Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l'aide Twin-tache marcm

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour une technique de marquage mosaïque qui permet la visualisation des neurones dérivées d'une cellule progénitrice commune en deux couleurs distinctes. Ceci facilite l'analyse de la lignée neuronale avec la capacité des neurones individuels naissance à jour et de la fonction du gène à étudier dans les mêmes neurones de différents individus.

Résumé

M osaic un nalyse avec un r epressible c ell m arker (marcm) est un système d'étiquetage de la mosaïque positive qui a été largement appliqué dans les études neurobiologiques de drosophile pour représenter morphologies complexes et de manipuler la fonction des gènes dans les sous - ensembles de neurones au sein autrement non marqué et non perturbé organismes. mosaïques génétiques générées dans le système de marcm sont médiés par une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues au sein de la division des cellules précurseurs afin de produire à la fois des clones marqués (marcm) et des cellules filles non marquées au cours de la mitose. Une extension de la méthode de marcm, appelé bi-place marcm (tsMARCM), étiquettes à la fois des cellules jumeaux issus d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes. Cette technique a été développée pour permettre la récupération des informations utiles à partir des deux hémi-lignées. En analysant en détail les différentes paires de clones tsMARCM, le système permet tsMARCM haute résolution lignage neuronal Mapping pour révéler la naissance ordre exact des neurones marqués produites à partir de cellules progénitrices communes. En outre, le système tsMARCM étend également des études de fonction de gène en permettant l'analyse phénotypique des neurones identiques de différents animaux. Ici, nous décrivons comment appliquer le système de tsMARCM pour faciliter les études de développement neural chez la drosophile.

Introduction

Le cerveau, composé d'un grand nombre et la diversité des types de neurones, dote les animaux avec la capacité de percevoir, de traiter et de répondre aux défis du monde extérieur. Neurones de la drosophile adulte cerveau central sont dérivés d'un nombre limité de cellules souches neuronales, appelées neuroblastes (NBS), au cours du développement ^{1, 2.} La plupart des NBs participants dans le cerveau neurogenèse chez la drosophile subissent la division asymétrique pour générer NBs d'auto-renouvellement et les cellules ganglionnaires mères (MGC), et les CMG ensuite passer par une autre série de division pour produire deux cellules filles qui se différencient en neurones ³ (figure 1A ). En raison de la complexité de la morphologie neuronale et les défis associés à l'identification des neurones spécifiques, une technologie d'étiquetage mosaïque positif, l'analyse de la mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (marcm), a été inventé pour permettre à l'visualization d'un seul neurone ou un petit sous - ensemble de neurones de la population de neurones environnants non marqués ^4.

Marcm utilise la flippase (FLP) / système cible de reconnaissance de FLP (FRT) pour médier une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues dans une cellule précurseur de séparation portant un allèle hétérozygote d'un gène répresseur, dont l' expression normalement inhibe l'expression d'un gène rapporteur ^4. Après la division mitotique des chromosomes recombinants sont isolés dans des cellules jumelles, de telle sorte qu'une cellule contient des alleles homozygotes du gène répresseur et l'autre cellule n'a pas de gène répresseur expression du rapporteur dans la cellule (et ses descendants) ne soit plus ⁴ bloqué. Trois modèles clonales sont habituellement trouvés dans une expérience de marcm quand FLP est induit stochastiquement en NBs ou CMG: une seule cellule et deux cellules-GMC clones, qui représentent la morphologie neuronale au resolutio une seule cellulen, et multi-cellulaire-NB clones, qui révèlent entiers modèles morphologiques de neurones dérivés d'un NB commun (figure 1B). La technique de marcm a été largement appliquée dans des études neurobiologiques de Drosophila, y compris l'identification du type de neurones permettant de reconstruire des réseaux de câblage du cerveau entier, des analyses de la lignée neuronale de la divulgation de l'histoire du développement des neurones, la caractérisation phénotypique des fonctions de gènes impliqués dans la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse neuronale et étudie la différenciation ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Étant donné que les étiquettes classiques marcm une seule des deux cellules filles (et les lignées) après l'événement de recombinaison mitotique induite, des informations potentiellement utiles depuis le côté non marqué est perdue. Cette limitation empêche l'application de la base MSystème ARCM à haute résolution analyse de nombreuses lignées neurales qui changent le destin des cellules dans le tempo rapide ou à la précision des analyses des fonctions des gènes dans les neurones identiques de différents animaux ^{11, 12.}

Twin-tache marcm (tsMARCM) est un système avancé qui marque les neurones dérivés d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes, ce qui permet la récupération des informations utiles à partir des deux côtés des cellules jumeaux, surmontant ainsi la limitation du système marcm ¹¹ initial ( Figure 2A - 2C). Dans le système tsMARCM, deux ARN interférence (ARNi) à base suppresseurs sont situés au trans-sites de chromosomes homologues dans une cellule précurseur, et l'expression de ces suppresseurs inhibent l'expression indépendamment de leurs reporters respectifs (figure 2B). Après mitotique recombinaison spécifique de site à médiation par le système FLP / FRT, le twsuppresseurs à base RNAi-o devenus séparés en cellules doubles pour permettre l'expression des journalistes distincts (figure 2B). Deux modèles clonales, une seule cellule associée à des clones monocellulaires et deux cellules-GMC associés aux clones multicellulaire-NB, sont généralement considérés dans une expérience tsMARCM (figure 2C). Informations dérivé d'un côté des cellules jumelles peuvent être utilisées comme référence pour l'autre côté, ce qui permet à haute résolution des analyses lignage neural, telles que la naissance à jour des neurones marqués, et analyse phénotypique des neurones identiques dans différents animaux pour l'enquête précise la fonction du gène de neurones ^{11, 12.} Ici, nous présentons un protocole étape par étape décrivant la façon de mener une expérience tsMARCM, qui peut être utilisé par d' autres laboratoires d'élargir leurs études sur le développement neuronal (ainsi que le développement d'autres tissus, le cas échéant) chez la drosophile.

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Protocole

1. Construire tsMARCM-ready Flies Utilisation du Requis transgènes ^{11, 13}

1. Générer la version originale de mouches tsMARCM-prêt de transgènes qui sont transportés par les mouches individuelles ¹¹ (voir le tableau 1). Effectuer génétiques schémas de passage des mouches standard, qui ont été décrites précédemment, en mettant plusieurs transgènes dans les mêmes stocks de mouches ^13.
   1. Dans une lignée parentale, assembler les transgènes de FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (le premier journaliste, mCD8 :: GFP; expression du transgène est sous le contrôle du promoteur de la séquence d'activation en amont, ce qui produit un journaliste de membrane-tethered du groupe de souris de différenciation 8 protéine fusionnée avec une protéine fluorescente verte) et UAS-rCD2RNAi (le suppresseur qui inhibe l'expression du second rapporteur, l'ARNi contre l'expression de groupe de rat of différenciation 2, RCD2) sur le bras gauche de la 2 ^ème chromosome. Endroit -GAL4 pilote sur le X ou du chromosome 3 ^ème, si possible tissu-spécifique.
   2. Dans l'autre lignée parentale, assembler les transgènes de FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (le deuxième journaliste, RCD2 :: RFP, l'autre journaliste de la membrane-tethered constitué de la protéine RCD2 fusionnée avec une protéine fluorescente rouge) et UAS-GFPRNAi (le dispositif de suppression qui inhibe l'expression de la GFP de mCD8, l'ARNi contre l'expression de la gfp) sur le bras gauche de la 2 ^ème chromosome. Placez choc thermique (hs) -FLP ou FLP de tissu-specific- sur le X ou 3 ^e chromosome, si possible.
2. Générer la nouvelle version de mouches tsMARCM-prêt de transgènes qui sont transportés par les mouches individuelles ¹⁴ (voir le tableau 1). Effectuer mouche génétique schémas de croisement standard, qui ont été décrits précédemment, en mettant plusieurs transgènes dans les mêmes stocks de mouches ^13.
   1. Dans une lignée parentale, assembler les transgènes d'un site FRT et UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (un transgène combiné de mCD8 :: GFP et le suppresseur qui inhibe l'expression de RCD2 :: RFP) dans le même bras le 2 ^e ou 3 ^e chromosome (paires appropriées de transgènes de FRT et UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sont indiqués dans le tableau 1). Placer un tissu conducteur spécifique GAL4 sur les chromosomes autres que le chromosome du site FRT choisi, si possible.
   2. Dans l'autre lignée parentale, assembler les transgènes d'un site FRT et UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (l'autre transgène combiné de RCD2 :: DP et le suppresseur qui inhibe l'expression de mCD8 :: GFP) dans le même bras des 2 ^e ou 3 ^e chromosomiques (paires appropriées de transgènes de FRT et UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi sont indiqués dans le tableau 1). Placer hs-FLP ou un tissu spécifique, FLP sur les chromosomes autres que le chromosome du site FRT choisi, si possible.

2. Cross tsMARCM prêt Mouches pour générer tsMARCM Clones dans leur descendance

1. Mouches Croix-tsMARCM prêts ensemble (par exemple, mettre 10-15 mouches mâles de l' étape 1.1.1 ou 1.2.1 et 20-30 femelle vierge mouches de l' étape 1.1.2 ou 1.2.2 ensemble) dans un flacon fly-alimentaire avec des produits frais -made pâte de levure sur la paroi du flacon.
2. Maintenir les mouches tsMARCM-prêts croisés à 25 ° C pendant 2 jours pour augmenter les chances de l'accouplement avant la collecte des œufs fécondés.
3. Fréquemment transférer les mouches tsMARCM-prêts croisés dans des flacons fraîchement yeasted pour éviter l'encombrement (appuyez vers le bas vol ou l'utilisation du dioxyde de carbone pour anesthésier les mouches pour faciliter le transfert, gardez pas plus de 80-100 oeufs fécondés dans un 10 ml fly-alimentaire vial pour éviter un trop grand nombre de larves écloses).
4. Culture animaux tsMARCM (ie, les œufs fécondés, un exemple du génotype des animaux tsMARCM, tel qu'il est utilisé dans la figure 3, est hs-FLP ^[22], p / p; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +) qui ont été mis dans les flacons en série transférés à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils développent les étapes souhaitées (par exemple, les embryons, larves, ou nymphes).
5. Placez les flacons transférés qui contiennent des animaux tsMARCM au même stade de développement à un bain de 37 ° de l'eau pour 10, 20, 30, 40, et 50 min pour déterminer le temps optimal de choc thermique qui induit l'expression de FLP pour générer la clones tsMARCM d'intérêt. Passer cette étape si FLP de tissu-specific- est utilisé dans l'expérience tsMARCM (hs-FLP est préféré pour la lignée neurale analyses, les raisons de cette préférence ont été décrits précédemment ¹⁵).
   REMARQUE: Répétez l'étape 2.5 en utilisant le temps optimal de choc thermique dans les futures expériences de tsMARCM si plusieurs clones tsMARCM d'intérêt sont recherchés; généralement, plus d' expression FLP est induite dans hs-FLP ^[22] par rapport à hs-FLP ^[1] avec le même temps de choc thermique.
6. Culture des tsMARCM animaux de choc thermique à 25 ° C jusqu'à ce qu'ils aient atteint le stade de développement approprié, puis passez à l'étape 3.

3. Préparer, Teinté et Brains mont Fly contenant tsMARCM Clones

1. Préparer des plats pince-protection. Mélanger la partie A (30 g) et la partie B (3 g) de la trousse d'élastomère silicone avec du charbon actif (0,25 g). Verser le mélange dans les plats appropriés.
2. Disséquer larvaires, la pupe, ou les cerveaux adultes sur les animaux tsMARCM dans 1x tampon phosphate salin (PBS) en utilisant une pince sur un plat pince-protection vu à travers un microscope de dissection. NOTE: Un protocole pour la mouche dissection du cerveau a été described précédemment ^16.
3. Fixer les cerveaux de mouches dans une plaque de tache de verre avec 1x PBS contenant 4% de formaldéhyde à la température ambiante pendant 20 min. Traiter les cerveaux des mouches dans cette plaque de tache de verre pour le reste des étapes.
4. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT (1x PBS contenant 1% de Triton X-100) et les laver trois fois pendant 30 minutes chacun dans 1% PBT (rinçage: retirer PBT et ajouter de nouvelles PBT rapidement; laver: supprimer PBT, ajouter de nouvelles PBT, et incuber les cerveaux de mouches dans la nouvelle PBT utilisant un agitateur orbital).
5. Incuber le cerveau de la mouche avec le mélange d'anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à la température ambiante. Un exemple de mélange d'anticorps primaires de rat est un anticorps anti-CD8 (1: 100), un anticorps anti-lapin DsRed (1: 800) et anti-Bruchpilot (BRP) un anticorps de souris (01h50) dans 1% de PBT contenant 5% de sérum de chèvre normal (NGS).
6. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT, puis les laver trois fois pendant 30 minutes chacune avec 1% PBT.
7. Incuber le cerveau de la mouche avec le mélange d'anticorps secondaires pendant une nuit à 4 ° C ou pendant 4 heures à la température ambiante. Un exemple du mélange d'anticorps secondaire est un anticorps IgG de chèvre anti-rat conjugué à un colorant vert fluorescent (1: 800), un anticorps de chèvre anti-IgG de lapin conjugué avec un colorant jaune fluorescent (1: 800) et de chèvre anti-souris anticorps IgG conjugué avec un colorant rouge lointain fluorescent (1: 800) dans 1% PBT contenant 5% de NGS.
8. Rincer le cerveau de la mouche trois fois avec 1% PBT, puis les laver trois fois pendant 30 minutes chacune avec 1% PBT. Montez-les sur une lame micro avec un réactif anti-trempe. Mettez un micro couvercle en verre sur la diapositive micro pour couvrir et protéger le cerveau de la mouche. Sceller les bords du verre de couverture et micro slide micro à l'aide de vernis à ongles transparent. Stockez ces montées et scellées voler des échantillons de cerveau à 4 ° C.

4. Prendre, processus et l'analyse des images fluorescentes de tsMARCM Clones

1. Capture d'images fluorescentes de tsMARCM clones from les échantillons créés à l'étape 3.8 en utilisant le système de microscopie confocale de choix.
2. Piles de projets de tsMARCM images fluorescentes confocale en deux dimensions, aplaties images en utilisant le logiciel de traitement d'image fourni avec le système de microscopie confocale de choix (voir Figure 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O et 3Q - 3T pour des exemples de aplaties confocale des images fluorescentes).
3. Comptez le nombre de cellules des côtés multicellulaire-NB des clones tsMARCM utilisant un logiciel de traitement d'image approprié (par exemple, la fonction "Cell Counter" dans ImageJ ^17; voir la figure 3E, 3J, 3O et 3T pour des exemples de la cellule les corps des neurones).

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Résultats

Le système tsMARCM a été utilisé pour faciliter l'analyse et la lignée neuronale études de la fonction génique en récupérant des informations importantes sur les neurones dérivés de NBs communs. Le système a été utilisé pour identifier la plupart (sinon tous) types de neurones, déterminer le nombre de cellules de chaque type neuronal, et déterminer la naissance ordre de ces neurones ^{11, 12,}

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Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Les étapes 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, et 3.2 sont essentiels pour obtenir de bons résultats de tsMARCM. Les conducteurs de -GAL4 spécifiques de tissus qui n'expriment pas GAL4 dans les progéniteurs neuraux sont préférées pour les étapes 1.1.1 et 1.2.1. Éviter le surpeuplement des animaux cultivés dans les flacons fly-alimentaires à l'étape 2.3. Parce que le temps de latence d'induction, le niveau d'expression de FLP lors de c...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones