölünen hücreler içindeki homolog kromozomlar arasındaki yere özgü rekombinasyon yoluyla aracılık edilir. MARCM yönteminin bir uzantısıdır, adı çift Noktası MARCM (tsMARCM), iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilen yataklı hücrelerin hem de etiketler. Bu teknik, hem hemi-soydan gelen yararlı bilgi alınmasını sağlamak için geliştirilmiştir. kapsamlı tsMARCM klonlarının farklı çiftleri analiz ederek, tsMARCM sistemi, yüksek çözünürlüklü sinir soy Mappin izing ortak progenitör hücrelerden üretilen etiketli nöronların tam doğum sırasını ortaya çıkarmak için. Ayrıca, tsMARCM sistemi, farklı hayvan aynı nöronların fenotipik analizi izin gen fonksiyon çalışmalarını uzanır. Burada, Drosophila nöral gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için tsMARCM sisteminin nasıl uygulanacağını açıklar.

Giriş

Bir çok sayıda ve nöronların farklı türde oluşan beyin, algılama, süreç ve dış dünyadan sorunlara yanıt yeteneği ile hayvanları endows. Yetişkin Drosophila merkezi beynindeki nöronlar, nöral kök hücrelerin sınırlı sayıda türetilen gelişim ^{1, 2} sırasında çağrılan Nöroblastlar (Onaylanmış). Onaylanmış Drosophila beyin nöron katılan çoğu kendini yenileyen Onaylanmış Kuruluşlarının ve ganglion anne hücreleri (GOK değerleri) oluşturmak için asimetrik bölünme geçmesi ve GOK değerleri daha sonra (Şekil 1A nöronlar ³ içine ayırt iki kızı hücreleri üretmek için bölünme bir tur geçmesi ). Çünkü nöronal morfoloji karışıklık ve spesifik nöronlar, pozitif bir mozaik etiketleme teknolojisi, bir bastırılabilir hücre markeri (MARCM) ile mozaik analizlerinde ile ilişkili zorluklar, visualizat sağlamak için icat edildiTek bir nöron veya çevre, etiketsiz nöronların ⁴ nüfusun dışında nöronların küçük bir alt iyon.

MARCM Flippase (FLP) tanımı, normal olarak, bir raportör geninin ⁴ ekspresyonunu önleyen bir represör genin bir heterozigot aleli taşıyan bir bölme ön-hücre içinde homolog kromozomlar arasındaki site-spesifik rekombinasyon aracılık etme / FLP tanıma hedef (STT) sistemi kullanmaktadır. mitotik bölünmesinden sonra, rekombinant kromozom artık bir hücre homozigot represör genin alelleri ve diğer hücre Resim represör genini-o hücrenin (ve onun soyundan) Raportör ekspresyonu sahip içerecek şekilde, çift hücrelere ayrılmış olan ⁴ engellendi. FLP stokastik Onaylanmış ve GMC'ler indüklenir sonucunda üç klonal desenler genellikle MARCM deneyde bulunan: tek hücreli çözünürlük nöronal morfoloji tasvir tek hücreli ve iki hücre GMC klonlar,ortak bir NB (Şekil 1B) türetilen nöron bütün morfolojik desenler ortaya n ve çok hücreli-NB klon. MARCM tekniği yaygın beyin çapında kablo ağlarını yeniden nöronal tip tanımlama dahil olmak üzere, Drosophila nörobiyolojik çalışmalarda uygulanmıştır, nöral soy nöronlar, hücre kaderi şartnamede yer alan gen fonksiyonlarının fenotipik karakterizasyonu gelişim tarihini ifşa analizleri ve nöronal morfonogenezi ve farklılaşma ^{5, 6, 7, 8, 9, 10} inceler. Geleneksel MARCM sadece uyarılmış mitoz rekombinasyon olayından sonra iki yavru hücreye (ve soy) birini etiketler, çünkü işaretsiz taraftan potansiyel olarak yararlı bilgiler kaybolur. Bu sınırlama, temel M uygulanmasını engellerYüksek çözünürlüklü ARCM sistemi hızlı tempoda hücre kaderi değiştirmek çok sinir soy analizleri veya hassas farklı hayvanların ^{11, 12} özdeş nöronlarda gen fonksiyonlarının analiz eder.

İkiz-spot MARCM (tsMARCM) böylece orijinal MARCM sisteminin ¹¹ sınırlama (üstesinden ikiz hücrelerin her iki tarafın yararlı bilgi kurtarma sağlayan iki ayrı renk ile ortak bir progenitör türetilmiş nöronlar etiketleri gelişmiş bir sistemdir Şekil 2A - 2C). TsMARCM sisteminde, iki RNA interferans (RNAi) baskılayıcılar, bir ön-madde, hücre içindeki homolog kromozom trans-sitesi bulunmaktadır tabanlı ve bu baskılayıcılar ifadesi bağımsız olarak, ilgili muhabir (Şekil 2B) ekspresyonunu inhibe eder. FLP / FRT sisteminin aracılık site-spesifik rekombinasyon mitotik sonra, twhaline O RNAi tabanlı baskılayıcılar tat muhabir (Şekil 2B) ekspresyonuna izin vermek için tek kişilik hücrelere ayrılmış. İki klon desenler çok hücreli-NB klonları ile bağlantılı tek hücre klonları ve iki hücre GMC ile bağlantılı tek hücre tipik olarak bir tsMARCM deneyi (Şekil 2C) görülür. Gibi bilgiler doğum kalma etiketli nöronlar gibi nöral nesilli analiz yüksek çözünürlükte, etkinleştirme diğer taraf için referans olarak kullanılabilir çift yataklı hücrelerin bir taraftan elde edilen ve fenotipik hassas araştırma için farklı hayvan özdeş nöronların analizleri sinir gen fonksiyonu ^{11, 12} arasında. Burada, (varsa, yanı sıra diğer dokuların gelişimini) Drosophila nöral gelişim çalışmalarını genişletmek için diğer laboratuvarlar tarafından kullanılan bir tsMARCM deney, yapmak için nasıl açıklayan bir adım-adım protokol mevcut.

Protokol

1. Gerekli Transgenlerin ^{11, 13} kullanılarak tsMARCM hazır Sinekler oluşturun

1. Bireysel sinekler ¹¹ tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sinekler özgün sürümünü oluşturun (bakınız Tablo 1). Aynı sinek stoklarının ¹³ çoklu transgenler koyarak, daha önce tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranış.
   1. Bir ebeveyn doğrultusunda, FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (ilk muhabir, mCD8 :: GFP transgenlerin araya; transgen ifadesi bir zar-gergin muhabiri üreten yukarı aktivasyon dizisi promoter kontrolü altındadır sıçan küme o ifadesi karşı RNAi, yeşil flüoresan protein ile kaynaşmış farklılaşma 8 proteininin fare küme) ve UAS-rCD2RNAi (ikinci muhabiri ifadesini inhibe baskılayıcıf farklılaşma 2, rcd2) ^2. kromozomun sol kolunda. yer dokuya özgü eğer mümkünse, X veya ^3. kromozom üzerinde -GAL4 sürücüsü.
   2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP transgenlerin araya (ikinci muhabiri, rCD2 :: RFP, diğer zar-gergin muhabir kırmızı floresan proteini ile kaynaşmış rCD2 proteini oluşan) ve UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı, GFP ifadesi karşı RNAi) ^2. kromozomun sol kolunda. X veya ^3. kromozomun, mümkünse ısı-şok (hs) -FLP veya doku-Seçicilik FLP yerleştirin.
2. Bireysel sinekler ¹⁴ tarafından yapılmaktadır transgenlerin gelen tsMARCM hazır sineklerin yeni sürümü oluşturun (bakınız Tablo 1). s tarif edilmiştir standart sinek genetik geçiş şemaları, Davranışreviously, aynı sinek stoklarının ¹³ çoklu transgenlerin koyarak.
   1. Bir ebeveyn doğrultusunda, aynı kolunda birlikte bir FRT site ve UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP ve rCD2 ifadesini :: RFP inhibe bastırıcı bir kombine transgen) arasında transgenlerin araya ^2. veya ^3. kromozomu (STT ve UAS mCD8.GFP.UAS-rCD2i bölgesinin transgenlerin uygun çift Tablo 1 'de belirtilmiştir). Mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-GAL4 sürücüsü yerleştirin.
   2. Diğer ebeveyn doğrultusunda, bir FRT site ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (diğer kombine rCD2 bir transgen :: RFP ve mCD8 :: GFP ekspresyonunu inhibe baskılayıcı) aynı kolun içinde transgenlerin araya STT transgenlerin ^2. veya ^3. kromozom (uygun çiftlerinin ve UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi) Tablo 1'de gösterilmiştir. Yeri hs-FLP veya mümkünse, seçilen FRT sitenin kromozomu dışındaki kromozomlar üzerinde doku-spesifik-FLP.

2. Çapraz tsMARCM hazır Onların Döl içinde tsMARCM klonlarının oluşturmak için Sinekler

1. Birlikte Çapraz tsMARCM hazır sinekler taze bir sinek gıda şişede (örneğin, birlikte adım 1.1.2 veya 1.2.2 uçar adım 1.1.1 ya da 1.2.1 ve 20-30 bakire kadın 10-15 erkek sinekler koymak) şişenin duvarda -yapılan maya yapıştırın.
2. döllenmiş yumurta toplama önce çiftleşme şansı artırmak için 2 gün boyunca 25 ° C'de geçti tsMARCM hazır sinekler koruyun.
3. Sık transferini kolaylaştırmak için (boğmakta önlemek sinekler aşağı dokunun veya sinekler uyutmak için karbondioksit kullanmak için taze mayalı şişeleri içine geçti tsMARCM hazır sinekler aktarmak; aracılığı ile 10 ml sinek gıda 80-100 döllenmiş yumurta daha fazla tutmakl) çok fazla yumurtadan larva önlemek için.
4. Kültür tsMARCM hayvanlar (örneğin, döllenmiş yumurtalar, tsMARCM hayvan genotipinin bir örneği, Şekil 3'te kullanılan şekliyle, HS-FLP ^[22], a / a; UAS mCD8 :: GFP, UAS rCD2RNAi, FRT ^40A GAL4-GH146 / UAS rCD2 :: RFP UAS GFPRNAi, FRT ^40A +; arzu edilen aşamada (embriyo, larvalarına karşı geliştirmek kadar 25 ° C 'de seri olarak transfer şişelerde atılmıştır +), veya pupa).
5. oluşturmak için FLP ekspresyonunu indükleyen ısı şok uygun zamanı belirlemek aktarılır 10 için 37 ° C su banyosu, 20, 30, 40, aynı gelişim aşamasında tsMARCM hayvan içerir şişe ve 50 dakika yerleştirin Çevrede tsMARCM klonları. Doku Seçicilik FLP tsMARCM deneyde kullanılan ediliyor bu adımı atlayın (hs-FLP sinir soy tercih edilir analizleri bu tercihin nedenleri daha önce ¹⁵ tarif edilmiştir).
   NOT: ilgi daha fazla tsMARCM klonları istedi eğer gelecekte tsMARCM deneylerinde ısı şoku optimal zamanı kullanarak adımı yineleyin 2.5; Genellikle, daha FLP ifade ile kıyaslandığında, hs-FLP ^[22] indüklenir hs-FLP ^[1] Aynı ısı-şok süresi.
6. Kültür onlar 25 ° C'de ısı şok tsMARCM hayvanlar uygun gelişim aşamasına ulaştı ve ardından 3. adıma geçin kadar.

3. Leke hazırlayın ve Dağı Fly Brain tsMARCM klonlarının İçeren

1. forseps koruma yemekleri hazırlayın. A bileşenini (30 g) ve aktive edilmiş mangal kömürü (0.25 g) ile Silikon Elastomer Kit B bölümünde (3 g) karıştırın. Uygun yemekleri içine karışımı dökün.
2. Diseksiyon mikroskobu ile görüntülenen bir forseps koruma çanak forseps kullanarak 1x fosfat tamponlu tuzlu su içinde tsMARCM hayvanlar (PBS) üzerinden larva, pupa veya ergin beyinleri teşrih. NOT: sinek beyin diseksiyon için bir protokol azalan olmuşturDaha önce ¹⁶ belirlemiş.
3. 1X PBS, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 formaldehit içeren bir cam Noktası plaka uçucu beyinleri düzeltildi. adımların geri kalanı için bu cam nokta plakasında sinek beyinleri işleyin.
4. Kaldırmak PBT:; yıkama PBT çıkarın ve hızlı bir şekilde yeni PBT ekleyin: sinek beyinleri% 1 PBT (1 x PBS,% 1 Triton X-100 ihtiva eden) ve% 1 PBT (durulamada 30 dakika boyunca her biri üç kez yıkama ile üç kez yıkayın yeni PBT eklemek ve bir orbital karıştırıcı kullanılarak yeni PBT sinek beyinleri) kuluçkaya yatmaktadır.
5. gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat için birincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. ihtiva eden ve fare anti-Bruchpilot (BRP) antikoru (1:50),% 1 PBT: tavşan anti-DsRed antikoru (800 1): Primer antikor karışımının bir örneği, sıçan anti-CD8 antikoru (1: 100) olan % 5 normal keçi serumu (NGS).
6. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın.
7. gece boyunca 4 ° C'de ya da oda sıcaklığında 4 saat için ikincil antikor karışımı ile uçucu beyinleri inkübe edin. Ve keçi anti-fare: sarı floresan boya (800 1) ile konjuge keçi anti-tavşan IgG antikoru: sekonder antikor karışımının bir örneği, yeşil floresan boya (800 1) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG antikoru olan % 5 NGS içeren% 1 PBT: IgG antikoru uzak-kırmızı-floresan boya (800 1) ile konjuge.
8. Uçucu beyinleri% 1 PBT ile üç kez durulanır ve daha sonra,% 1 PBT 30 dakika her biri için uygun üç kez yıkayın. Bir anti-söndürme maddesi ile mikro lam üzerine monte edin. sinek beyinleri kapsayacak ve korumak için mikro slaytta bir mikro cam kapak koyun. net oje kullanarak mikro kapak camı ve mikro slayt kenarları mühür. Bu monte edilir ve 4 ° C'de beyin numuneleri sinek kapalı saklayın.

4. Süreç alın ve tsMARCM Klonların Floresan Görüntüler analiz

1. tsMARCM klonları fr floresan görüntüler yakalayınom numuneler tercih konfokal mikroskopi sistemini kullanarak adım 3.8 oluşturulan.
2. Iki boyutlu içine tsMARCM konfokal floresan görüntülerin proje yığınlar, seçim konfokal mikroskopi sistemi ile birlikte verilen görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri düzleştirilmiş (Şekil 3B bakınız - basık örnekleri için 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O ve 3Ç konfokal floresan görüntüler).
3. Uygun bir görüntü işleme yazılımı (ImageJ ^17, örneğin, "Hücre Sayaç" fonksiyonunu kullanarak tsMARCM klonlarının çoklu hücresel NB iki hücre sayısını, hücre örnekleri için Şekil 3E, 3j, 3O ve 3T bakınız nöronların organları).

Sonuçlar

tsMARCM sistemi ortak Onaylanmış türetilen nöronlar üzerinde önemli bilgiler alarak sinir soy analizleri ve gen fonksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için kullanılır olmuştur. Sistem, nöronal türleri (hepsi değilse de) çoğu belirlemek her nöronal tip hücre sayısını belirlemek, ve tsMARCM kullanarak bu nöronların doğum sırası ^{11, 12, 18} (detaylar için Tartı...

Tartışmalar

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 Adımlar ve 3.2 iyi tsMARCM sonuçları elde etmek için kritik öneme sahiptir. Sinir atalarda GAL4 ifade etmez, dokuya-özgü -GAL4 sürücüler adımları 1.1.1 ve 1.2.1 için tercih edilir. Adım 2.3 sinek gıda şişeleri yetiştirilen hayvanların aşırı kalabalık kaçının. Indüksiyon gecikme, ısı şoku üzerine FLP ifade seviyesi, ve sinir atalarıdır (yani, Onaylanmış ve GOK değerleri) ortalama ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones