评估心肌亚型以下鼠标胚胎成纤维细胞的转录因子介导的重编程

摘要

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

摘要

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

引言

心脏是在胚胎^1，2，开发的第一个功能器官。与循环系统相结合，其提供氧，营养物，和开发过程中的废物处理机制。受精后三个星期，人的心脏跳动，第一次和适当的调整则是由心肌细胞（CMS）维护。因此，这些特殊细胞的不可逆损失是潜在的进行性心脏衰竭的根本问题。而一些生物如斑马鱼和爪蟾具有用于心脏再生的潜力，成年哺乳动物心脏较为有限^3，5，6。因此，由于心脏的重要功能，是不令人吃惊的是心脏疾病是全世界死亡的首要原因，占仅⁷美国60万人死亡。该refore，基于细胞的疗法有效地修理或更换损伤心肌是伟大的具有临床意义。

山中和同事⁸的开创性的研究表明，四种转录因子的强制表达足以完全分化的成纤维细胞转化为多能干细胞。不过，所有的多能干细胞的策略的致瘤能力已在其用于治疗目的使用的一个关键问题。这促使科学领域寻找替代方法转分化的细胞，同时避免多能的阶段。最近，一些团体已经通过与转录异位表达显示小鼠成纤维细胞直接转化为诱导的心肌样细胞（iCLMs）显示了这一战略的可行性因素GATA4，MEF2C，Tbx5中，后来，HAND2（GMT和GHMT分别^）9，10。 Furthermore，同样的策略可以在体内和人衍生的组织^9，11，12来进行。最近的研究已强调了额外的因素或可被调制以进一步改善心脏重编程效率^13，14，15的信号通路。总之，这些研究表明定向转分化为再生疗法的潜力。然而，CM重新编程，未知的分子机制，重复性不一致由于方法上的差异¹⁶低效率，iCLMs的异质性仍未得到解决。

为了直接评价iCLM异质性，我们设计了一个离散的和强大的单细胞测定为肌节发展和心脏谱系specificatio的识别正两个功能的心肌细胞的必要特征。存在由它们的位置和独特的电特性定义在心脏的至少三个主要类型的CM:心房（AM），心室（VM）和起搏器^{（PM）17，18，19，20。}在一个精心策划的组合，他们让血液正常抽水。在心脏损伤，一个或所有亚型可能会受到影响，细胞治疗的类型，需要根据具体情况逐案予以解决。目前，大多数战略，注重整体代心肌细胞，而少量的工作正在做研究，调节亚型规范的分子机制。

下面详细研究如何正确量化井井有条肌节，并确定一组不同的亚型心肌的。使用心脏起搏器（PM）专用鼠标的记者，我们可以申请一个我mmunocytochemical方法来区分诱发房状细胞（IAM），诱发室状细胞（IVM），并诱导般的PM肌细胞^{（IPMS）21。}根据我们的观察，只表现出肌组织细胞能够自发跳动。这种独特的重新编程平台可以评估的作用 在肌组织，子规范，CM重编程效率的某些参数在单细胞分辨率。

研究方案

涉及动物的做法，所有的实验程序进行的机构动物护理和使用委员会在UT西南医疗中心的批准。

1.隔离HCN4-GFP E12.5小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）

1. 建立纯合子HCN4-GFP男性和CD-1雌性间定时交配。
2. 在二氧化碳安乐死和随后的颈椎脱位E12.5牺牲怀孕的女性。
   1. 与解剖钳除去子宫角，如前所述^22，23，并将其放置在不含Ca ²⁺或Mg上用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）冰上的培养皿^2+。
3. 执行使用无菌技术在组织培养罩的所有后续步骤。
   1. 取下子宫羊水和胚胎囊用剪刀和镊子解剖。请附更好地处理胎盘。孕NT CD-1雌性通常生出的幼崽10和14之间。
   2. 使用解剖钳，取分离的胚胎，并迅速在70％（体积/体积）乙醇冲洗它们的两倍。
      注:清洗要快，尽量减少细胞死亡。
   3. 取出头部，四肢，尾巴，内脏器官，包括从隔离胚胎的心脏。
   4. 使用无菌刀片在尺寸约为1mm ³放置剩余组织在10-cm培养皿用1ml 1X PBS中并精细地剁碎的。
   5. 转移组织糜与PBS中的50毫升锥形管中。
   6. 旋在300×g离心3分钟。小心吸多余的PBS。
   7. 加入1毫升每胚胎无菌0.25％胰蛋白酶EDTA的。孵育在37℃水浴中的细胞15分钟。轻轻地混合管，每4分钟。在消化组织将显著降低产量。
   8. 以最大速度（3200 RPM）为4秒涡细胞混合物。
   9. 加入2毫升的成纤维细胞培养基，每个胚胎混匀。过滤ŧhrough用吸管通过过滤器，以帮助细胞100微米的细胞滤网。请参阅表1为所有后续介质的制定。
   10. 旋转300 XG 4分钟。小心吸上清。
   11. 加入10 mL新鲜的成纤维细胞培养基每3个胚胎和磨碎6-10倍。
   12. 板1 15厘米的组织培养皿中的细胞制备的每3个胚胎。培养过夜在37℃，5％CO ₂培养箱。
   13. 隔夜培养后，用新鲜的30毫升每平板培养基更换介质。将细胞放回培养箱中过夜。
       注意:检查在荧光显微镜下HCN4-GFP ⁺细胞污染。文化应该是GFP ^-也只有在重新编程成为GFP ^+。
   14. 第二天，收获细胞用3mL新鲜预热0.25％胰蛋白酶-EDTA的。计数和冻结的细胞。通常情况下，冻结的细胞以每毫升3×10 ^6个细胞。预期一愕LD应每个胚胎3×10 ^6个细胞。

2.逆转录病毒生产和再编程

注意:以下协议要求传染性逆转录病毒的生产和处理。在执行BSL-2准则和无菌技术在生物安全等级2机柜下面的步骤。用10％漂白粉处置暴露于逆转录病毒的所有材料。

1. 逆转录病毒的生产和MEF中准备
   注意:以下协议是用于在6孔板逆转录病毒生产和MEF感染在24孔板中。对于其它的格式， 见表2。的MEF是在-1天镀，所以定时将需要为每个实验进行适当协调（参见第2.3节和图2）。
   1. 维持开发平台-E（PE）细胞根据制造商的建议。简言之，将培养的PE细胞在DMEM补充有10％FBS，1微克/毫升puromy霉素，10微克/毫升杀稻瘟菌素，青霉素和链霉素。传代细胞1:4时，培养物达到70-90％汇合每两天。
   2. -2天 :转染前一天，种子开发平台-E细胞以1×10 ^6个细胞/孔在转染培养基一个6孔板。细胞应在转染时70-80％汇合。
2. 转染使用市售的转染试剂。
   注:商用试剂应在转染前室温（RT）。为DNA转染，添加每个逆转录病毒质粒DNA单独（G，H，M和T），以形成一个GHMT鸡尾酒^9。
   1. -1天:在15 mL锥形聚苯乙烯管中，用每个反应的转染试剂的6微升混合降低血清培养基60微升为一6孔板格式。孵育混合物，在室温下5分钟。
      注意:由于在这里所使用的转染试剂结合到塑料，一的dd直接向低血清培养基，以避免在转染效率的任何降低。
   2. 添加共2微克每反应GHMT鸡尾酒，并轻轻拍打至混合。不要旋涡。在室温下孵育15分钟进行反应。
   3. 从步骤2.2.3中逐滴的方式PE细胞添加混合物。
   4. 孵育转染的开发平台- E细胞过夜，37℃，5％ _二氧化碳培养箱。记录转染时。
3. HCN4-GFP小鼠胚胎成纤维细胞的播种。
   1. 电镀的MEF前1小时，准备免疫细胞化学24孔板。
      1. 添加每孔12mm的纤连蛋白盖玻片。
      2. 大衣井用300微升牛胶原溶液（ 如 SureCoat）孵育在37℃培养箱1小时。
      3. 立即MEF电镀之前抽吸涂覆溶液。
   2. 解冻HCN4-GFP的MEF的冷冻小瓶中并用预热fibrobl洗X1在500×g离心5分钟AST介质。
   3. 采用台盼蓝染色或类似的染料确定细胞活力。计算使用下面的公式每毫升的活细胞培养的对数:
      ％存活细胞= [1.00 - （总细胞的蓝色细胞总数/总数）]×100
      1. 计算使用下面的公式存活细胞总数:
         细胞悬浮液的活细胞=％存活细胞×稀释系数x 10,000×总体积
   4. 种子3×10 ^4个细胞每孔到与先前制备牛胶原溶液，纤连蛋白盖玻片24孔板中。
4. 转导和的MEF重编程
   注:根据制造商的注意事项，保养得当开发平台-E细胞产生的1×10 ⁷感染单位/毫升的平均滴度。虽然滴度不直接对每个实验测定GFP的控制总是包括作为感染效率的替代品。高GFP表达和强度（GFP ^+> 95％）通常与相关成功GHMT介导代iCLMs的。
   1. 0天:24小时转染后，通过0.45微米孔径无表面活性剂的醋酸纤维素过滤器过滤在PE逆转录介质和转移到15毫升锥形管中。添加凝聚胺至8微克/毫升的最终浓度。仔细补充细胞2毫升新鲜染培养基。
      注意:如果媒体被改变得太快细胞很容易地从板脱落。
   2. 吸出培养的MEF的介质，并添加新鲜收集逆转录病毒介质;它应产生1.7毫升介质每孔一个6孔板的。每添加一个24孔板的〜800微升。返回MEF板的孵化器和孵化过夜。
   3. 第1天:重复步骤2.4.1和2.4.2。丢弃^第二次病毒采集后的细胞。返回感染的MEF的孵化器，并让他们休息过夜。
   4. 第2天:48小时诱导后，吸用1X PBS的细胞条件媒体和洗X1。加每一个24孔板的孔500μL的预温热iCLM介质。
   5. 更换iCLM媒体，每2 - 3天。病毒诱导的心脏重新编程的免疫细胞化学（ICC）分析后14天处理板。

3.重新编程的MEF免疫染色

1. 14天的诱导后，小心吸媒体。
2. 用冰冷的1×PBS中的300μL的冲洗每个孔中。吸干多余的解决方案。
3. 固定的细胞用每孔4％低聚甲醛（PFA）溶液24孔板的250微升。在室温下孵育15分钟。
   注:将固定的细胞可以存储在PBS在4℃下进行1 - 染色前2周。
4. 通透细胞用300微升0.1％PBS-100的TritonX（PBST）洗井X3。孵育在室温下洗涤之间5分钟。吸出最后一次洗涤后，多余的溶液。
5. 10座分在室温用1X通用块缓冲区以300微升/孔。
6. 准备（ICC）染色缓冲液:加1:1 1X PBS和1x通用的封闭液。稀释在IC卡染色缓冲第一抗体，并在4℃下孵育抗体过夜。请参考推荐的稀释材料部分。
   1. 染色一对幻灯片鼠标α辅肌动蛋白，鸡αGFP和兔NPPA为IPM和IAM鉴定。
   2. 染色一对幻灯片鼠标α辅肌动蛋白，鸡αGFP，并为IPM和IVM鉴定兔MYL2。
7. 次日，洗涤孔×3用300微升0.1％的PBST。孵育在室温下洗涤之间5分钟。吸出最后一次洗涤后，多余的溶液。
8. 在准备ICC染色缓冲二级抗体稀释液。请参考推荐的稀释材料部分。孵育的二抗于室温1小时后，避光。
   1. 染色所有幻灯片具有以下二次antibodie小号:鼠标的Alexa-555，鸡的Alexa-488和Alexa的兔-647。
9. 洗井X3 300微升0.1％PBST。孵育在室温下洗涤之间5分钟。避光。
10. 加含有1.5微克/毫升4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的到玻璃显微镜载片安装媒体的2.4微升。小心地从24孔板的孔取出盖玻片，除去过量溶液，并转移到载玻片带安装的介质。轻压盖玻片去除多余的量和空气。
11. 密封幻灯片与首选指甲油或塑料密封胶。商店安装在4℃避光幻灯片。

4.识别心脏亚型的使用共聚焦显微镜

注:对于成像，共焦显微镜配备有405能够光谱检测的至少2个荧光检测器，488，555，和639的波长是必要的，以便识别IPMS，IAMS和IVMS。 IMAG使用计划复消色差透镜20X / 0.75客观的或更好的E细胞。使用制造商的图像分析软件，扫描的图像缩放可以实现40X-油浸品质的图像。

1. 图片库:取8位图像用DAPI，Alexa的-488，Alexa的-555和Alexa-647通道（CH）。像素停留的第6号第1024帧大小，行步骤时间在2和2的平均是足够的高清晰度的图像。
2. 对于每个滑动，从一个边缘开始，并开始扫描上下为α辅肌动蛋白⁺肌节⁺细胞红色荧光通道（Ch。）（参见图3和图5A为实施例）。肌条纹更容易在555纳米波长的视觉识别。
   1. 一旦α辅肌动蛋白肌节^{+ + T}细胞已被确定，切换到绿色通道。并保持注意如果它是正数（IPM）。切换到计算机，以评估远红647章。 （IAM或IVM）。
      注:细胞是α辅肌动蛋白⁺ / ⁺肌节/ Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / MYL2 ^-被指定为IPMS。 GFP表达将在整个细胞（ 图4A）中可以看出。
   2. 染色幻灯片与α辅肌动蛋白（鼠Alexa555的），HCN4-GFP（鸡Alexa488），NPPA（兔Alexa647）和DAPI。是α辅肌动蛋白⁺ / ⁺肌节/ Hnc4-GFP的细胞^- / ⁺ NPPA是IAM。 NPPA染色会出现核周和点状（ 图4B）。
   3. 染色幻灯片与α辅肌动蛋白（鼠Alexa555的），HCN4-GFP（鸡Alexa488），MYL2（兔Alexa647）。阳性细胞α辅肌动蛋白⁺ / ⁺肌节/ Hnc4-GFP ^- / ⁺ MYL2 IVMS是。 MYL2染色将展出沿肌纤维横纹一个形式。由于在染色及Z平面的质量的变化，条纹可能不总是容易看到（ 图4C）。

5。量化

注意:为了评估潜在重新编程的MEF的实际数量，2个孔24孔平板的接种在平行于实验孔和电镀后收获一天。铺板的细胞的总数量，然后通过平均两个孔来确定。这成为镀实际的总的细胞（aTotal）。

1. 肌⁺
   1. 目视检查进行正确α辅肌动蛋白⁺ /肌节^+（右面板图3）和记录（ 图5B-i）的盖玻片每个小区。
   2. 由镀实际的总的细胞（aTotal）制表α辅肌动蛋白⁺ /肌节⁺对每个盖玻片和除法的总数（ 图5B-ⅲ）。例如，如果aTotal = 12500细胞，100细胞，α-辅肌动⁺ /肌节⁺然后，镀敷的MEF的0.8％被重新编程。平均reprograming实验将产生1％α -肌动蛋白⁺ /肌节⁺细胞（ 图5C）。
2. 亚型⁺
   注:对于下面的步骤，请参考图5B / C为代表性iCLM定量的工作流程。简单地说，对于每个小节⁺细胞，制表，如果它是为任一亚型（ 图5B-ⅰ）是唯一的。除以亚型⁺细胞的数量比的平均肌节⁺细胞×100（ 图5B-i）的计算％亚型（ 图5B-ⅲ）。为了计算绝对％亚型效率（ 图5B-iv）中 ，通过接种×100（ 图5B-ⅱ）细胞的总数量从图划分亚型⁺细胞数5B-i的 。
   1. 对于每个α辅肌动蛋白的⁺ /肌节⁺细胞，评估它们是否GFP ^{+，NPPA +}或MYL2 ^+。
   2. 制表α辅肌动蛋白⁺ /肌节⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA总数^- / MYL2 ^- ，辅肌动蛋白⁺ /肌节⁺ / Hnc4-GFP ^- / NPPA _⁺和α辅肌动蛋白⁺ /肌节⁺ / Hnc4-GFP ^- / MYL2 ⁺细胞（ 图_5B-1）。
   3. 计算每个亚型的百分比，通过以⁺ /肌节⁺细胞孔的α辅肌动蛋白的总数除以亚型⁺细胞的数目和由100 GHMT相乘产生IPMS，IAMS和IVMS以大致相同的比例（ 图图5B-ⅲ）。
   4. 计算亚型⁺细胞的绝对数量，除以亚型⁺细胞的总数通过aTotal实验条件和100（ 图5B-ⅱ）相乘。平均IPMS占总感染细胞群体的0.3％，IAMS 0.3％，和网络视频监控软件0.25％（ 图5B-IV）。

结果

服用特定的PM记者鼠标的优势，我们开发了多重免疫策略，确定为如图1所示多样化的内源性肌细胞。以下在图2所示的重新编程的步骤，亚型特异性的CM的诱导可以早在4第²¹天虽然是在低速率检测。在第14天，在实验可以停止并评估肌组织（ 图3）和亚型规范（ 图4）。 图5总结玻片制备的用于I...

讨论

本研究通过心脏转录的逆转录病毒介导的表达提供的MEF转换的直接重新编程战略转化为一组不同的亚型心脏因素GATA4，MEF2C，Tbx5中，和HAND2（GHMT）。在使用具有特定的PM记者鼠标组合多重染色的方法，我们能够确定（IAM），网络视频监控软件，并在IPMS单细胞分辨率。这种试验可以在隔离能力个别转录因子对亚型多样性和肌节发展的贡献的体外系统的实验研究。与此同时，这可能会带?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)	Sigma	F2442	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Component of iCLM media
MEM vitamin solution	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Component of iCLM media
MEM amino acids	Thermo Fisher Scientific	1601149	Component of iCLM media
Non-Essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics	Thermo Fisher Scientific	15240062	Component of iCLM media
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Component of iCLM media
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Component of Plat-E media
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Component of Plat-E media
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700	Zeiss		For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfection reagent
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)	Sigma	A7811	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	For virus filtration
6 mL Syringes	Covidien	8881516937	For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488	Abcam	AB150169	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	For cell permeabilization
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates	Olympus	25-260
6-well plates	Genesee Scientific	25-105
24-well plates	Genesee Scientific	25-107
10 cm Tissue culture dishes	Corning	4239
15 cm  Tissue culture dishes	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Conical tubes	Corning	4308
50 mL Conical tubes	Corning	4249
0.4% Trypan blue solution	Sigma	T8154	For viability
Ethyl Alcohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Scientific	6009