Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
据估计,植物产生超过20万不同类型的化合物1。只有这些化合物的少数人似乎发挥植物的初级代谢,其中燃料的生长繁殖的作用;多数是所谓的次级代谢产物。尽管他们的名字,次生代谢产物往往是植物生存和繁殖至关重要,因为它们有助于吸引授粉或抵御病原体和食草动物1工厂。
芥子油苷是一个非常多元化的类,已经研究了超过150年2次生代谢产物。迄今为止,130多个结构不同的硫代葡萄糖苷已经确定3。广义地说,硫代葡萄糖苷可以细分成基于从它们所合成的氨基酸上不同的类。吲哚芥子油苷,例如,从氨基酸合成色氨酸,而苯丙氨酸为芳香族硫甙4的合成的基本骨架。中的类,有结构的多样性,这是由在生物合成途径顺序链延伸的步骤,如在类脂肪族硫代葡萄糖苷的带来的,或由侧链修饰(如羟基化)4,5的一个高的水平。其中硫甙的植物物种可能包含属于不同结构类型6多达37种不同的硫代葡萄糖苷。尽管植物具有典型的硫甙配置文件,该类型的硫代葡萄糖苷种内变异个体和群体6,7中经常发现。完好苷存储在植物细胞的液泡,并且可以在任何地上或地下器官7可以发现,<SUP类=“外部参照”> 8,9。当细胞破裂(如通过取食),硫甙被释放,并与酶的黑芥子酶混合,掀起了芥末油弹10。由于黑芥子酶的活性,并根据不同的芥子油苷,反应条件,和修饰酶的存在的结构中,形成不同的刺激性,毒性或有害化合物,例如腈和(异)硫氰酸11。反应产物具有高生物活性;例如,它们充当多面手植食性昆虫12的驱虫剂。硫代葡萄糖苷的遗传和生物合成途径是很好的研究,主要是因为它们对草食动物和病原体的抵抗力,它们的值作为芥末白菜和香味成分,其负(progoitrin)和对人体健康的5阳性(葡萄糖萝卜硫苷)的影响的重要性, 13,14。
因为在硫代葡萄糖苷作为基于反相高压液相色谱(HPLC)配备有紫外(UV)或光电二极管阵列的生物活性化合物,提取和检测方法的极大的兴趣(PDA)检测器已被广泛自20世纪80年代15使用。基于该方法,欧洲共同体发出被用于芥子油苷的油籽分析( 欧洲油菜 ,菜籽,油菜籽16)测试和验证在几个实验室的标准协议。他人加入到这一方法( 例如,通过确定不在油菜本苷附加响应因子)17。尽管液相色谱-质谱(LC-MS)的平台和高通量协议芥子油苷分析18中的增加的可用性P>,19日 ,原HPLC-UV / PDA方法仍然被广泛用科学家使用。其主要原因是,这种方法很简单,性价比高,而且相对访问实验室没有一个广泛的化学分析知识基础设施。为了服务于这个社会,我们在这里详细的协议硫代葡萄糖苷从植物原料提取和他们desulfo表单与HPLC-PDA进行分析。
1.溶液的制备所需硫甙提取
2.提取安装的制备
5 / 55425fig1.jpg“/>
图1:机架甙提取。正视图(左)和一个自制柱架和块的芥子油苷的提取的俯视图(右侧)。高度:100毫米,间距错开孔(保持巴斯德吸管列):30毫米(x轴)×15毫米(y轴)。 请点击此处查看该图的放大版本。
3.列和离心管的制备
4.硫甙的提取
5.提取样品测定高效液相色谱法
时间[分钟] | 流[毫升/分钟] | % 一杯水 | %B ACN |
1 | 0.750 | 98 | 2 |
35 | 0.750 | 65 | 35 |
40 | 0.750 | 98 | 2 |
柱温度40℃。 |
表1:乙腈-水梯度进行芥子油苷的分离和analysiS于反相HPLC。
时间[分钟] | 流[毫升/分钟] | % 一杯水 | %B ACN |
1 | 0.750 | 98 | 2 |
10 | 0.750 | 89.3 | 10.7 |
11 | 0.750 | 98 | 2 |
柱温度40℃。 |
表2:缩短乙腈-水梯度为用于芥子油苷的量化的五个sinigrin引用的定量。
6.硫代葡萄糖苷鉴定和定量
图2中最常见的芥子油苷类的UV光谱。六desulfoglucosinolates(GSL)紫外吸收光谱(200-350纳米)的基础上,提出这里描述,代表着最常见的结构类中提取的市售参考化合物的溶液。共同的名字,Structural名称(括号之间),和结构类中给出。 (A)中Sinigrin(2-丙烯基GSL),链烯基; (B)glucoerucin(4-甲硫基丁基GSL),thioalkenyl; (C)葡萄糖萝卜硫苷(4-methylsulfinlybutyl GSL),亚硫酰基; (D)的glucobrassicin(吲哚-3-基甲基GSL),吲哚; (E) - gluconasturtiin(2-苯乙基GSL),芳香族; (F)sinalbin(4-羟基苄GSL),芳族的。 请点击此处查看该图的放大版本。
这种方法能够检测和在所有的结构类通常发现desulfoglucosinolates分离( 图3)。有害-2- hydroxyglucosinolate progoitrin进来色谱相对早,显然从有利甙葡萄糖萝卜硫苷,在这种样品中的唯一methylsulfinylglucosinolate分离。 Sinigrin,gluconapin和glucobrassicanapin形成具有增加的侧链长度(C3,C4,和C5,分别地)的eluotropic系列烯硫代葡萄糖苷。类似的逻辑系列是可见的两个methylthioalkenyl硫代葡萄糖苷,glucoiberverin(C3)和glucoerucin(C4)。三吲哚芥子油苷,glucobrassicin的和4-羟基和1- methoxyglucobrassicin(neoglucobrassicin)的峰及其衍生物,也明确分开。应当指出的是neoglucobrassicin和glucoerucin的峰,以及gluconasturtiin,唯一的芳香族葡糖sinolate此示例中,是在该芸苔属提取物特别高由于加入根提取物的组合9。
图3:芥子油苷提取物的色谱图。从黑芥结合根冠样本,白菜和 甘蓝的分析产生的HPLC色谱图的详细信息(1-32分钟)。该峰标签注明的保留时间和认定desulfoglucosinolates缩写(GSL)。 PRO = progoitrin(2-OH-3-丁烯基GSL); RAPH =葡萄糖萝卜硫苷(4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = sinigrin(2-丙烯基GSL),GNA = gluconapin(3-丁烯基GSL); 4OH = 4- hydroxyglucobrassicin; IBV = glucoiberverin(3-甲硫基丙基GSL); GBN = glucobrassicanapin(4-戊GSL); ERU = glucoerucin(4-甲硫基丁基GSL); GBC = glucobrassicin(吲哚-3-基甲基GSL); NAS = gluconasturtiin(2-苯乙基GSL); NEO = neoglucobrassicin(1-甲醇 - glucobrassicin)。 请点击此处查看该图的放大版本。
较长链的甲基亚硫苷,其在模式植物拟南芥中常见的,也显示出eluotropic系列,如在奥地利葶苈的根提取物可见。 Glucohesperalin(C 6),glucosiberin(C7),glucohirsutin(C8),和glucoarabin(C9)出现在色谱图上( 图4)定期。与峰的UV光谱一起,例如eluotropic逻辑系列可被用来进行分类,并暂时识别,未知芥子油苷。
图4:色谱(帧9-30分钟)在奥地利葶苈根提取物的desulfoglucosinolates的。该峰标签注明的保留时间和认定desulfoglucosinolates缩写(GSL)。 HES = glucohesperin(6 methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin(7 methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin(吲哚-3-基甲基GSL); HIR = glucohirsutin(8 methylsulfinlyoctyl GSL); ARA = glucoarabin(9- methylsulfinylnonylglucosinolate); NEO = neoglucobrassicin(1-甲醇 - glucobrassicin)。 请点击此处查看该图的放大版本。
统称 | 侧链结构 | RT(分钟)* | 229纳米 | 参考# |
aliphatiç硫代葡萄糖苷 | ||||
Glucocapparin | 甲基 | 3.5 | 1 | 棕色 |
Sinigrin | 2-丙烯基 | 5.5 | 1 | 布朗,EC |
Gluconapin | 3-丁烯基 | 9.5 | 1.11 | EC |
Glucobrassicanapin | 4-戊烯基 | 13.5 | 1.15 | EC |
Glucoiberverin | 3甲硫 | 10.9 | 0.8 | 棕色 |
Glucoerucin | 4,甲硫基丁基 | 14.0 | 0.9 | 棕色 |
Glucoiberin | 3 methylsulfinylpropyl | 3.7 | 1.2 | 棕色 |
葡萄糖萝卜硫苷 | 4 methylsulfinylbutyl | 4.9 | 0.9 | 棕色 |
Glucoalyssin | 5 methylsulfinylpentyl | 7.6 | 0.9 | 棕色 |
Glucohesperin | 6 methylsulfinylhexyl | 10.5 | 1 | 棕色 |
Glucosiberin | 7 methylsulfinylheptyl | 13.5 | 1 | 棕色 |
Glucohirsutin | 8 methylsulfinyloctyl | 16.8 | 1.1 | 棕色 |
Glucoarabin | 9 methylsulfinylnonyl | 20.5 | 1 | |
Glucocheirolin | 3 methylsulfonylpropyl | 4.2 | 0.9 | 棕色 |
Progoitrin | -2(R)-OH -3-丁烯基 | 4.5 | 1.09 | 布氏,EC |
Gluconapoleiferin | 2-OH-5-戊烯基 | 8.3 | 1 | EC |
吲哚硫甙 | ||||
4 hydroxyglucobrassicin | 4-羟基吲哚-3-基甲基 | 11.2 | 0.28 | 布氏,EC |
Glucobrassicin | 吲哚-3-基甲基 | 15.3 | 0.29 | 布氏,EC |
4 Methoxyglucobrassicin | 4-甲氧基-3-甲基 | 18.2 | 0.25 | 布氏,EC |
Neoglucobrassicin | 1-甲氧-3-基甲基 | 22.5 | 0.2 | 布氏,EC |
芳香硫代葡萄糖苷 | ||||
Sinalbin | 4-羟基苄基 | 8.1 | 0.5 | 布氏 |
Glucosibarin | -2(R)-OH -2-苯乙基 | 12.1 | 0.95 | 看下 |
Glucobarbarin | -2(S)-OH -2-苯乙基 | 12.7 | 0.95 | 布氏 |
Glucotropaeolin | 苄 | 13.8 | 0.95 | 布氏,EC |
Gluconasturtiin | 2-苯乙基 | 18.0 | 0.95 | 布氏,EC |
未知-脂肪/芳香像紫外光谱 | 1 | EC | ||
未知-吲哚样谱 | 0.25 | EC | ||
*近似保留时间(RT)四舍五入到最接近的0.1分钟(±0.3分钟取决于柱,洗脱剂质量)。保留时间在配备有C18柱(150×4.6毫米,3微米粒度)和C 18赛默飞/戴安终极性HPLC平台确定预柱(10×4.6毫米,5微米颗粒尺寸)用梯度程序如表1。 | ||||
#参考响应因子:油菜籽布氏,R.在芥子油苷(ED JP Wathelet)50-58(马丁努斯Nijhoff出版社,1987年);布朗,PD,Tokuhisa,JG,艾香德,M.&赫尔申宗,不同的器官和拟南芥的发育阶段中硫甙的积累J.变化。植物化学。 62(3),471-481,DOI:10.1016 / S0031-9422(02)00549-6,(2003); EC。油菜籽 - 葡萄糖甙测定高效液相色谱法。官方公报欧洲共同体。大号二十八分之一百七十○。附件八03.07.27-34(1990年)。 |
表3:响应因子中最常见的desulfo-苷植物提取物和它们的近似的保留时间上-C 18列。洗脱液,gradienT,柱温度和流速如表1。
这种建立并广泛使用的方法的最大优点是,它是强大的,而简单,每个样品成本相对较低。最需要的提取和分析设备应当以标准的实验室提供,或者可以是自建,用HPLC-PDA的异常。另一个优点是,保持冷却,并在气密法(HPLC)的小瓶中时溶解在水中desulfoglucosinolates是化学相当稳定,因此,提取物可以很容易地运用于HPLC分析别处。相对于LC-MS平台,这需要专门的培训和管理软件和分析数据丰富的实践经验,HPLC-UV /掌上电脑可以很容易地短暂培训后运行。这不仅降低了过程的成本,同时也使得该方法更容易获得的广泛的科学家,包括学生。
一般来说,当上述的过程遵循carefuLLY,应该会出现一些问题。在一般情况下,芥子油苷峰很好在色谱分离。如果不是这种情况下,该梯度程序可以通过降低洗脱液乙腈增加速率进行调整。另外,建设一个新的预柱(200-500注射)或列(1500 -2000注射)可以解决这个问题。偶尔,在分批单个样品的色谱图可以显示出非常小的或没有峰。这通常是由于移液误差添加硫酸时( 例如,一个列被跳过或硫酸未洗净,下入列)。或者,在试验材料的芥子油苷的浓度可能是低于预期并用于提取材料太少。如果是后者的情况下,注射量可增至100微升,或提取物的精确等分试样( 例如,800微升)可被浓缩。后者可以通过冷冻干燥来实现ING的提取物,将残余物溶解于水的体积较小( 例如,100μL),并使用相同的参考曲线回灌。在计算对提取物的初始浓度,数字应乘以稀释因子相乘。如果这没有解决的问题,材料应再次使用更多的原料萃取。如果这是超过100毫克时,萃取溶剂的体积和管的尺寸应按比例调整,以维持提取效率。
一个附加的优点是,这种方法已被充分验证的。这是因为它已被描述为用于芥子油苷的在油菜籽的量化,对于其中的程序和准确性被证实在几个实验室16的标准方法。此外,遗传背景,生物合成,和芥子油苷的生物学功能都受到紧张的研究努力,在模除其他4,6,12埃尔植物拟南芥 。因此,许多响应因子有关sinigrin desulfoglucosinolates的精确量化的明确界定和公众提供15,17。即使基于LS-MS-协议是更高通量,更敏感,并能够(暂定)确定苷的量没有标准是可用的18,19,20,用于LC-MS缺乏普遍响应因子限制硫甙含量18的精确量化。而且,这些方法通常不包括冷冻干燥步骤,并且水的量在新鲜植物材料是下落不明在计算中,使得精确量化困难。最后,因为我们的提取方法包括一列系纯化和浓缩步骤,它也可以适用于“脏”的样品浓度低硫代葡萄糖苷,如土壤21。
相比基于LC-MS的方法,通常提取新鲜冷冻的材料,使用96孔板进行萃取,并且不包括硫酸步骤18,19中 ,我们的方法是比较费时和劳动密集。用在本文中所述的柱支架,一个人可以在一天中提取约100-150样品。洗脱(次日),冷冻干燥(过夜),并重新溶解可以在随后的两天内进行。用自动HPLC注射器,每注射40-45分钟的运行和平衡时间,并且没有不可预见的事件,这将需要3-4天采集数据这一样本集。当HPLC软件允许基于sinigrin曲线,色谱图和PE的手动检查自动定量对100个样品AK分配可能只需要另一个1或2小时,可用于统计分析前的数据。
尽管甙标准的日益普及,只有130多个应聘者的一小部分目前可商用买来的。然而,对于每个生物合成类的一些参考;先前在植物物种中发现的接入文献数据库指定化合物( 如,费伊等人的22);色谱原则,如eluotropic系列的逻辑基本知识( 例如,对于在脂肪族化合物侧链增加Cs中的数字, 图3和4);单样本对LC-MS 19或23核磁共振孤立硫代葡萄糖苷的验证,人们可以很容易地克服这个限制。对于大多数的硫甙分析协议使用内部参考曲线( 即,在一定的浓度为sinigrin的提取或sinalbin到提取溶剂16,17,19)。原则上,内部基准曲线是比较合适的,以校正各试样处理错误,从而在理论上得到更高的精度。尽管这样的优势,我们更喜欢使用一个五点外部基准曲线,我们经常分析不同的野生物种,其中一些含有高含量sinigrin( 例如,黑芥 24)或sinalbin( 例如,白芥 25),该2甙引用为其响应因子可用。此外,添加内部标准,以每个样品增加了分析的成本,因为高品位甙参考标准通常是相当昂贵的。
总之,尽管耗时的步骤,该协议提供了一个简单和方便的方法来提取和植物样品中硫代葡萄糖苷定量。然而,要考虑到的芥子油苷水平本身只有一个在反应产物中的潜在的生物活性的指示,被视为有必要用芥子酶反应,和变化可以从一个单一的芥子油苷11出现是重要的。验证试验必须进行确认生物相关性。
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish | Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
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