Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Zusammenfassung

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Zusammenfassung

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Einleitung

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo ^{1, 2} zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - Herzen begrenzteren ^{3, 5, 6.} Somit ist die kritische Funktion des Herzens gegeben, ist es nicht erstaunlich , dass Herzkrankheit die häufigste Todesursache in der Welt ist, für 600.000 Todesfälle in den Staaten ⁷ allein Vereinigten Buchhaltung. Dasrefore, zellbasierte Therapien effizient zu reparieren oder den verletzten Myokard sind von großem klinischem Interesse zu ersetzen.

Die bahnbrechenden Studie von Yamanaka und Kollegen ⁸ zeigte , dass erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren ausreichend ist vollständig differenzierten Fibroblasten - Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu konvertieren. Allerdings hat die tumorigenen Kapazität aller pluripotenten Stammzellen Strategien war ein kritisches Problem bei der Verwendung für therapeutische Zwecke. Dies motivierte die wissenschaftlichen Bereich für alternative Methoden zu suchen, Zellen zu transdifferentiate während eine pluripotente Stadium vermieden werden. Kürzlich haben mehrere Gruppen die Durchführbarkeit dieser Strategie dargestellt durch direkte Umwandlung von Maus-Fibroblasten induzierten Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (iCLMs) mit der ektopischen Expression des Transkriptionsanzeigefaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5, und später, Hand2 (GMT und GHMT bezeichnet) ^{9, 10.} Furthermore kann dieselbe Strategie in vivo durchgeführt werden und in menschlichen Geweben ^{9, 11, 12.} Jüngste Studien haben zusätzliche Faktoren oder Signalwege aufgezeigt , die weiter moduliert werden kann , um Herz Umprogrammierung Effizienz ^{13, 14, 15} zu verbessern. Zusammengenommen zeigen diese Studien das Potenzial gerichtet transdifferentiation für regenerative Therapien. Allerdings bleiben die geringe Effizienz der CM Umprogrammierung, die unbekannten molekularen Mechanismen, inkonsistente Reproduzierbarkeit aufgrund methodischer Unterschiede ¹⁶ und die Heterogenität der iCLMs unadressierte.

Um icLm Heterogenität direkt zu bewerten, haben wir eine diskrete und robuste Single-Cell-Test für die Identifizierung von Sarkomers Entwicklung und Herz-Linie specification-zwei notwendigen Eigenschaften von funktionellen Kardiomyozyten. Es gibt mindestens drei Haupttypen von CM im Herzen , wie durch ihre Lage und einzigartige elektrische Eigenschaften definiert: atrial (AM), ventrikuläre (VM) und Schrittmacher (PM) ^{17, 18, 19, 20.} In einer konzertierten Kombination ermöglichen sie die richtige Pumpen von Blut. Während Herzverletzung, eine oder alle Subtypen betroffen sein könnten, und die Art der Zelltherapie müssten auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Derzeit konzentrieren sich die meisten Strategien auf die gesamte Generation von Kardiomyozyten, während wenig Arbeit, die molekularen Mechanismen zu studieren getan wird, um die Subtyp Spezifikation regelt.

Die folgende Studie beschreibt, wie man richtig gut organisierten Sarkomere zu quantifizieren und eine vielfältige Reihe von Kardiomyozyten Subtypen identifizieren. Mit Hilfe eines Schrittmachers (PM) -spezifische Reporter Maus, wir sind in der Lage ein i anwendenmmunocytochemical Ansatz zur Unterscheidung induzierte atriale artigen Myozyten (IAM), induzierte ventrikuläre artigen Myozyten (iVM) und induzierte PM-wie Myozyten (IPMS) ^21. Basierend auf unseren Beobachtungen nur Zellen, die Sarkomers Organisation zeigen in der Lage sind spontan zu schlagen. Diese einzigartige Umprogrammierung Plattform ermöglicht es, die Rolle für die Beurteilung der bestimmter Parameter in Sarkomers Organisation, Subtyp-Spezifikation, und die Effizienz der CM Neuprogrammierung bei Einzelzellauflösung.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

1. Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen.
2. Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation.
   1. Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als ²² zuvor ^{beschrieben, 23,} und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca ²⁺ oder Mg ^2+.
3. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Gewebekultur Haube steril Technik.
   1. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase Schere und Pinzette. Halten Sie die Plazenta für eine bessere Handhabung angebracht. pregnant CD-1 Weibchen normalerweise Geburt zwischen 10 und 14 Welpen geben.
   2. Mit einer Pinzette zu sezieren, nehmen die isolierten Embryonen und sie schnell zweimal in 70% spülen (v / v) EtOH.
      HINWEIS: Die Wäschen sollte schnell sein Zelltod zu minimieren.
   3. Entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und innere Organe, darunter das Herz aus den isolierten Embryonen.
   4. Legen Sie das verbleibende Gewebe in einem 10-cm - Schale mit 1 ml 1x PBS und fein zerkleinern und eine sterile Rasierklinge auf etwa 1 mm ³ in der Größe verwendet wird .
   5. Übertragen zerkleinerte Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit PBS.
   6. Spin bei 300 g für 3 min. aspirieren vorsichtig überschüssige PBS.
   7. 1 mL steriler 0,25% Trypsin-EDTA pro Embryo. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig mischen das Rohr alle 4 Minuten. Über Verdauung des Gewebes wird die Ausbeute deutlich niedriger.
   8. Vortex Zellmischung bei maximaler Geschwindigkeit (3200 rpm) für 4 s.
   9. In 2 ml Fibroblasten-Medien pro Embryo und mischen. Filter turch einen 100 um Zellsieb mit einer Pipette die Zellen durch das Sieb zu unterstützen. Siehe Tabelle 1 für die Formulierung alle nachfolgenden Medien.
   10. Spin bei 300 g für 4 min. Sorgfältig absaugen Überstand.
   11. In 10 ml frischem Fibroblasten-Medien pro 3 Embryonen und verreiben 6-10 mal.
   12. Platte, die die Zellen in 1 15 cm Gewebekulturschale für alle 3 Embryonen hergestellt. Kultur über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator.
   13. Nach der Inkubation über Nacht ersetzen Sie die Medien mit frischen 30 ml Medium pro Platte. Legen Zellen wieder in den Inkubator über Nacht.
       HINWEIS: Überprüfen Sie für HCN4-GFP ⁺ Zellkontamination unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kultur sollte GFP sein ^- und nur werden GFP ⁺ auf Neuprogrammierung.
   14. Am nächsten Tag Ernte Zellen mit 3 ml frischem vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA. Graf und Gefrierzellen. Typischerweise gefrier Zellen bei 3 x 10 ⁶ Zellen pro mL. Die erwartete yield sollte 3 x 10 ⁶ Zellen pro Embryo sein.

2. Retrovirus Produktion und Reprogrammierung

Achtung: Das folgende Protokoll erfordert die Herstellung und Handhabung von infektiösen Retroviren. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosafety Level 2 Schrank unter BSL-2-Richtlinien und sterile Technik. Verwenden Sie 10% Bleiche aller Materialien zu entsorgen ausgesetzt Retroviren.

1. Retrovirus - Produktion und MEF Vorbereitung
   HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die retrovirale Produktion in 6-Well-Platten und MEF-Infektion in 24-Well-Platten. Für andere Formate finden Sie in Tabelle 2. MEFs sind an Tag -1 überzogen, so dass das Timing abgestimmt für jedes Experiment in geeigneter Weise werden müssen (siehe Abschnitt 2.3 und Abbildung 2).
   1. Pflegen Plat-E (PE) Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze, Kultur PE-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt, 1 & mgr; g / mL puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, Penicillin und Streptomycin. Passage Zellen 1: 4 alle zwei Tage, wenn die Kultur 70-90% Konfluenz erreicht.
   2. Tag -2: Am Tag vor der Transfektion Samen Plat-E - Zellen bei 1 × 10 ⁶ Zellen / Vertiefung auf einer 6-Well - Platte in Transfektionsmedien. Zellen sollten 70-80% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden.
2. Transfektion Kommerzielle Transfektionsagens verwenden.
   HINWEIS: Die kommerziellen Reagenzien bei Raumtemperatur (RT) vor der Transfektion sein sollte. Für die DNA - Transfektion, für jede retrovirale Plasmid - DNA einzeln (G, H, M und T) ⁹ einen GHMT Cocktail zu bilden.
   1. Tag -1: In einem 15 ml konischen Polystyrolröhrchen, mischen 60 ul reduziert Serum - Medien mit 6 ul Transfektionsreagenz pro Reaktion für eine 6-Well - Plattenformat. Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Da das Transfektionsreagenz hier bindet an Kunststoffen, eindirekt mit dem reduzierten Serummedien dd jede Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden.
   2. In insgesamt 2 ug GHMT Cocktail pro Reaktion und klopfen Sie leicht zu mischen. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren der Reaktion für 15 min bei RT.
   3. In der Mischung aus Schritt 2.2.3 an die PE-Zellen in einer tropfenweise Art und Weise.
   4. Inkubieren der transfizierten Plat-E - Zellen über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO ₂ -Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit der Transfektion.
3. Seeding von HCN4-GFP embryonalen Maus - Fibroblasten.
   1. 1 h vor MEFs Plattierung, eine 24-Well-Platte für Immunzytochemie vorzubereiten.
      1. Fügen Sie eine 12 mm Fibronektin Deckglas pro Vertiefung.
      2. Coat Vertiefungen mit 300 & mgr; l Rinderkollagenlösung (zB surecoat) und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator für 1 h.
      3. Absaugen Beschichtungslösung unmittelbar vor der MEF-Beschichtung.
   2. Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen HCN4-GFP MEFs und waschen x1 mit vorgewärmten fibroblast Medien bei 500 xg für 5 min.
   3. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Ausschluss oder ähnliche Farbstoffe verwendet. Berechne die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur mit der folgenden Formel:
      % Lebenden Zellen = [1,00 - (Anzahl der blauen Zellen / Anzahl der gesamten Zellen)] x 100
      1. Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:
         Lebensfähige Zellen =% lebende Zellen x Verdünnungsfaktor x 10.000 x Gesamtvolumen der Zellsuspension
   4. Seed 3 x 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit zuvor hergestellten Rinder - Kollagen - Lösung-Fibronektin Deckglas.
4. Transduction und Reprogrammierung von MEFs
   HINWEIS: Nach den Notizen des Herstellers richtig gepflegt Plat-E - Zellen produzieren einen durchschnittlichen Titer von 1 x 10 ⁷ Infektion Einheiten / ml. Obwohl die Titer nicht direkt für jedes Experiment gemessen wird, wird ein GFP Steuerung immer als Surrogat für Infektionseffizienz enthalten.Hohe GFP - Expression und Intensität (GFP ^+> 95%) korreliert typischerweise mit erfolgreichen GHMT-vermittelte Erzeugung von iCLMs.
   1. Tag 0: 24 h nach der Transfektion, filtern das PE Medium retroviralen durch einen 0,45 & mgr; m Porengröße Tensid freie Celluloseacetat - Filter und in ein 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL. Sorgfältig Zellen mit 2 ml frischem Transfektionsmediums aufzufüllen.
      Hinweis: Zellen leicht von der Platte lösen, wenn Medien zu schnell geändert wird.
   2. Saugen Sie das Medium der kultivierten MEFs und fügen Sie den frisch retroviralen Medium gesammelt; es sollte 1,7 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte ergeben. In ~ 800 & mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zurück MEF Platte in den Inkubator und über Nacht inkubiert.
   3. Tag 1: Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2. Entsorgen Sie Zellen nach der ^2. Virussammlung. Zurück infizierten MEFs in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ruhen.
   4. Tag 2: 48 h nach der Induktion, aspirieren die Zelle konditionierten Medien und Wasch x1 mit 1x PBS. In 500 ul vorgewärmt icLm Medien pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
   5. Ersetzen icLm Medien alle 2 - 3 Tage. Prozessplatte 14 Tage nach der viralen Induktion für Immunzytochemie (ICC) Analyse der kardialen Neuprogrammierung.

3. Immunfärbung von Reprogrammed MEFs

1. 14-Tage nach der Induktion, aspirieren sorgfältig die Medien.
2. Spülen Sie jede Vertiefung mit 300 & mgr; l eiskaltem 1x PBS. Absaugen überschüssige Lösung.
3. Fix-Zellen mit 250 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubiere 15 Minuten bei RT.
   HINWEIS: - 2 Wochen vor Anfärbung Fixierte Zellen können 1 in PBS bei 4 ° C gelagert werden.
4. Permeabilisierung Zellen durch Waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBS-Triton X 100 (PBST). Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
5. Block 10min bei RT mit 1x Universal-Block-Puffer bei 300 & mgr; l / Vertiefung.
6. Bereiten Sie (ICC) Färbepuffers: 1: 1 von 1x PBS und 1x Universal-Blocking-Puffer. Verdünnen primäre Antikörper in ICC Färbepuffers und Inkubation Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen.
   1. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen NPPA für iPM und iAM Identifikation.
   2. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen Myl2 für iPM und iVM Identifikation.
7. Am folgenden Tag waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper-Verdünnungen in ICC Färbepuffers. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sekundärantikörper 1 h bei RT, vor Licht geschützt.
   1. Stain alle Folien mit den folgenden sekundären antibodies: Maus Alexa-555, Huhn Alexa-488, und Kaninchen Alexa-647.
9. Waschen Sie Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. Vor Licht schützen.
10. Fügen 2,4 ul Eindeckmedien enthaltend 1,5 & mgr; g / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in ein Glasobjektträger. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Brunnen der 24-Well-Platte, entfernen Sie überschüssige Lösung und Transfer zum Glasträger mit Montage Medien. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas überschüssiges Volumen und Luft zu entfernen.
11. Seal Folien mit bevorzugten Nagellack oder Kunststoff Versiegelung. Shop gerahmte Dias bei 4 ° C vor Licht geschützt.

4. Identifizierung von Cardiac-Formationsglieder mittels konfokaler Mikroskopie

HINWEIS: Für die Bildgebung, ein konfokales Mikroskop mit mindestens zwei Fluoreszenzdetektoren der Lage spektralen Detektion bei 405, 488, 555 und 639 nm Wellenlängen erforderlich ist, um IPMS, IAMS und IVMS zu identifizieren. Image-Zellen ein Plan-Apochromat 20x / 0,75 Ziel oder besser verwenden. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software des Herstellers, Scannen Zoom-Bilder 40X-Ölkapselung Bildqualität erreichen können.

1. Bildarchiv: Nehmen Sie 8-Bit-Bilder mit DAPI, Alexa-488, Alexa-555 und Alexa-647-Kanäle (ch.). Pixel Verweilzeit von 6 s, 1024 Rahmengröße, Zeilen Schritt bei 2, und Mitteln von 2 reicht für hochauflösende Bilder.
2. Für jede Folie, die von einem Rand beginnen und Scannen nach oben und unten in der roten Fluoreszenzkanal (ch.) Zur α-Actinin ⁺ Sarkomer ⁺ Zellen (Siehe 3 und 5A Beispiele Abbildung). Sarkomers Riefen sind leichter zu visuell in der 555 nm Wellenlänge zu identifizieren.
   1. Sobald ein α-Actinin ⁺ Sarkomer ⁺ Zelle identifiziert wurde, wechseln Sie in den grünen ch. und merken, wenn es positiv ist (ipm). Wechseln Sie auf dem Computer mit dem fernen Rot 647 ch zu beurteilen. (IAM oder iVM).
      HINWEIS: Die Zellen, dieα-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^- als IPMS bezeichnet. GFP - Expression wird in der gesamten Zelle (4A) gesehen werden.
   2. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), NPPA (Kaninchen-Alexa647) und DAPI. Zellen , die α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP sind ^- / NPPA ⁺ sind iAM. NPPA Färbung erscheint perinukleäre und punctata (4B).
   3. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), Myl2 (Kaninchen-Alexa647). Zellen , die positiv für α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Myl2 ⁺ sind IVMS. Myl2 Färbung wird ein gestreiftes Form entlang der Sarkomers Filament aufweisen. Aufgrund von Schwankungen in der Qualität der Färbung und der Z-Ebene, Streifungen nicht immer leicht sichtbar (4C) liegen.

5. Quantifizierung

HINWEIS: Um die tatsächliche Anzahl der potenziell umprogrammiert MEFs, 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu bewerten sind parallel zu den experimentellen Vertiefungen ausgesät und 1 Tag geerntet nach der Plattierung. Die Gesamtzahl der plattierten Zellen wird dann durch Mittelung der zwei Vertiefungen bestimmt. Dies wird die tatsächliche Gesamt Zellen plattiert (Ages).

1. Sarkomers ⁺
   1. Sichtprüfung jede Zelle auf einem Deckglas für die richtige α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ (rechte Felder Abbildung 3) und Aufzeichnung (5B-i).
   2. Tabellieren die Gesamtzahl der α-Actinin ⁺ / ⁺ Sarkomer auf jedem Deckglas und dividieren durch die tatsächliche Gesamt Zellen ausplattiert (ATOTAL) (5B-iii). Wenn beispielsweise ATOTAL = 12.500 Zellen und 100 - Zellen wurden a-Actinin ⁺ / ⁺ Sarkomer dann 0,8% der plattierten MEFs wurden umprogrammiert. Ein Durchschnittreprograming Experiment Ausbeute 1% α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ Zellen (5C).
2. Subtype ⁺
   HINWEIS: Für die folgenden Schritte siehe 5B / C für eine repräsentative icLm Quantifizierung Workflow - Abbildung. Kurz gesagt, für jede Sarkomers ⁺ Zelle, tabellarisch , wenn es für beide Subtyp (5B-i) ist einzigartig. Berechnen% Subtype (5B-iii) , indem die Anzahl der Subtyp ⁺ Zellen über die durchschnittliche Sarkomers Dividieren ⁺ Zellen x 100 (5B-i). Um die absolute% Subtyps Wirkungsgrad (5B-iv) zu berechnen, unterteilen den Subtyp ⁺ Zellzahl von 5B-i durch die Gesamtzahl von Zellen ausgesät x 100 (5B-ii).
   1. Für jede der α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ Zellen, zu bewerten , ob sie GFP ⁺ sind, NPPA ⁺ oder Myl2 ^+.
   2. Tabellieren Gesamtanzahl von α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / NPPA ^- / Myl2 ^-, actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP ^- / NPPA ⁺ und α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Myl2 ⁺ Zellen _(5B-i).
   3. Um den Prozentsatz von jedem Subtyp berechnen, teilen die Anzahl der Subtype ⁺ Zellen durch die Gesamtzahl von α-Actinin ⁺ / Sarkomer ⁺ -Zellen in das gut und multiplizieren mit 100. GHMT erzeugt IPMS, IAMS und IVMS in etwa gleichen Verhältnissen (Fig 5B-iii).
   4. Um die absolute Anzahl von Subtyp ⁺ Zellen zu berechnen, unterteilen die Gesamtzahl der Subtyp ⁺ Zellen für die experimentellen Bedingungen durch ATOTAL und multipliziere mit 100 (5B-ii). Im Durchschnitt IPMS 0,3% der gesamten infizierten Zellpopulation darstellen, Iams 0,3% undIVMS 0,25% (5B-iv).

Ergebnisse

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 ^21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkome...

Diskussion

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in de...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)	Sigma	F2442	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Component of iCLM media
MEM vitamin solution	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Component of iCLM media
MEM amino acids	Thermo Fisher Scientific	1601149	Component of iCLM media
Non-Essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics	Thermo Fisher Scientific	15240062	Component of iCLM media
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Component of iCLM media
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Component of Plat-E media
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Component of Plat-E media
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700	Zeiss		For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfection reagent
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)	Sigma	A7811	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	For virus filtration
6 mL Syringes	Covidien	8881516937	For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488	Abcam	AB150169	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	For cell permeabilization
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates	Olympus	25-260
6-well plates	Genesee Scientific	25-105
24-well plates	Genesee Scientific	25-107
10 cm Tissue culture dishes	Corning	4239
15 cm  Tissue culture dishes	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Conical tubes	Corning	4308
50 mL Conical tubes	Corning	4249
0.4% Trypan blue solution	Sigma	T8154	For viability
Ethyl Alcohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Scientific	6009