쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구

요약

여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.

초록

M은 R의 epressible C의 엘 m 개의 arker와 nalysis (MARCM) 널리 복잡 모폴로지를 도시하고, 그렇지 않으면 표시되지 않은 및 교란 내 뉴런의 서브 세트에서 유전자의 기능을 조작하는 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어 포지티브 모자이크 표시 시스템이다 osaic 생물. MARCM 시스템에서 발생하는 유전 모자이크는 유사 분열하는 동안 모두 표시 (MARCM 클론) 및 표시되지 않은 딸 세포를 생성하는 전구 세포를 분할 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 통해 매개된다. MARCM 방법의 확장이라는 쌍둥이 자리 MARCM (tsMARCM)는, 두 가지 색상으로 공통 조상에서 유래 쌍둥이 세포의 두 레이블. 이 기술은 모두 헤미 계통에서 유용한 정보의 검색을 가능하게하기 위해 개발되었다. 종합적 tsMARCM 클론의 다른 쌍을 분석함으로써, tsMARCM 시스템은 고해상도 신경 계통 mappin 허용g는 일반 전구 세포에서 생성 된 레이블 뉴런의 정확한 출생 순서를 공개합니다. 또한, tsMARCM 시스템은 또한 다른 동물 동일한 뉴런 표현형 분석을 허용하여 유전자 기능 연구를 확장한다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 발달의 연구를 용이하게하기 위해 tsMARCM 시스템을 적용하는 방법에 대해 설명합니다.

서문

방대한 수의 뉴런 다양한 형태로 구성 뇌가, 지각 처리와 외부 세계로부터의 도전에 대응하는 능력을 동물 부여한다. 성인 초파리 중앙 뇌의 신경 세포는 신경 줄기 세포의 수가 제한으로부터 유도되는 현상 ^{(1, 2)} 동안 호출 neuroblasts (NBS). 새로운 기지국이 초파리의 뇌 신경에 참여하는 대부분의 자기 갱신 NBS 및 신경절 어머니 세포 (GMCs)를 생성하는 비대칭 분열을 받아야하고, GMCs는 (그림 1A를 신경 세포 ^3로 분화 두 개의 딸 세포를 생산하는 부문의 또 다른 라운드 통과 ). 때문에 신경 형태의 복잡함과 특정 신경 세포, 긍정적 인 모자이크 레이블 기술하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석을 식별과 관련된 문제의의 visualizat 수 있도록 발명되었다하나의 신경 세포 또는 주변, 레이블이없는 뉴런 ^(4)의 인구 중 신경 세포의 작은 부분 집합의 이온.

MARCM는 flippase (FLP) 식 일반적으로 리포터 유전자 ^4의 발현을 억제하는 리프레 서 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반하는 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 중재하기 / FLP 인식 대상 (FRT) 시스템을 사용합니다. 유사 분열 분할 한 후, 재조합 염색체가 더 이상없는 하나의 셀은 동형 접합 리프레 유전자의 대립 유전자와 다른 세포가 더 리프레 서 유전자 - 더 그 셀 (및 그 자손)에 기자의 발현이 없습니다를 포함하도록, 트윈 세포로 분리된다 ^(4)를 차단했습니다. FLP가 확률 적 NBS 또는 GMCs 유도 할 때 세 가지 클론 패턴은 일반적으로 MARCM 실험에서 발견된다 : 단일 셀 resolutio에서 신경 세포의 형태를 묘사 단일 셀 및 2 셀 - GMC 클론을,일반적인 NB (그림 1B)에서 파생 된 신경 세포의 전체 형태 학적 패턴을 보여 n 및 다세포-NB 클론. MARCM 기술이 널리 뇌 전체의 배선 네트워크를 재구성 신경 유형 식별을 포함하여, 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어, 신경 계통은 신경 세포 운명 사양에 관여하는 유전자의 기능 표현형 특성의 개발 역사를 공개에 대해 분석하고, 신경 세포의 형태 형성 분화는 ^{5, 6, 7, 8, 9, 10 연구.} 종래 MARCM 만 유도 분열 재조합 이벤트 이후 개의 딸세포 (및 계통) 중 한 라벨 때문에, 표시되지 않은 측면에서 잠재적으로 유용한 정보가 손실된다. 이 제한은 기본 M의 적용을 배제고해상도로 ARCM 시스템은 빠른 템포 세포 운명 전환 많은 신경 계통 분석 또는 다른 동물 정밀도 ^{11, 12의} 동일한 뉴런 유전자 기능 분석한다.

트윈 스폿 MARCM (tsMARCM)는 이렇게 원래 MARCM 시스템 ^(11)의 한계 (극복 트윈 셀의 양측에서 유용한 정보의 회복을 가능하게 두 개의 별개의 색상이 공통 조상으로부터 유래 신경 라벨 고급 시스템이다 그림 2A - 2C). tsMARCM 시스템에서, 두 개의 RNA 간섭 (RNAi) 억제제는 전구 세포 내에서 상동 염색체의 트랜스 위치에 놓인다 기반, 이러한 억제제의 발현이 독립적으로 각각의 기자 (도 2B)의 발현을 억제한다. FLP / FRT 시스템을 통해 매개되는 부위 특이 적 분열 재결합 후, TWO가 RNAi를 기반 억제 별개 기자 (도 2B)의 발현을 허용하는 트윈 세포로 분리. 두 클론 패턴 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀은 전형적 tsMARCM 실험 (도 2c)에서 볼 수있다. 정보는 출생 데이트 표지 뉴런 신경 혈통 분석 고해상도를 가능 타측에 대한 기준으로서 이용 될 수있는 트윈 셀의 한쪽에서 유래하고, 표현형은 정확한 조사 다른 동물에서 동일 뉴런 분석 신경 유전자 기능 ^{(11), (12).} 여기서, 우리는 (가능한 경우뿐만 아니라, 다른 조직의 발달) 초파리 신경 발달 공부 범위를 확장하기 위해 다른 실험실에서 사용될 수있는 tsMARCM 실험을 수행하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

1. 필수 유전자 ^{(11), (13)를} 사용하여 tsMARCM 준비 파리 구축

1. 개별 플라이 ^(11)에 의해 수행되는 유전자로부터 tsMARCM 준비 파리의 원래 버전을 생성 (표 1 참조). 같은 비행 주식 ^13에서 여러 유전자를 넣어, 이전에 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시한다.
   1. 한 부모의 라인에서, FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (첫 번째 기자, mCD8 :: GFP의 유전자를 조립, 형질 전환 유전자의 발현이 막 닿는 기자를 생산하는 업스트림 활성화 시퀀스 프로모터의 제어하에 쥐 클러스터 (O)의 발현에 대하여 RNAi에, 녹색 형광 단백질을 융합 단백질의 분화 8 마우스 클러스터)와 UAS-rCD2RNAi (제 리포터의 발현을 억제 레서의F 차별화 2, rcd2) 2 ^{차 염색체의} 왼쪽 팔에. 장소 조직 특이 가능한 경우 X 또는 3 ^{번째 염색체에} -GAL4 드라이버.
   2. 다른 부모의 라인에서, FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP의 유전자 조립 (제 기자, rCD2 :: RFP를, 다른 막 닿는 기자가 적색 형광 단백질 융합 rCD2 단백질로 구성)와 UAS-GFPRNAi (mCD8 :: GFP의 발현을 억제 억압, GFP의 발현에 대한 RNAi의) 2 ^{차 염색체의} 왼쪽 팔에. 는 X 또는 ^{제 3 염색체} 가능한 경우에 열 충격 (HS) -FLP 또는 조직 특정 - FLP를 놓습니다.
2. 개별 파리 ^(14)에 의해 수행되는 유전자에서 tsMARCM 준비 파리의 새 버전을 생성 (표 1 참조). P는 설명 된 표준 비행 유전자 교차 제도를 실시reviously, 동일한 플라이 주식 ^13에서 여러 유전자를 넣어.
   1. 한 부모 행에서 같은 팔에 함께 FRT 사이트와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (mCD8 :: GFP 및 rCD2의 발현 :: RFP를 억제하는 서프 레서의 결합 된 유전자)의 유전자를 조립 2 ^차 또는 3 ^차 염색체 (FRT와 UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i의 유전자들의 적절한 쌍이 표 1에 나타내었다). 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-GAL4 드라이버를 놓습니다.
   2. 다른 부모의 라인에서, FRT 사이트와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (다른 결합 rCD2의 유전자 :: RFP 및 mCD8 :: GFP의 발현 억제 서프 레서) 같은 팔을의 유전자를 조립 FRT의 도입 유전자의 2 ^차 또는 ^{3 차} 염색체 (적절한 쌍 와 UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi)은 표 1에 표시됩니다. 장소 HS-FLP 또는 가능하면, 선택한 FRT 사이트의 염색체 이외의 다른 염색체에 조직 특이-FLP.

2. 크로스 tsMARCM 준비는 그들의 자손에 tsMARCM 클론을 생성 (으)로 운항하는 항공사

1. 함께 간 tsMARCM 준비 파리 신선한와 플라이 식품 유리 병에 (예를 들어, 함께 단계 1.1.2 또는 1.2.2에서 날아 단계 1.1.1 또는 1.2.1 및 20 ~ 30 버진 여성에서 10 ~ 15 남성 파리를 넣어) 유리 병의 벽에 - 만든 효모 붙여 넣기.
2. 수정 된 알을 수집하기 전에 상대의 기회를 향상시키기 위해 2 일 동안 25 ° C에서 넘어 tsMARCM 준비 파리를 유지한다.
3. 자주 전송을 용이하게하기 위해 (군집 피 파리를 누르거나 파리를 마취하는 이산화탄소를 사용하는 갓 yeasted 유리 병에 넘어 tsMARCM 준비 파리를 전송;를 통해 10 mL의 플라이 식품에 80-100 수정란보다 더 이상 유지하지난) 너무 많은 부화 유충을 방지 할 수 있습니다.
4. 문화 tsMARCM 동물 (즉, 수정란, tsMARCM 동물의 유전자형의 예를 들어, 그림 3에서 사용이며, HS-FLP ^[22], w / w, UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^(40A) , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A, + 그들은 원하는 단계 (예를 들어, 배아, 유충에 개발 될 때까지 25 ° C에서 직렬로 전송 유리 병에 배치 된 +), 또는 번데기).
5. 를 생성 FLP의 발현을 유도하는 열 충격을 최적의 시간을 결정하기 위해 전송 (10) 37 °의 C 수조, 20, 30, 40와 동일한 발달 단계에서 tsMARCM 동물을 포함 바이알에서 50 분간 배치 관심 tsMARCM 클론. 조직 특정 - FLP는 tsMARCM 실험에 사용하는 경우이 단계를 건너 뜁니다 (HS-FLP는 신경 계통에 대한 선호 분석,이 설정에 대한 이유는 이전에 ¹⁵ 설명 하였다).
   참고 : 관심이 더 tsMARCM 클론이 원하는 경우 향후 tsMARCM 실험에서 열 충격의 최적의 시간을 사용하여 단계를 반복 2.5; 일반적으로, 더 FLP 표현이 비교에서 HS-FLP ^[22] 유도 HS-FLP ^[1] 같은 열 충격 시간.
6. 문화는 25 ° C에서 열 충격 tsMARCM 동물을 적절한 발달 단계에 도달 한 다음 3 단계로 진행 될 때까지.

3. 얼룩을 준비하고 마운트 플라이 두뇌는 tsMARCM 클론을 포함하는

1. 집게 보호 요리를 준비합니다. 파트 A (30g) 및 활성탄 (0.25 g)와 실리콘 엘라스토머 키트의 부품 B (3 g)을 섞는다. 해당 요리에 혼합물을 부어.
2. 해부 현미경을 통해 볼 집게 보호 접시에 집게를 사용 1X 인산 완충 식염수에 tsMARCM 동물 (PBS) 중 애벌레, 번데기, 또는 성인의 뇌를 해부하다. 참고 : 플라이 뇌 해부를위한 프로토콜은 내림차순하고있다이전 ¹⁶ ribed.
3. 1X PBS을 실온에서 20 분간 4 % 포름 알데히드를 함유하는 유리 스폿 접시 플라이 머리를 고정한다. 단계의 나머지 부분이 유리 자리 접시에 플라이 뇌를 처리합니다.
4. 제거 PBT :; 세척 PBT를 제거하고 신속하게 새로운 PBT를 추가 플라이 뇌를 1 % PBT (1X PBS 1 % 트리톤 X-100 포함) 및 1 % PBT (씻어 30 분 동안 그들에게 각각 세 번 씻어로 3 회 씻어 새로운 PBT를 추가하고, 궤도 쉐이커를 사용하여 새 PBT에서 플라이 두뇌)를 품어.
5. 밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 일차 항체의 혼합물 플라이 뇌 인큐베이션. 포함하고, 마우스 항 Bruchpilot (BRP) 항체 (1시 50분) 1 % PBT에서 : 토끼 항을 DsRed 항체 (800 1) 일차 항체의 혼합물의 예는 쥐 항 CD8 항체 (1 : 100) 인 5 % 정상 염소 혈청 (NGS).
6. 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다.
밤새 4 ℃ 또는 실온에서 4 시간 동안 2 차 항체의 혼합물로 즉시 뇌를 부화. 및 염소 항 - 마우스 - 황색 형광 염료 (800 1)와 접합 염소 항 - 토끼 IgG 항체 : 이차 항체의 혼합물의 예는 녹색 형광 염료 (800 1)와 접합 된 염소 항 - 래트 IgG 항체 인 5 % NGS를 포함하는 1 % PBT에서 : IgG 항체는 멀리 붉은 형광 염료 (800 일)와 결합.
7. 플라이 두뇌 1 %의 PBT로 3 회 씻어, 다음 1 % PBT와 30 분마다 그들에게 세 번 씻는다. 반 담금질 시약 마이크로 슬라이드를 탑재합니다. 플라이 머리를 커버하고 보호하기 위해 마이크로 슬라이드에 마이크로 커버 유리를 넣습니다. 투명한 매니큐어를 사용하여 마이크로 커버 유리 마이크로 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 이러한 장착하고 4 ℃에서 뇌 표본을 비행 밀봉 보관하십시오.

4. 프로세스를 가지고, 그리고 tsMARCM 클론의 형광 이미지 분석

1. tsMARCM 클론의 FR의 형광 이미지를 캡처OM 샘플을 원하는 초점 현미경 시스템을 이용하여 단계 380에서 생성.
2. 두 차원에 tsMARCM 공 초점 형광 이미지의 프로젝트 스택은, 선택의 공 초점 현미경 시스템과 함께 제공되는 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 평평 (그림 3B 참조 - 평평의 예 3T - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, 3 분기를 공 초점 형광 이미지).
3. 적절한 화상 처리 소프트웨어 (ImageJ에 ¹⁷ 예, "셀 카운터"기능을 이용하여 tsMARCM 클론의 다세포-NB 측의 세포 수를 세어 상기 셀의 예는도 3e, 3J, 3O 및 3T 참조 신경 세포의 시체).

결과

tsMARCM 시스템은 공통 NBS 유래의 신경 세포에 대한 중요한 정보를 입수하여 신경 혈통 분석하여 유전자 기능 연구를 용이하게하기 위해 사용되어왔다. 이 시스템은 신경 세포의 종류 (모든 경우) 대부분을 식별 각각의 신경 세포 유형의 세포 수를 결정하고,에 tsMARCM를 사용하여 이러한 신경 세포의 출생 순서 ^{11, 12,}

토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 단계, 3.2 좋은 tsMARCM 결과를 얻기위한 중요합니다. 신경 전구 세포에서 GAL4을 표현하지 않는 조직 별 -GAL4 드라이버 단계 1.1.1과 1.2.1 바람직하다. 단계 2.3에서 플라이 식품 유리 병에서 자란 동물을 과도하게 몰려 마십시오. 유도 지연, 열충격시 FLP의 발현 수준 및 신경 전구 세포 (즉, 새로운 기지국과 GMCs)의 평균 분할...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones