Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para una técnica de etiquetado mosaico que permite la visualización de las neuronas derivadas de una célula progenitora común en dos colores distintos. Esto facilita el análisis de linaje neural con la capacidad de las neuronas individuales de nacimiento actualización y el estudio de la función de genes en las mismas neuronas de diferentes individuos.

Resumen

M osaic un nálisis con un r epressible c ell m Arker (MARCM) es un sistema de etiquetado mosaico positivo que se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos para representar intrincados morfologías y manipular la función de los genes en subconjuntos de neuronas dentro de otra manera sin marcar y no perturbado organismos. mosaicos genéticos generados en el sistema MARCM están mediados a través de la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos dentro de la división de las células precursoras para producir ambos marcados (clones MARCM) y células hijas durante la mitosis sin marcar. Una extensión del método MARCM, llamado MARCM de doble punto (tsMARCM), etiquetas, tanto de las células individuales derivados de un antepasado común con dos colores distintos. Esta técnica fue desarrollada para permitir la recuperación de información útil a partir de los dos hemi-linajes. Por exhaustivamente el análisis de diferentes pares de clones tsMARCM, el sistema permite tsMARCM de alta resolución linaje neuronal mapping para revelar la exacta orden de nacimiento de las neuronas marcadas producidos a partir de células progenitoras comunes. Además, el sistema también se extiende tsMARCM estudios de la función de genes permitiendo que el análisis fenotípico de las neuronas idénticas de diferentes animales. A continuación, describimos cómo aplicar el sistema tsMARCM para facilitar los estudios de desarrollo neural en Drosophila.

Introducción

El cerebro, compuesto de un gran número y diversidad de tipos de neuronas, dota a los animales con la capacidad de percibir, procesar y responder a los desafíos del mundo externo. Las neuronas del adulto Drosophila cerebro central se derivan de un número limitado de células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), durante el desarrollo ^{1, 2.} La mayor parte del NBS participar en la neurogénesis del cerebro en Drosophila someterse a la división asimétrica para generar RN auto-renovación y células madre ganglio (GMCs), y los GMC y luego ir a través de otra ronda de división para producir dos células hijas que se diferencian en neuronas ³ (Figura 1A ). Debido a la complejidad de la morfología neuronal y los retos asociados con la identificación de las neuronas específicas, una tecnología de etiquetado mosaico positivo, análisis de mosaico con un marcador de células que se puede reprimir (MARCM), fue inventado para que el visualization de una sola neurona o un pequeño subconjunto de neuronas de la población de neuronas, sin etiqueta alrededores ^4.

MARCM utiliza el objetivo de reconocimiento de FLP sistema / (FRT) para mediar en la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos en una célula precursora de separación que lleva un alelo heterocigoto de un gen represor, cuya expresión normalmente inhibe la expresión de un gen indicador ⁴ flipasa (FLP). Después de la división mitótica, los cromosomas recombinantes se segregan en las células individuales, de tal manera que una célula contiene alelos homocigotos del gen represor y la otra célula no tiene represor gen la expresión del reportero en esa celda (y sus descendientes) ya no es ⁴ bloqueado. Tres patrones clonales se encuentran generalmente en un experimento MARCM cuando FLP se induce estocásticamente en NBS o GMC: unicelulares y dos celdas-GMC clones, que representan la morfología neuronal en resolutio de una sola célulan, y multi-celular NB-clones, que revelan patrones morfológicos enteras de neuronas derivadas de un NB común (Figura 1B). La técnica MARCM se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos, incluyendo en la identificación del tipo neuronal para la reconstrucción de las redes de cableado en todo el cerebro, los análisis de linaje neuronal para la divulgación de la historia del desarrollo de las neuronas, la caracterización fenotípica de las funciones de los genes implicados en la especificación del destino celular y morfogénesis neuronal y la diferenciación estudia ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Debido MARCM convencional sólo etiquetas una de las dos células hijas (y linajes) después del evento mitótico recombinación inducida, la información potencialmente útil desde el lado no marcado se pierde. Esta limitación impide la aplicación de la M básicoARCM sistema de análisis de alta resolución de muchos linajes neuronales que activan las células destinos en tempo rápido o para la precisión de los análisis de las funciones de genes en las neuronas idénticas de diferentes animales ^{11, 12.}

Twin-punto MARCM (tsMARCM) es un sistema avanzado que etiqueta neuronas derivadas de un antepasado común con dos colores distintos, lo que permite la recuperación de la información útil de ambos lados de las células individuales, superando así la limitación del sistema MARCM original de ¹¹ ( Figura 2A - 2C). En el sistema tsMARCM, dos interferencia de ARN (RNAi) a base de supresores están situados en trans sitios de cromosomas homólogos dentro de una célula precursora, y la expresión de los supresores de inhibir de forma independiente la expresión de sus respectivos reporteros (Figura 2B). Después de recombinación específica de sitio mediada por mitótico a través del sistema FLP / FRT, el twsupresores o basados en el ARNi se segregan en células individuales para permitir la expresión de los periodistas distintas (Figura 2 B). Dos patrones clonales, de una sola célula asociada con clones de una sola célula y de dos células-GMC asociados con clones multicelular-NB, se ven típicamente en un experimento tsMARCM (Figura 2C). La información derivada de un lado de las células individuales se puede utilizar como referencia para el otro lado, permitiendo de alta resolución análisis de linaje neural, tales como el nacimiento-data las neuronas marcadas, y análisis fenotípico de las neuronas idénticas en diferentes animales para la investigación precisa de la función génica neural ^{11, 12.} A continuación, presentamos un protocolo paso a paso que describe cómo llevar a cabo un experimento tsMARCM, que puede ser utilizado por otros laboratorios para ampliar sus estudios sobre el desarrollo neuronal (así como el desarrollo de otros tejidos, en su caso) en Drosophila.

Protocolo

1. Construir moscas tsMARCM-Ready mediante la Requerido Los transgenes ^{11, 13}

1. Generar la versión original de moscas tsMARCM listas de transgenes que son transportados por las moscas individuales ¹¹ (ver Tabla 1). Realizar esquemas estándar de moscas genéticos de cruce, que se han descrito anteriormente, poniendo múltiples transgenes en las mismas poblaciones de mosca ^13.
   1. En una línea parental, montar los transgenes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (la primera reportero, mCD8 :: GFP; la expresión del transgén está bajo el control del promotor de la secuencia de activación aguas arriba, que produce un reportero membrana-tethered de clúster de ratón de la proteína de diferenciación 8 fusionado con la proteína fluorescente verde), y UAS-rCD2RNAi (el supresor que inhibe la expresión del segundo indicador; la RNAi contra la expresión de clúster de rata of diferenciación 2, rcd2) en el brazo izquierdo del cromosoma ^2º. Lugar específico de tejido conductor Gal4 en la X o el cromosoma 3 ^rd, si es posible.
   2. En la otra línea parental, montar los transgenes de FRT ^40A, UAS-rCD2 :: RFP (el segundo reportero, rCD2 :: RFP, y el otro reportero membrana-tethered consiste en proteína rCD2 fusionado con la proteína fluorescente de color rojo), y UAS-GFPRNAi (el supresor que inhibe la expresión de mCD8 :: GFP; la RNAi contra la expresión de GFP) en el brazo izquierdo del cromosoma 2 ^nd. Coloque de choque térmico (hs) -FLP o FLP-específica- tejido en la X o el cromosoma 3 ^rd, si es posible.
2. Generar la nueva versión de moscas tsMARCM listas de transgenes que son transportados por las moscas individuales ¹⁴ (ver Tabla 1). Llevar a cabo los esquemas de cruce genético de la mosca estándar, que han sido descritos pestaba viendo anteriormente, poniendo múltiples transgenes en las mismas poblaciones de moscas ^13.
   1. En una línea parental, montar los transgenes de un sitio FRT y UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (un transgén combinado de mCD8 :: GFP y el supresor que inhibe la expresión de rCD2 :: RFP) juntos en el mismo brazo de el ^2º o ^3º cromosoma (pares apropiados de transgenes de FRT y UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i se indican en la Tabla 1). Coloque conductor tejido-específicas de GAL4 en los cromosomas distintos del cromosoma del sitio FRT elegido, si es posible.
   2. En la otra línea parental, montar los transgenes de un sitio FRT y UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (el otro transgén combinado de rCD2 :: RFP y el supresor que inhibe la expresión de mCD8 :: GFP) en el mismo brazo de la ^2ª o ^3ª cromosómicas (pares apropiados de transgenes de FRT y UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi se indican en la Tabla 1). Coloque hs-FLP o tejido-específicas de FLP en los cromosomas distintos del cromosoma del sitio FRT elegido, si es posible.

2. Cruz tsMARCM listo moscas para generar clones tsMARCM en su progenie

1. Cruz tsMARCM listos moscas juntos (por ejemplo, poner 10-15 moscas macho de la etapa 1.1.1 o 1.2.1 y 20-30 hembra virgen vuela desde el paso 1.1.2 o 1.2.2) juntos en un vial mosca de comida fresca con pasta de levadura -hecha en la pared del vial.
2. Mantener las moscas tsMARCM listos cruzados a 25 ° C durante 2 días para mejorar las posibilidades de apareamiento antes de recoger los huevos fertilizados.
3. transferir con frecuencia las cruzadas moscas tsMARCM preparados en viales recién yeasted para evitar el hacinamiento (abajo toque las moscas o el uso de dióxido de carbono para anestesiar las moscas para facilitar la transferencia; mantener no más de 80-100 huevos fertilizados en un 10 ml con mosca de alimentos a través del para evitar demasiados larvas nacidas).
4. Cultura tsMARCM los animales (es decir, los huevos fertilizados; un ejemplo del genotipo de los animales tsMARCM, como se usa en la Figura 3, es hs-FLP ^[22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) que se han establecido en los viales en serie transferidos a 25 ° C hasta que se desarrollan las etapas deseadas (por ejemplo, embriones, larvas, o pupas).
5. Colocar los viales transferidos que contienen animales tsMARCM en la misma etapa de desarrollo a un baño de 37 ° agua para 10, 20, 30, 40, y 50 min para determinar el tiempo óptimo de choque térmico que induce la expresión de FLP para generar el tsMARCM clones de interés. Omitir este paso si el tejido FLP-específica- está siendo utilizado en el experimento tsMARCM (se prefiere hs-FLP por linaje neuronal análisis; las razones de esta preferencia se han descrito previamente ¹⁵).
   NOTA: Repita el paso 2.5 utilizando el tiempo óptimo de choque térmico en futuros experimentos tsMARCM si se quieren más clones tsMARCM de interés; en general, más la expresión de FLP se induce en hs-FLP ^[22] en comparación con hs-FLP ^[1] con el mismo tiempo de choque térmico.
6. Cultura los animales tsMARCM conmocionado por el calor a 25 ° C hasta que hayan alcanzado la etapa de desarrollo apropiado, y luego continúe con el paso 3.

3. Preparar, a las manchas, y cerebros Monte volantes que contienen tsMARCM Clones

1. Preparar platos de protección de fórceps. Mezclar la parte A (30 g) y la parte B (3 g) del Kit de elastómero de silicona con carbón activado (0,25 g). Verter la mezcla en los platos adecuados.
2. Diseccionar larva, pupa, o los cerebros adultos fuera de los animales tsMARCM en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) utilizando fórceps en un plato de protección de fórceps visto a través de un microscopio de disección. NOTA: Un protocolo para la disección del cerebro de la mosca ha sido descRibed previamente ^16.
3. Fijar los cerebros de moscas en una placa de vidrio con punto de 1x PBS que contenía 4% de formaldehído a temperatura ambiente durante 20 min. Procesar el cerebro de la mosca en este punto placa de vidrio para el resto de los pasos.
4. Enjuague el cerebro de la mosca tres veces con 1% de PBT (1x PBS que contenía 1% de Triton X-100) y lavarlos tres veces durante 30 minutos cada uno en 1% PBT (Aclarado: Sacar PBT y añadir nueva PBT rápidamente; lavar: eliminar PBT, añadir nuevo PBT, e incubar el cerebro de la mosca en el nuevo PBT utilizando un agitador orbital).
5. Incubar el cerebro de la mosca con la mezcla de anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente. Un ejemplo de la mezcla de anticuerpos primarios de rata es anticuerpo anti-CD8 (1: 100), anticuerpo de conejo anti-DsRed (1: 800), y anti-anticuerpo de ratón Bruchpilot (BRP) (1:50) en 1% PBT que contiene 5% de suero de cabra normal (NGS).
6. Enjuague el cerebro de la mosca tres veces con 1% PBT, y luego lavar tres veces durante 30 minutos cada uno con 1% PBT.
7. Incubar el cerebro de la mosca con la mezcla de anticuerpos secundarios durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente. Un ejemplo de la mezcla de anticuerpos secundarios es un anticuerpo IgG de cabra anti-rata conjugado con colorante verde fluorescente (1: 800), anticuerpo IgG anti-conejo de cabra conjugado con colorante amarillo fluorescente (1: 800), y de cabra anti-ratón anticuerpo IgG conjugado con colorante rojo lejano fluorescente (1: 800) en 1% PBT que contiene 5% de NGS.
8. Enjuague el cerebro de la mosca tres veces con 1% PBT, y luego lavar tres veces durante 30 minutos cada uno con 1% PBT. Montarlos sobre un portaobjetos de micro con un reactivo anti-temple. Ponga un vaso micro cubierta en el portaobjetos de micro para cubrir y proteger el cerebro de la mosca. Sellar los bordes de la cubierta de vidrio y micro micro diapositivas usando esmalte de uñas transparente. Almacenar estos montados y sellados volar muestras de cerebro a 4 ° C.

4. Tome, procesar y analizar imágenes fluorescentes de tsMARCM Clones

1. Capturar imágenes fluorescentes de tsMARCM clones from las muestras creadas en el paso 3.8 utilizando el sistema de microscopía confocal de elección.
2. Pilas de Proyecto de tsMARCM imágenes confocal de fluorescencia en dos dimensiones, aplanados imágenes con el software de procesamiento de imágenes suministrado con el sistema de microscopía confocal de elección (véase la Figura 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O, y 3T - 3T para ejemplos de aplanado imágenes confocal de fluorescencia).
3. Contar el número de células de los lados multicelular-NB de los clones tsMARCM utilizando un software de procesamiento de imágenes apropiado (por ejemplo, la función "contador de células" en ImageJ ^17; véase la Figura 3E, 3J, 3O, y 3T para ejemplos de la célula cuerpos de las neuronas).

Resultados

El sistema tsMARCM se ha utilizado para facilitar linaje neural análisis y estudios de la función génica mediante la recuperación de información importante sobre las neuronas derivadas de NBS comunes. El sistema ha sido utilizado para identificar la mayoría (si no todos) los tipos neuronales, determinar el número de células de cada tipo neuronal, y determinar el orden de nacimiento de estas neuronas ^{11, 12,}

Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Los pasos 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 y 3.2 son fundamentales para la obtención de buenos resultados tsMARCM. Conductores Gal4 específicos de tejido que no expresan GAL4 en progenitores neurales son los preferidos para los pasos de 1.1.1 y 1.2.1. Evitar el hacinamiento de los animales criados en los viales mosca de comida en el paso 2.3. Debido a que la latencia de inducción, el nivel de expresión de FLP al choque térmico, y el tiempo medio de s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones