JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduzione

Il cuore è il primo organo funzionale a sviluppare nell'embrione 1, 2. In combinazione con il sistema circolatorio, fornisce l'ossigeno, nutrienti, e un meccanismo di smaltimento durante lo sviluppo. Tre settimane dopo la fecondazione, il cuore umano batte per la prima volta e la sua regolamentazione adeguata è mantenuta da cardiomiociti (CMS). La perdita irreversibile di queste cellule specializzate è quindi la questione fondamentale sottostante insufficienza cardiaca progressiva. Mentre alcuni organismi come zebrafish e Xenopus hanno il potenziale per la rigenerazione cardiaca, cuore adulto dei mammiferi è più limitata 3, 5, 6. Così, data la funzione critica del cuore, non è sorprendente che la malattia di cuore è la principale causa di morte nel mondo, che rappresentano 600.000 morti nel solo 7 negli Stati Uniti. Ilto, è terapie a base di cellule per riparare o sostituire il miocardio danneggiato in modo efficiente sono di grande interesse clinico.

Lo studio fondamentale di Yamanaka e colleghi hanno mostrato che 8 espressione forzata di quattro fattori di trascrizione è sufficiente per convertire i fibroblasti completamente differenziate di cellule staminali pluripotenti. Tuttavia, la capacità tumorigenico di tutte le strategie di cellule staminali pluripotenti è stata una preoccupazione fondamentale per il loro uso per scopi terapeutici. Questo ha motivato il campo scientifico per la ricerca di metodi alternativi per transdifferenziare cellule, evitando uno stadio di pluripotenza. Recentemente, diversi gruppi hanno dimostrato la fattibilità di questa strategia per la visualizzazione di conversione diretta dei fibroblasti di topo a cellule cardiomiociti come indotte (iCLMs) con l'espressione ectopica di fattori di trascrizione Gata4, MEF2C, Tbx5, e più tardi, Hand2 (GMT e GHMT rispettivamente) 9, 10. Furthermore, la stessa strategia può essere eseguita in vivo e in tessuti umani di derivazione 9, 11, 12. Recenti studi hanno evidenziato fattori complementari o vie di segnalazione che possono essere modulati per migliorare ulteriormente l'efficienza riprogrammazione cardiaco 13, 14, 15. Presi insieme, questi studi dimostrano il potenziale di transdifferenziazione diretta per terapie rigenerative. Tuttavia, la scarsa efficienza della riprogrammazione CM, i meccanismi molecolari sconosciuti, riproducibilità incoerente a causa delle differenze metodologiche 16, e la natura eterogenea del iCLMs rimangono senza indirizzo.

Al fine di valutare direttamente iCLM eterogeneità, abbiamo progettato un saggio unicellulare discreto e robusto per l'individuazione di sviluppo sarcomere e cardiaco specificatio lignaggion-due necessarie caratteristiche di cardiomiociti funzionali. Ci sono almeno tre tipi principali di CM nel cuore come definite dalla loro posizione e uniche proprietà elettriche: atriale (AM), ventricolare (VM) e pacemaker (PM) 17, 18, 19, 20. In una combinazione orchestrato, permettono il corretto pompaggio di sangue. Durante la ferita del cuore, uno o tutti i sottotipi potrebbero essere interessati, e il tipo di terapia cellulare dovrebbero essere affrontate caso per caso. Attualmente, la maggior parte delle strategie si concentrano sulla generazione complessiva di cardiomiociti, mentre poco lavoro è stato fatto per studiare i meccanismi molecolari che regola specifica sottotipo.

Il seguente studio dettagli come quantificare correttamente sarcomeri ben organizzati e identificare un insieme diversificato di sottotipi di cardiomiociti. Utilizzando un pacemaker (PM) topo giornalista SPECIFICI, siamo in grado di applicare un iapproccio mmunocytochemical distinguere miociti atriali indotte-like (IAM), miociti ventricolari come indotta (IVM), e indotti miociti PM-like (IPMS) 21. Sulla base delle nostre osservazioni, solo le cellule che presentano l'organizzazione sarcomere sono in grado di battere spontanea. Questa piattaforma unica riprogrammazione permette di valutare il ruolo di alcuni parametri nell'organizzazione sarcomere, specifica sottotipo, e l'efficienza della riprogrammazione CM ad una risoluzione di singola cellula.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono le pratiche degli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal cura e l'uso a UT Southwestern Medical Center.

1. Isolamento di HCN4-GFP E12.5 embrionali di topo fibroblasti (MEF)

  1. Impostare accoppiamenti cronometrati tra omozigoti maschi HCN4-GFP e CD-1 femmine.
  2. Sacrifica femmina incinta a E12.5 dal biossido di carbonio l'eutanasia e la successiva dislocazione cervicale.
    1. Rimuovere corna uterine con dissettore come descritto in precedenza 22, 23, e metterli in una capsula di Petri sul ghiaccio con soluzione salina 1x tampone fosfato (PBS) senza Ca 2+ e Mg 2+.
  3. Eseguire tutti i passaggi successivi nella cappa di coltura utilizzando la tecnica sterile.
    1. Rimuovere gli embrioni dall'utero e amniotico sac con le forbici e pinze dissezione. Mantenere la placenta allegata per una migliore maneggevolezza. pregnant CD-1 le femmine in genere partoriscono tra 10 e 14 cuccioli.
    2. Utilizzando dissezione pinze, prendere gli embrioni isolate e rapidamente sciacquare due volte in 70% (v / v) EtOH.
      NOTA: I lavaggi devono essere veloci per ridurre al minimo la morte delle cellule.
    3. Togliere la testa, gli arti, la coda, e gli organi interni, compreso il cuore dagli embrioni isolate.
    4. Posizionare il tessuto rimanente in un 10 cm Piatto con 1 ml di PBS 1x e tritare finemente usando una lama di rasoio sterile a circa 1 mm 3 dimensioni.
    5. Trasferire il tessuto tritato in una provetta da 50 ml con PBS.
    6. Spin a 300 xg per 3 min. Con attenzione aspirare l'eccesso di PBS.
    7. Aggiungere 1 ml di sterile 0,25% tripsina-EDTA per ogni embrione. Incubare le cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente il tubo ogni 4 min. Over-digestione del tessuto abbasserà notevolmente la resa.
    8. miscela di cellule Vortex a velocità massima (3.200 rpm) per 4 s.
    9. Aggiungere 2 ml di media fibroblasti per embrioni e mescolare. Filtro tttraverso un colino cella di 100 micron con una pipetta per aiutare le cellule attraverso il filtro. Fare riferimento alla Tabella 1 per la formulazione di tutti i mezzi successive.
    10. Spin a 300 xg per 4 minuti. Con attenzione aspirare il surnatante.
    11. Aggiungere 10 ml di mezzi di fibroblasti fresca per 3 embrioni e triturare 6-10 volte.
    12. Piastra le cellule in 1 15 cm piatto di coltura di tessuti per ogni 3 embrioni preparati. Cultura overnight a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    13. Dopo l'incubazione durante la notte, sostituire il supporto con freschi 30 ml di supporti per piastra. Mettere le cellule di nuovo nel incubatore durante la notte.
      NOTA: Verificare la presenza di contaminazione delle cellule HCN4-GFP + sotto un microscopio a fluorescenza. La cultura dovrebbe essere GFP - e diventare solo GFP + sulla riprogrammazione.
    14. Il giorno dopo, le cellule raccolto con 3 ml di fresca pre-riscaldato 0,25% tripsina-EDTA. Contare e congelare le cellule. Tipicamente, congelare cellule a 3 x 10 6 cellule per ml. Il Yie previstold dovrebbe essere di 3 x 10 6 cellule per dell'embrione.

2. Retrovirus Produzione e riprogrammazione

Attenzione: il seguente protocollo richiede la produzione e la gestione dei retrovirus infettive. Effettuare le seguenti operazioni in un armadio biosicurezza di livello 2 sotto BSL-2 linee guida e tecnica sterile. Utilizzare il 10% di candeggina per smaltire tutti i materiali esposti a retrovirus.

  1. La produzione Retrovirus e preparazione MEF
    NOTA: Il seguente protocollo è per la produzione di retrovirale in 6 pozzetti e infezioni MEF in piastre da 24 pozzetti. Per gli altri formati, fare riferimento alla Tabella 2. MEF sono placcati in occasione della Giornata -1, così dovrà essere coordinata in modo appropriato per ogni esperimento (fare riferimento alla sezione 2.3 e Figura 2) la tempistica.
    1. Mantenere le cellule secondo le raccomandazioni del produttore Plat-E (PE). In breve, le cellule cultura PE in DMEM supplementato con 10% FBS, 1 mg / ml puromycin, 10 mg / ml blasticidin, la penicillina, e streptomicina. cellule Passage 1: 4 ogni due giorni in cui la cultura raggiunge il 70-90% di confluenza.
    2. Giorno -2: Il giorno prima trasfezione, le cellule seme Plat-E a cellule 1 x 10 6 / bene su un 6-pozzetti nei media trasfezione. Le cellule devono essere 70-80% confluenti al momento della transfezione.
  2. Trasfezione utilizzando un agente trasfezione commerciale.
    NOTA: I reagenti commerciali devono essere a temperatura ambiente (RT) prima di trasfezione. Per la trasfezione del DNA, aggiungere ogni DNA plasmide retrovirale singolarmente (G, H, M e T) per formare un cocktail GHMT 9.
    1. Giorno -1: In una provetta di polistirene da 15 ml conica, mescolare 60 ml di mezzi siero ridotti con 6 ml di trasfezione reagente per la reazione per un formato 6-pozzetti. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: Dal momento che il reagente di trasfezione usato qui si lega alla plastica, undd direttamente ai media siero ridotta per evitare qualsiasi diminuzione di efficienza di trasfezione.
    2. Aggiungere un totale di 2 mg di GHMT cocktail a reazione e delicatamente toccare per mescolare. Non farlo vortice. Incubare la reazione per 15 minuti a RT.
    3. Aggiungere il composto dal punto 2.2.3 alle cellule PE in maniera saggia goccia.
    4. Incubare le cellule trasfettate Plat-E durante la notte in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Registrare il tempo di trasfezione.
  3. Semina di HCN4-GFP fibroblasti embrionali di topo.
    1. 1 h prima della placcatura MEF, preparare un 24-pozzetti per immunocitochimica.
      1. Aggiungere un fibronectina coprioggetto 12 millimetri per pozzetto.
      2. Pozzi cappotto con 300 ml di soluzione di collagene bovino (ad esempio, SureCoat) e incubare in un incubatore a 37 ° per 1 ora.
      3. soluzione di rivestimento Aspirare immediatamente prima placcatura MEF.
    2. Scongelare una fiala congelata di HCN4-GFP MEF e lavare x1 con fibrobl pre-riscaldatosupporti AST a 500 xg per 5 min.
    3. Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan esclusione blu o coloranti simili. Calcolare il numero di cellule vitali per ml di coltura utilizzando la seguente formula:
      % cellule vitali = [1.00 - (Numero di celle blu / numero di cellule totali)] x 100
      1. Calcolare il numero totale di cellule vitali utilizzando la seguente formula:
        Le cellule vitali =% cellule vitali x fattore di diluizione x 10.000 x volume totale della sospensione cellulare
    4. Seed 3 x 10 4 cellule per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con collagene bovino coprioggetto soluzione fibronectina precedentemente preparato.
  4. La trasduzione e riprogrammazione di MEF
    NOTA: Secondo le note del produttore, corretta manutenzione cellule Plat-E producono un titolo medio di 1 x 10 7 unità di infezione / mL. Anche se il titolo non viene misurato direttamente per ogni esperimento, un controllo GFP è sempre inclusa come un surrogato per l'efficienza infezione.Espressione alta GFP e l'intensità (GFP +> 95%) correla generalmente con successo generazione GHMT-mediata di iCLMs.
    1. Giorno 0: 24 ore dopo la trasfezione, filtrare il medium retrovirale PE attraverso una dimensione del filtro di acetato 0,45 micron-pori senza tensioattivi di cellulosa e trasferimento in un tubo da 15 ml. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 8 mg / mL. ricostituire con attenzione le cellule con 2 ml di terreno fresco trasfezione.
      NOTA: Le cellule facilmente staccano dalla piastra se il supporto è cambiato troppo rapidamente.
    2. Aspirare il mezzo di coltura delle MEF e aggiungere il supporto retrovirale appena raccolti; esso dovrebbe produrre 1,7 ml di mezzi per pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere ~ 800 ml per pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rientro piatto MEF per l'incubatore e incubare una notte.
    3. Giorno 1: ripetere le fasi 2.4.1 e 2.4.2. Eliminare le celle dopo la collezione di virus 2 °. Rientro MEF infetti per l'incubatore e lasciarli riposare durante la notte.
    4. 2 ° giorno: 48 ore dopo l'induzione, aspirare il cellulare condizionata media e lavare x1 con PBS 1x. Aggiungere i media iCLM 500 ml di pre-riscaldato per pozzetto di una piastra ben 24.
    5. Sostituire i media iCLM ogni 2 - 3 giorni. Placca di 14 giorni dopo l'induzione virale per immunocitochimica (ICC) analisi della riprogrammazione cardiaco.

3. Immunocolorazione di MEF riprogrammato

  1. 14 giorni post-induzione, aspirare accuratamente la media.
  2. Lavare ogni pozzetto con 300 ml di 1x PBS ghiacciato. Aspirare la soluzione in eccesso.
  3. Fissare le cellule con 250 ml di paraformaldeide soluzione al 4% (PFA) per pozzetto di una piastra ben 24. Incubare 15 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: fisso cellule possono essere conservate in PBS a 4 ° C per 1 - 2 settimane prima colorazione.
  4. cellule permeabilize da Wells lavaggio x3 con 300 microlitri di 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
  5. Blocco per 10minuti a temperatura ambiente con 1x universale blocchetto a 300 ml / pozzetto.
  6. Preparare buffer di colorazione (ICC): Aggiungere 1: 1 di PBS 1x e 1x universale tampone di bloccaggio. Diluire gli anticorpi primari nel buffer di colorazione ICC e incubare anticorpi notte a 4 ° C. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate.
    1. Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e coniglio NPPA per iPM e l'identificazione iAM.
    2. Macchia un paio di diapositive con il mouse α-actinina, αGFP pollo e di coniglio per MYL2 iPM e IVM identificazione.
  7. Il giorno seguente, lavare i pozzetti x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Aspirare la soluzione in eccesso dopo l'ultimo lavaggio.
  8. Preparare le diluizioni degli anticorpi secondari nel buffer ICC colorazione. Fare riferimento alla sezione materiale per diluizioni raccomandate. Incubare anticorpi secondari 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    1. Macchia tutte le diapositive con il seguente antibodie secondarias: il mouse Alexa-555, pollo Alexa-488, e coniglio Alexa-647.
  9. Lavare pozzi x3 con 300 microlitri di 0.1% PBST. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente tra i lavaggi. Proteggere dalla luce.
  10. Aggiungere 2,4 ml di mezzo di montaggio contenenti 1,5 mg / mL di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) su un vetrino per microscopio. Rimuovere con attenzione il vetrino dal pozzo della piastra 24 pozzetti, rimuovere la soluzione in eccesso, e trasferire al vetrino con mezzi di montaggio. Premere delicatamente il vetrino per rimuovere l'eccesso di volume e l'aria.
  11. diapositive Seal con smalto preferito o sigillante di plastica. Conservare diapositive montate a 4 ° C al riparo dalla luce.

4. Identificazione di cardiache sottotipi Utilizzando Microscopia confocale

NOTA: Per l'imaging, un microscopio confocale dotato di almeno 2 rivelatori fluorescenti capaci di rilevazione spettrale a 405, 488, 555 e 639 nm lunghezza d'onda necessaria per identificare IPM, Iams, e IVMS. imagcellule e utilizzando un piano-Apochromat 20X / 0.75 obiettivo o migliore. Utilizzando il software di analisi di immagine del produttore, la digitalizzazione delle immagini dello zoom può ottenere immagini di qualità ad immersione 40X-petrolio.

  1. libreria Immagine: prendere immagini a 8 bit con DAPI, Alexa-488, Alexa-555, e Alexa-647 canali (cap.). Pixel tempo di sosta di 6 s, 1024 dimensione del frame, passo la linea a 2, e la media dei 2 è sufficiente per immagini ad alta risoluzione.
  2. Per ogni diapositiva, iniziare da un bordo e iniziare la scansione su e giù nel canale rosso fluorescente (ch.) Per le cellule sarcomere + α-actinina + (Fare riferimento alla Figura 3 e Figura 5A per gli esempi). striature sarcomere sono più facili da identificare visivamente nella lunghezza d'onda 555 nm.
    1. Una volta che un α-actinina + cellule sarcomere + è stato identificato, passare alla ch verde. e di tenere nota se è positivo (IPM). Passare al computer per valutare il far-rosso 647 ch. (IAM o IVM).
      Nota: le celle che sonoα-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 - sono designati come IPMS. Espressione GFP sarà visto in tutta la cella (Figura 4A).
    2. diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), NPPA (coniglio-Alexa647) e DAPI. Le cellule che sono α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA + sono iAM. NPPA colorazione apparirà perinucleare e puntiformi (Figura 4B).
    3. diapositive macchia con α-actinina (mouse Alexa555), HCN4-GFP (pollo-Alexa488), MYL2 (coniglio-Alexa647). Cellule positive per la α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / + MYL2 sono IVMS. MYL2 colorazione esporrà una forma striato lungo il filamento sarcomero. A causa di variazioni nella qualità della colorazione e Z-plane, striature non sono sempre facilmente visibili (Figura 4C).

5. quantificazione

NOTA: Per valutare il numero effettivo di MEF potenzialmente riprogrammati, 2 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti vengono seminate in parallelo ai pozzetti sperimentali sono raccolte un giorno dopo la placcatura. Il numero totale di cellule piastrate è quindi determinata dalla media dei due pozzetti. Questo diventa le cellule totali effettivi cromato (atotal).

  1. sarcomere +
    1. Visivamente ogni cella su un vetrino per la corretta α-actinina + / sarcomero + (pannelli di destra Figura 3) e registrare (Figura 5B-i).
    2. Tabulare il numero totale di α-actinina + / + sarcomere su ogni vetrino e dividere per le cellule totali effettivi cromato (atotal) (Figura 5B-III). Ad esempio, se atotal = 12.500 cellule, e 100 cellule sono state alfa-actinina + / + sarcomere poi, 0,8% dei MEF placcati stati riprogrammato. Una mediareprograming esperimento produrrà cellule 1% alfa-actinina + / sarcomero + (Figura 5C).
  2. sottotipo +
    NOTA: Per le seguenti operazioni, fare riferimento alla Figura 5B / C per un flusso di lavoro rappresentante iCLM quantificazione. In breve, per ogni sarcomero + cellulare, tabulare se è unica sia per il sottotipo (Figura 5B-i). Calcolare% sottotipo (Figura 5B-iii) dividendo il numero di cellule sottotipo + sul sarcomere media + cellule x 100 (Figura 5B-i). Per calcolare l'assoluta efficienza% sottotipo (Figura 5B-IV), dividere il numero sottotipo + cellulare da figura 5B-i per il numero totale di cellule seminate x 100 (Figura 5B-ii).
    1. Per le celle ciascuno di α-actinina + / + sarcomere, valutare se sono GFP +, NPPA +, o MYL2 +.
    2. Tabulare numero totale di α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP + / NPPA - / MYL2 -, actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - / NPPA +, e α-actinina + / sarcomero + / Hnc4-GFP - + cellule / MYL2 (Figura 5B-i).
    3. Per calcolare la percentuale di ciascun sottotipo, dividere il numero di cellule Sottotip + per il numero totale di α-actinina + / + cellule sarcomere in che pure e moltiplicare per 100. GHMT genera IPMS, Iams, e IVMS più o meno uguali rapporti (Figura 5B-III).
    4. Per calcolare il numero assoluto di sottotipo + cellule, dividere il numero totale di sottotipo + cellule per la condizione sperimentale atotal e moltiplicare per 100 (Figura 5B-ii). Su IPMS media rappresentano lo 0,3% della popolazione cellulare infettata totale, Iams 0,3%, eIVMS 0,25% (Figura 5B-iv).

Risultati

Approfittando della PM-specifica del mouse giornalista, abbiamo sviluppato una strategia immunocolorazione multiplex per identificare i diversi miociti endogeni come illustrato nella figura 1. Seguendo la procedura di riprogrammazione mostrati nella Figura 2, l'induzione di CM specifici del sottotipo può essere rilevato fin dal giorno 4 21, anche se ad un basso tasso. Entro il giorno 14, l'esperimento può essere fermato ...

Discussione

Il presente studio fornisce una strategia a riprogrammazione diretta per la conversione di MEF in un insieme diversificato di sottotipi cardiaci tramite espressione retrovirus-mediata della trascrizione cardiaco fattori Gata4, MEF2C, Tbx5, e Hand2 (GHMT). Utilizzando un approccio immunocolorazione multiplex in combinazione con un PM-specifica del mouse giornalista, siamo in grado di identificare iAM, IVMS, e IPMS ad una risoluzione di singola cellula. Tale test permette una sperimentazione in vitro sistema in g...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigmaD5796Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)SigmaF2442Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher Scientific41400-045Component of iCLM media
MEM vitamin solutionThermo Fisher Scientific11120-052Component of iCLM media
MEM amino acidsThermo Fisher Scientific1601149Component of iCLM media
Non-Essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140-050Component of iCLM media
Antibiotic-AntimycoticsThermo Fisher Scientific15240062Component of iCLM media
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse SerumThermo Fisher Scientific26050-088Component of iCLM media
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Component of iCLM media
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514022Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Component of Plat-E media
Blasticidin  Gemini Bio-Products400-128PComponent of Plat-E media
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700ZeissFor confocal analysis
FuGENE 6 transfection ReagentPromegaE2692Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070Transfection reagent 
PolybreneMilliporeTR-1003-GInduction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, EcotropicCellBiolabsRV-101Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)SigmaA7811Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA AbgentAP8534AAntibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAntibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslipsNeuVitro CorpGG-12-1.5Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainerThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106For virus filtration
6 mL SyringesCovidien8881516937For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488AbcamAB150169Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlFor cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Universal Blocking reagentThermo Fisher ScientificNC9495720Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  platesOlympus25-260
6-well platesGenesee Scientific25-105
24-well platesGenesee Scientific25-107
10 cm Tissue culture dishesCorning4239
15 cm  Tissue culture dishesThermo Fisher Scientific5442
15 mL Conical tubesCorning4308
50 mL Conical tubesCorning4249
0.4% Trypan blue solutionSigmaT8154For viability
Ethyl Alcohol 200 proofThermo Fisher Scientific7005
BleachThermo Fisher Scientific6009

Riferimenti

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Biologia dello SviluppoNumero 121la riprogrammazione direttaiPMiAMIVMcardiomiocitiGata4Hand2MEF2CTbx5HCN4NPPAMYL2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati