JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Аннотация

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Введение

Сердце является первым функциональным органом для развития у эмбриона 1, 2. В сочетании с кровеносной системой, она поставляет кислород, питательные вещества и механизм утилизации отходов в процессе разработки. Через три недели после оплодотворения, человеческое сердце бьется в первый раз, и его надлежащее регулирование поддерживается кардиомиоцитов (КМВ). Поэтому необратимая потеря этих специализированных клеток является фундаментальным вопросом, лежащий в основе прогрессирующей сердечной недостаточности. В то время как некоторые организмы , такие как данио и Xenopus имеют потенциал для регенерации сердца, взрослого сердца млекопитающих является более ограниченным 3, 5, 6. Таким образом, учитывая критическую функцию сердца, это не удивительно , что болезнь сердца является ведущей причиной смерти в мире, что составляет 600000 смертей в одной только 7 Соединенных Штатах.refore, клеточная терапия эффективно отремонтировать или заменить травмированного миокард имеют большой клинический интерес.

Семенной исследование Яманака и его коллеги показали , что 8 принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции является достаточным для превращения полностью дифференцированные клетки фибробласты в плюрипотентные стволовые клетки. Тем не менее, онкогенные мощность всех плюрипотентных стволовых клеток стратегий был серьезную озабоченность в их использовании в терапевтических целях. Это побудило научную область для поиска альтернативных методов трансдифференцироваться клеток, избегая при этом плюрипотентных стадии. В последнее время несколько групп показали целесообразность этой стратегии, показывая прямое преобразование фибробластов мыши в индуцированных кардиомиоцитов-подобных клеток (iCLMs) с эктопической экспрессии факторов транскрипции GATA4, MEF2C, Tbx5, а позже, Hand2 (GMT и GHMT , соответственно) 9, 10. Furthermore, та же стратегия может быть выполнена в естественных условиях и в тканях человека , полученных 9, 11, 12. Недавние исследования выделены дополнительные факторы или сигнальных путей , которые могут быть модулированы для дальнейшего повышения эффективности сердечной перепрограммирования 13, 14, 15. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют потенциал направленной трансдифференцировки для регенеративной терапии. Тем не менее, низкая эффективность СМ перепрограммирования, неизвестных молекулярных механизмов, несовместимым воспроизводимости из - за методологических различий 16 и гетерогенный характер iCLMs остаются нерешенными.

Для того, чтобы непосредственно оценить iCLM гетерогенность, мы разработали дискретный и надежный анализ одноклеточного для идентификации развития саркомера и сердечной клонального specificatioп-две необходимые характеристики функциональных кардиомиоцитов. Есть по крайней мере три основных типа КМ в сердце , как это определено их местоположение и уникальными электрическими свойствами: предсердия (AM), желудочковая (VM) и кардиостимулятором (PM) 17, 18, 19, 20. В спланированных комбинации, они позволяют надлежащим перекачку крови. Во время травмы сердца, один или все подтипы могут быть затронуты, и тип клеточной терапии необходимо будет решаться на индивидуальной основе случая. В настоящее время большинство стратегий сосредоточиться на общей генерации кардиомиоцитов, в то время как небольшая работа делается для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют спецификацию подтипа.

Следующее исследование подробно описано, как правильно определить количество хорошо организованных саркомеры и определить разнообразный набор кардиомиоцитов подтипов. Использование кардиостимулятора (ПМ) Определённые репортер мыши, мы можем применить Immunocytochemical подход , чтобы отличить наведенные предсердные типа миоцитов (IAM), индуцированное желудочковых типа миоцитов (IVM) и индуцированные PM-как миоциты (IPMS) 21. На основании наших наблюдений, только клетки, которые обладают организации саркомера способны спонтанного избиения. Эта уникальная перепрограммирование платформа позволяет оценить роль определенных параметров в организации саркомера, спецификации подтипа, и эффективность СМ перепрограммирования при разрешении одноклеточных.

протокол

Все экспериментальные процедуры, связанные с практикой животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в UT Юго-западного медицинского центра по.

1. Выделение Hcn4-GFP E12.5 мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)

  1. Настройка таймерные вязки между гомозиготных самцов Hcn4-GFP и CD-1 женщин.
  2. Жертвоприношение беременных женщин на E12.5 по эвтаназии двуокиси углерода и последующего смещения шейных позвонков.
    1. Удалить рогов матки с препаровальный пинцет , как описано выше 22, 23, и поместить их в чашку Петри на льду с 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) без Са 2+ или Mg 2+.
  3. Выполните все последующие шаги в капюшоне культуры ткани с использованием стерильной техники.
    1. Удалить эмбрионов из матки и амниотической с помощью ножниц и рассекает щипцов. Держите плаценту прикрепленную для лучшей управляемости. Pregnaнт CD-1 самки обычно рождают между 10 и 14 щенков.
    2. Использование рассекает щипцов, возьмите изолированных эмбрионов и быстро промыть их дважды в 70% (об / об) этанола.
      Примечание: Смыв должен быть быстрым, чтобы минимизировать гибель клеток.
    3. Снимите головку, конечности, хвост, и внутренние органы, включая сердце из изолированных зародышей.
    4. Поместите оставшиеся ткани в 10-см чашку с 1 мл 1x PBS и мелко фарша с использованием стерильного лезвия бритвы до приблизительно 1 мм 3 в размере.
    5. Передача измельченной ткани в 50 мл коническую трубку с PBS.
    6. Спин при 300 мкг в течение 3 мин. Тщательно аспирата избыток PBS.
    7. Добавить 1 мл стерильного 0,25% трипсин-ЭДТА в эмбрионе. Инкубируйте клетки в водяной бане C 37 ° в течение 15 мин. Аккуратно перемешайте пробирку каждые 4 мин. Чрезмерная перевариванию ткани значительно снизить урожайность.
    8. смесь клеток Vortex на максимальной скорости (3200 оборотов в минуту) в течение 4 сек.
    9. Добавляют 2 мл фибробластами среды на эмбрион и перемешать. Фильтр тhrough сито ячейки 100 мкм с помощью пипетки, чтобы помочь клеткам через сито. Обратитесь к Таблице 1 для разработки всех последующих сред.
    10. Спин при 300 мкг в течение 4 мин. Тщательно аспирата супернатант.
    11. Добавьте 10 мл свежей фибробластами среды на 3 эмбрионов и растирать 6-10 раз.
    12. Пластина клеток в 1 15 см блюдо культуры ткани на каждые 3 эмбрионов, полученных. Культура в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
    13. После инкубации в течение ночи, замените носитель со свежими 30 мл среды на чашку. Поместите клетки обратно в инкубатор на ночь.
      Примечание: Проверьте наличие Hcn4-GFP + загрязнения клеток под флуоресцентным микроскопом. Культура должна быть GFP - и только становятся GFP + на перепрограммирование.
    14. На следующий день, урожай клеток с 3 мл свежего подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Граф и заморозить клетки. Как правило, замерзают клетки в 3 × 10 6 клеток на мл. Ожидаемый YieЛ.Д. должно быть 3 × 10 6 клеток на эмбрион.

2. ретровируса Производство и перепрограммирования

Внимание: Следующий протокол требует производства и обработки инфекционных ретровирусов. Выполните следующие действия в кабинете Уровень биологической безопасности 2 под BSL-2 руководящих принципов и стерильной техники. Используйте 10% отбеливателя утилизацию всех материалов, подверженных ретровирусов.

  1. Ретровируса производство и подготовка MEFs
    Примечание: Следующий протокол для ретровирусов производства в 6-луночные планшеты и MEF-инфекции в 24-луночные планшеты. Для других форматов, обратитесь к таблице 2. MEFs высевают в день -1, так что сроки должны быть согласованы надлежащим образом для каждого эксперимента (смотрите в разделе 2.3 и рисунок 2).
    1. Поддерживать Плат-E (PE) клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, культура PE клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 1 мкг / мл puromyCIN, 10 мкг / мл бластицидин, пенициллин, стрептомицин и. Прохождение клетки 1: 4 раз в два дня, когда культура достигает 70-90% сплошности.
    2. День -2: За день до трансфекции, семена Плат-E клеток в количестве 1 × 10 6 клеток / лунку на 6-луночный планшет в трансфекция средах. Клетки должны быть на 70-80% сплошности во время трансфекции.
  2. Трансфекция с использованием коммерческого агентом трансфекции.
    Примечание: Коммерческие реагенты должны быть при комнатной температуре (RT) до трансфекции. Для трансфекции ДНК, добавьте каждый ретровирусов плазмидной ДНК по отдельности (G, H, M, T) и с образованием GHMT коктейль 9.
    1. День -1: В полистирольной трубке 15 мл коническую, смешивают 60 мкл восстановленного сыворотки среды с 6 мкл реагента для трансфекции на реакцию в течение 6- ти луночного формата пластины. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Поскольку трансфекция реагент, используемый здесь связывается с пластмассами, Aдд непосредственно к уменьшенному сывороточный сред, чтобы избежать снижения эффективности трансфекции.
    2. Добавить в общей сложности 2 мкг GHMT коктейля на реакцию и осторожно нажмите, чтобы смешать его. Не вихрь. Инкубируют реакционную смесь в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Добавьте смесь из стадии 2.2.3 к защитному клеток в капле мудрое.
    4. Инкубируйте трансфицированных клеток Плат-E в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Запишите время трансфекции.
  3. Посев Hcn4-GFP эмбриональных фибробластов мыши.
    1. За 1 ч до посева MEFs, подготовить 24-луночный планшет для иммуногистохимии.
      1. Добавьте 12 мм фибронектина покровное в каждую лунку.
      2. Coat лунки объемом 300 мкл бычьего раствора коллагена (например, SureCoat) и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 1 ч.
      3. Отберите раствор для нанесения покрытия непосредственно перед MEF обшивкой.
    2. Оттепель замороженный флакон Hcn4-GFP MEFs и мыть x1 с подогретым fibroblAST СМИ при 500 мкг в течение 5 мин.
    3. Определение жизнеспособности клеток с использованием трипанового синего или подобные красители. Подсчитайте число жизнеспособных клеток на мл культуры, используя следующую формулу:
      % жизнеспособных клеток = [1,00 - (Число синих клеток / Количество всех клеток)] х 100
      1. Подсчитайте общее число жизнеспособных клеток, используя следующую формулу:
        Жизнеспособные клетки =% жизнеспособных клеток х коэффициент разбавления х 10000 х общий объем клеточной суспензии
    4. Семенной 3 х 10 4 клеток на лунку на 24-луночный планшет с предварительно приготовленным раствором бычьего коллагена-фибронектин покровное.
  4. Трансдукция и перепрограммирование MEFs
    Примечание: В соответствии с примечаниями изготовителя, надлежащим образом Плат-E клетки производят средний титр 1 × 10 7 инфекции ед / мл. Несмотря на то, титр не измеряется непосредственно для каждого эксперимента, контрольная GFP, всегда включается в качестве суррогата эффективность инфекции.Высокая экспрессия GFP и интенсивность (GFP +> 95%) , как правило , коррелирует с успешным GHMT-опосредованной поколения iCLMs.
    1. День 0: 24 ч после трансфекции, фильтровать PE ретровирусов среды через мкм размер пор фильтра 0,45 поверхностно- активных веществ ацетата целлюлозы и переносят в 15 мл коническую трубку. Добавить полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл. Тщательно пополнять клетки с 2 мл свежей среды для трансфекции.
      Примечание: клетки легко отделяются от пластины, если средства массовой информации меняется слишком быстро.
    2. Аспирируйте среду культивируемых MEFs и добавьте свежесобранных ретровирусов среду; она не должна приводить в 1,7 мл среды на лунку 6-луночного планшета. Добавить ~ 800 мкл на лунку 24-луночного планшета. Возвращение MEF пластины в инкубатор и инкубировать в течение ночи.
    3. День 1: Повторите шаги 2.4.1 и 2.4.2. Откажитесь клетки после сбора вируса 2 - го. Возвращение зараженных MEFs в инкубатор и дайте им отдохнуть в течение ночи.
    4. День 2: 48 ч после индукции, аспирация клетка кондиционированной среды и мыть x1 с 1x PBS. Добавьте 500 мкл предварительно нагреты iCLM среды на лунку 24-луночного планшета.
    5. Заменить iCLM СМИ каждые 2 - 3 дня. Процесс пластины 14 дней после вирусной индукции для иммуноцитохимия (МУС) анализа сердечной перепрограммирования.

3. Иммуноокрашивание перепрограммирован MEFs

  1. 14 дней после индукции, тщательно аспирата СМИ.
  2. Промыть каждую лунку 300 мкл охлажденного на льду 1x PBS. Аспирируйте избыток раствора.
  3. Закрепить клетки с 250 мкл 4% -ного раствора параформальдегида (PFA) на лунку 24-луночного планшета. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Фиксированные клетки могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение 1 - 2 недель перед окрашиванием.
  4. Проницаемыми клетки путем промывки скважин x3 с 300 мкл 0,1% PBS-Тритон 100 (PBST). Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
  5. Блок для 10мин при комнатной температуре с 1x универсальный блок буфером при 300 мкл / лунку.
  6. Подготовить (ICC) буфера окрашивания: Добавить 1: 1 из 1x PBS и 1x Универсальный блокирующий буфер. Развести первичных антител в БЦХ буфере окрашивания и инкубировать антител в течение ночи при температуре 4 ° С. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях.
    1. Пятно одну пару слайдов с мышью альфа-актинин, ветряная αGFP и кролика NPPA для IPM и IAM идентификации.
    2. Пятно одну пару слайдов с помощью мыши альфа-актинин, курица αGFP и кролика Myl2 для IPM и IVM идентификации.
  7. На следующий день, мыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
  8. Подготовка вторичных разведений антител в окрашивании ICC буфере. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях. Инкубируйте вторичными антителами 1 час при комнатной температуре, в защищенном от света.
    1. Пятно все слайды со следующим вторичным antibodies: мышь Alexa-555, курица Alexa-488, и кролик Alexa-647.
  9. Промыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Защита от света.
  10. Добавить 2,4 мкл монтажными среды, содержащей 1,5 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на предметное стекло микроскопа. Осторожно удалите покровное из лунке 24-луночного планшета, удаления избытка раствора, и передать на предметное стекло с крепежными средствами массовой информации. Аккуратно нажмите покровное для удаления избытка объема и воздуха.
  11. Печать слайдов с предпочтительным лака для ногтей или пластиковым уплотнителем. Хранить слайды при 4 ° С в защищенном от света.

4. Идентификация сердечной подтипов Использование конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений, конфокальный микроскоп оснащен по меньшей мере, 2 флуоресцентных детекторов, способных спектрального детектирования при 405, 488, 555 и 639 нм длин волн необходимо для того, чтобы идентифицировать IPMS, Iams и IVMS. Imagе клетки, используя план-Apochromat 20X / 0.75 цели или лучше. Использование программного обеспечения для анализа изображений производителя, сканирование увеличить изображения можно добиться 40X-качества нефти погружения изображения.

  1. Библиотека изображений: принимать 8-битные изображения с DAPI, Alexa-488, Alexa-555 и Alexa-647 каналов (гл.). Пиксель время выдержки 6 с, 1024 размер кадра, линия шага на 2, и усреднение 2 достаточно для изображений с высоким разрешением.
  2. Для каждого слайда, начните с одного края и начать сканирование вверх и вниз в красный флуоресцентный канал (ч.) Для альфа-актинин + саркомера + клеток (на рисунке 3 и на рисунке 5А для примеров). Саркомера страты легче идентифицировать визуально в 555 нм.
    1. После того, как α-актинин + саркомера + клеток был идентифицирован, переключиться на зеленый гл. и держать внимание, если она положительна (IPM). Переключение на компьютер, чтобы оценить далеко красный 647 ч. (IAM или IVM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейкиα-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - обозначаются как IPMS. Выражение GFP будет видно в течение всего клеточного (фиг.4А).
    2. Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), NPPA (кролик-Alexa647) и DAPI. Клетки , которые являются α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + NPPA являются IAM. NPPA окрашивание будет появляться перинуклеарного и (рисунок точечный 4B).
    3. Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), Myl2 (кролик-Alexa647). Клетки для положительных a-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + Myl2 являются IVMS. Myl2 окрашивание будет демонстрировать исчерченную форму вдоль саркомера нити. Из -за различий в качества окрашивания и Z-плоскости, страты не всегда может быть легко видна (рис 4C).

5. квантификация

Примечание: Для того чтобы оценить реальное количество потенциально перепрограммировать MEFs, 2 лунки 24-луночного планшета высевают параллельно с экспериментальными скважин и собирают через один день после посева. Общее количество посеянных клеток затем определяется путем усреднения двух скважин. Это становится фактическим полным посеянных клеток (aTotal).

  1. саркомера +
    1. Осмотрите каждую ячейку на покровное для правильной альфа-актинин + / + саркомера (справа панели Рисунок 3) и записи (рис 5B-I).
    2. Сведите общее количество альфа-актинин + / + саркомера на каждом покровном и разделить на фактическое общее посеянных клеток (aTotal) (рис 5B-III). Например, если были альфа-актинины aTotal = 12500 клеток, а также 100 клеток + / + саркомера тогда, были перепрограммировать 0,8% от посеянных MEFs. В среднемreprograming эксперимент даст 1% альфа-актинин + / саркомера + клеток (рис 5в).
  2. Подтип +
    Примечание: Для следующих шагов, обратитесь к рисунку 5B / C для типичного рабочего процесса iCLM количественной оценки. Если коротко, то для каждого саркомера + клетки, в виде таблицы , если он уникален для любого подтипа (рис 5B-I). Подсчитайте% подтип (рис 5B-III) путем деления числа подтипа + клеток в течение среднего саркомера + -клеток х 100 (рис 5B-I). Для расчета абсолютной эффективности% подтипа (рис 5B-IV), делят подтипа + -клеток число от фиг.5В-I на общее число клеток , посеянных х 100 (фиг.5В-II).
    1. Для каждого из альфа-клеток актинин + / + саркомера, оценить , если они являются GFP +, NPPA +, или Myl2 +.
    2. Сведите общее количество альфа-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / NPPA +, и α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / Myl2 + клеток (рис 5B-I).
    3. Для того, чтобы вычислить процент каждого подтипа, необходимо разделить количество Подтип + клеток от общего количества альфа-актинин + / саркомера клетки + в этой лунке и умножить на 100. GHMT генерирует IPMS, Iams и IVMS примерно в равных соотношениях (рис 5B-III).
    4. Для того, чтобы вычислить абсолютное число подтипа + клеток, разделить общее число подтипа + клеток для экспериментальных услови х с помощью aTotal и умножить на 100 (Фиг.5В-II). В среднем IPMS составляют 0,3% от общего инфицированной клеточной популяции, Iams на 0,3%, аIVMS 0,25% (рис 5B-IV).

Результаты

Воспользовавшись PM-специфической репортерной мыши, мы разработали мультиплекс стратегию Иммуноокрашивание для выявления различных эндогенных миоцитов , как показано на рисунке 1. После шагов перепрограммирования , показанные на рисунке 2, индукция...

Обсуждение

Настоящее исследование представляет собой стратегию прямого перепрограммирования для превращения MEFs в разнообразный набор сердечных подтипов с помощью ретровируса-опосредованной экспрессии кардиального факторов транскрипции Gata4, MEF2C, Tbx5 и Hand2 (GHMT). Использование мультиплекс Иммуноо...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigmaD5796Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)SigmaF2442Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher Scientific41400-045Component of iCLM media
MEM vitamin solutionThermo Fisher Scientific11120-052Component of iCLM media
MEM amino acidsThermo Fisher Scientific1601149Component of iCLM media
Non-Essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140-050Component of iCLM media
Antibiotic-AntimycoticsThermo Fisher Scientific15240062Component of iCLM media
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse SerumThermo Fisher Scientific26050-088Component of iCLM media
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Component of iCLM media
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514022Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Component of Plat-E media
Blasticidin  Gemini Bio-Products400-128PComponent of Plat-E media
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700ZeissFor confocal analysis
FuGENE 6 transfection ReagentPromegaE2692Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070Transfection reagent 
PolybreneMilliporeTR-1003-GInduction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, EcotropicCellBiolabsRV-101Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)SigmaA7811Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA AbgentAP8534AAntibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAntibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslipsNeuVitro CorpGG-12-1.5Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainerThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106For virus filtration
6 mL SyringesCovidien8881516937For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488AbcamAB150169Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlFor cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Universal Blocking reagentThermo Fisher ScientificNC9495720Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  platesOlympus25-260
6-well platesGenesee Scientific25-105
24-well platesGenesee Scientific25-107
10 cm Tissue culture dishesCorning4239
15 cm  Tissue culture dishesThermo Fisher Scientific5442
15 mL Conical tubesCorning4308
50 mL Conical tubesCorning4249
0.4% Trypan blue solutionSigmaT8154For viability
Ethyl Alcohol 200 proofThermo Fisher Scientific7005
BleachThermo Fisher Scientific6009

Ссылки

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

121IPMIAMIVMGata4Hand2MEF2CTbx5Hcn4NPPAMyl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены