הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Summary

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

Abstract

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

Introduction

הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון לפתח בעובר ^{1, 2.} בשיתוף עם מערכת הדם, היא מספקת חמצן, חומרי הזנה, וכן מנגנון סילוק פסולת במהלך פיתוח. שלושה שבועות לאחר ההפריה, הלב האנושי פועם בפעם הראשונה והרגולציה הראויה מתוחזק על ידי cardiomyocytes (CMS). ההפסד בלתי הפיך של תאים מיוחדים אלה היא אפוא הנושא היסודי אותו אי ספיקת לב מתקדמת. בעוד כמה אורגניזמים כגון דג הזברה Xenopus יש פוטנציאל להתחדשות לב, הלב של יונקי הבוגרים מוגבל יותר ^{3, 5, 6.} לפיכך, בהתחשב הפונקציה הקריטית של הלב, אין זה מפתיע כי מחלת לב היא הגורם המוביל למוות בעולם, והיוותה 600,000 מקרי מוות בארצות הברית לבדה ^7. הrefore, טיפולים מבוססי תאים כדי לתקן או להחליף את שריר הלב נפגע ביעילות הם עניין קליני גדול.

המחקר הזרע של יאמאנאקה ועמיתיו ⁸ הראה כי ביטוי כפוי של ארבעה גורמי שעתוק מספיק כדי להמיר תאי פיברובלסטים בדיל באופן מלא לתאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, יכולת tumorigenic של כל אסטרטגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים כבר דאגה קריטית בשימוש שלהם למטרות טיפוליות. זה הניע התחום המדעי לחפש שיטות חלופיות כדי transdifferentiate תאים תוך הימנעות שלב פלוריפוטנטיים. לאחרונה, מספר קבוצות הראו את הכדאיות של אסטרטגיה זו על ידי הצגת המרה ישירה של פיברובלסטים עכבר לתאי cardiomyocyte דמוי המושרה (iCLMs) עם ביטוי אקטופי של שעתוק גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ובהמשך, Hand2 (GMT ו GHMT ^{9, בהתאמה), 10.} Furthermore, באותה האסטרטגיה ניתן לבצע in vivo ו ברקמות אדם נגזר ^{9, 11, 12.} מחקרים שנעשה לאחרונה הדגישו גורמים נוספים או מסלולי איתות כי יכול להיות מווסת כדי לשפר את יעילות תכנות מחדש של לב עוד ^{13, 14, 15.} יחדיו, מחקרים אלה להדגים את הפוטנציאל של transdifferentiation ביים עבור טיפולים רגנרטיבית. עם זאת, היעילות הנמוכה של תכנות מחדש CM, המנגנונים המולקולריים הידועים, שחזור עולה בקנה אחד בשל הבדלים מתודולוגיים ^16, ואת האופי הטרוגני של iCLMs להישאר unaddressed.

על מנת ישירות להעריך ההטרוגניות iCLM, עצבנו assay בדידה החזקה תא בודד לזיהוי התפתחות sarcomere ו specificatio שושלת לבn ושניים מאפיינים דרושים של cardiomyocytes הפונקציונלי. יש לפחות שלושה סוגים עיקריים של CM בלב כהגדרתו לפי המיקום שלהם תכונות חשמליות ייחודי: פרוזדורים (PM), חדרית (VM) ו קוצב לב (PM) ^{17, 18, 19, 20.} בשנת מערך מתוזמר, הם לאפשר שאיבה הנכונה של דם. במהלך פגיעה לבבית, אחד או כל תת עלול להיפגע, ואת הסוג של טיפול בתא היה צורך לטפל על בסיס כל מקרה לגופו. כיום, רוב האסטרטגיות להתמקד בדור הכולל של cardiomyocytes, בעוד מעט עבודה נעשתה כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים אשר מסדיר מפרט תת סוג.

המחקר הבא מפרט כיצד לכמת כראוי סרקומר מאורגן היטב לזהות קבוצה מגוונת של תת cardiomyocyte. באמצעות קוצב לב (PM) עכבר כתב -specific, אנו מסוגלים להחיל iהגישה mmunocytochemical להבחין מיוציטים המושרה דמוי פרוזדורים (IAM), myocytes חדרית דמוי המושרה (IVM), ו myocytes PM דמוי המושרה (iPMs) ^21. בהתבסס על התצפיות שלנו, רק תאים כי תערוכת ארגון sarcomere מסוגלים פועם ספונטני. פלטפורמת תכנות מחדש ייחודית זו מאפשרת להערכת התפקיד פרמטרים מסוימים של בארגון sarcomere, מפרט תת סוג, והיעילות של תכנות מחדש CM ברזולוציה תא בודד.

Protocol

כל הפרוצדורות הכרוכות שיטות חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במרכז הרפואי Southwestern UT.

1. ניתוק של Hcn4-GFP E12.5 עכבר עובריים פיברובלסטים (MEFs)

1. הגדרת הזדווגויות מתוזמן בין זכרים Hcn4-GFP הומוזיגוטים ונקבות CD-1.
2. הקורבן נקבה בהריון E12.5 ידי המתת חסד פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם לאחר מכן.
   1. סר קרן רחם עם מלקחיים לנתח כפי שתואר לעיל ^{22, 23,} ולהכניס אותם לתוך צלחת פטרי על קרח עם בופר פוספט 1x (PBS) ללא Ca ^{2 +} או Mg ^2+.
3. ביצוע כל הצעדים הבאים בשכונה בתרבית רקמה באמצעות טכניקה סטרילית.
   1. הסר את העוברים מן הרחם מי שפיר שק באמצעות מספריים לנתח מלקחיים. שמור את השליה מחוברת לטיפול טוב יותר. PregnaCD-1 NT הנקבות בדרך כלל ללדת בין 10 ל 14 גורים.
   2. שימוש לנתח מלקחיים, לקחת את העוברים המבודדים ובמהירות לשטוף אותם פעמים 70% (v / v) EtOH.
      הערה: השטיפות צריכות להיות מהירות כדי למזער מוות של תאים.
   3. הסר את הראש, גפיים, זנב, ואיברים פנימיים, כולל הלב מן העוברים המבודדים.
   4. מניחים את הרקמה הנותרת בצלחת 10 ס"מ עם 1 מ"ל של 1x PBS ופשטי- דק באמצעות סכין גילוח סטרילי עד כ 1 מ"מ ³ בגודל.
   5. העברת רקמות טחון לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל עם PBS.
   6. ספין ב 300 XG במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב PBS עודף.
   7. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA סטרילי לכל העובר. דגירת תאים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בעדינות מערבבים את הצינור כל 4 דקות. יתר העיכול של הרקמות תפחית באופן משמעותי את התשואה.
   8. תערובת תאים וורטקס במהירות מרבית (3,200 סל"ד) במשך 4 שעות.
   9. הוסף 2 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים לכל העובר ומערבבים. t מסנןhrough מסננת תא 100 מיקרומטר בעזרת פיפטה כדי לסייע התאים דרך המסננת. עיין בטבלה 1 לגיבוש כל המדיומים הבאים.
   10. ספין ב 300 XG למשך 4 דקות. בזהירות לשאוב supernatant.
   11. הוסף 10 מ"ל של התקשורת פיברובלסטים טריים לכל 3 עוברים triturate 6-10 פעמים.
   12. פלייט התאים 1 צלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ עבור כל 3 עוברים מוכנים. לילה תרבות חממה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   13. לאחר דגירת הלילה, להחליף את התקשורת עם 30 מיליליטר טרי של תקשורת לכל צלחת. מניח תאים בחזרה לתוך חממת הלילה.
       הערה: בדוק Hcn4-GFP ⁺ תא זיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התרבות צריכה להיות GFP ^- ורק להיות GFP ⁺ על תכנות מחדש.
   14. למחרת, תאי קציר עם 3 מיליליטר של 0.25% מחוממים מראש הטרי טריפסין-EDTA. רוזן ולהקפיא תאים. בדרך כלל, להקפיא תאים ב 3 x 10 ⁶ תאים לכל מיליליטר. Yie הצפויld צריך להיות 3 x 10 ⁶ תאים לכל עובר.

הפקת רטרו-וירוס 2. תכנות מחדש

זהירות: הפרוטוקול הבא דורש ייצור וטיפול רטרווירוסים זיהומיות. בצע את השלבים הבאים בתוך ארון בטיחות ביולוגית רמה 2 תחת הנחיות BSL-2 ו טכניקה סטרילית. השתמש 10% אקונומיקה להיפטר מכל החומרים חשופים רטרווירוסים.

1. ייצור רטרו-וירוס והכנת MEFs
   הערה: הפרוטוקול הבא הוא לייצור retroviral 6 צלחות היטב זיהום MEF ב 24 גם צלחות. עבור פורמטים אחרים, עיין בטבלה 2. MEFs הם מצופה ב יום -1, ולכן העיתוי יהיה צורך בתיאום כראוי עבור כל ניסוי (ראה גם סעיף 2.3 ו איור 2).
   1. לשמור פלאט-E (PE) תאים לפי המלצות היצרן. בקצרה, תאים PE תרבות DMEM בתוספת 10% FBS, 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​puromycin, 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​blasticidin, פניצילין, סטרפטומיצין. מעבר תאים 1: 4 כל יומיים כאשר התרבות מגיע 70-90% confluency.
   2. יום -2: היום לפני transfection, זרע תאי פלאט-E ב 1 x 10 ⁶ תאים / גם בצלחת 6 באר במדיה transfection. תאים צריכים להיות ומחוברות 70-80% בזמן transfection.
2. Transfection באמצעות סוכן transfection מסחרי.
   הערה: ריאגנטים המסחריים צריכים להיות בטמפרטורת חדר (RT) לפני transfection. עבור transfection DNA, להוסיף כל פלסמיד דנ"א retroviral בנפרד (G, H, M, ו- T) כדי ליצור קוקטייל GHMT ^9.
   1. יום -1: בתוך צינור פוליסטירן חרוטי 15 מ"ל, לערבב 60 μL של התקשורת סרום מופחת עם 6 μL של מגיב transfection לכל תגובה עבור פורמט 6-גם צלחת. דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: מאז מגיב transfection משמש כאן נקשר פלסטיקה,DD ישירות בתקשורת בסרום המופחתת כדי למנוע ירידה ביעילות transfection.
   2. להוסיף סך של 2 מיקרוגרם של קוקטייל GHMT לכל תגובה לטפוח בעדינות לערבב אותו. לא מערבולת. דגירת התגובה במשך 15 דקות ב RT.
   3. מוסיף את תערובת משלב 2.2.3 לתאי PE בצורת טיפה חכמה.
   4. דגירת תאי פלאט-E טרנספקציה לילה חממת ₂ 37 מעלות צלזיוס, 5% CO. קלט בזמן transfection.
3. זריעה של פיברובלסטים עובריים בעכבר Hcn4-GFP.
   1. 1 שעות לפני ציפוי MEFs, להכין צלחת 24 גם עבור immunocytochemistry.
      1. הוספת coverslip פיברונקטין 12 מ"מ לכל טוב.
      2. בארות מעיל עם 300 μL של פתרון קולגן שור (למשל, SureCoat) דגירה של 37 ° C חממה עבור H 1.
      3. פתרון הציפוי לשאוב מיד לפני ציפוי MEF.
   2. להפשיר בקבוקון קפוא של Hcn4-GFP MEFs ולשטוף x1 עם fibrobl מחומם מראשתקשורת אס 'ב XG 500 במשך 5 דקות.
   3. לקבוע כדאיות התא באמצעות הרחקה trypan כחול או צבעים דומים. לחשב את מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות באמצעות הנוסחה הבאה:
      תאי קיימא% = [1.00 - (מספר התאים הכחולים / מספר התאים הכוללים)] x 100
      1. חישוב מספר כולל של תאי קיימא באמצעות הנוסחא הבאה:
         תאי חיים = תאי% קיימא x גורם לדילול x 10,000 x נפח כולל של השעית תא
   4. זרע 3 x 10 ⁴ תאים לכל טוב על צלחת 24 גם עם coverslip פתרון פיברונקטין קולגן שור שהוכן קודם לכן.
4. התמרה ואת תכנות מחדש של MEFs
   הערה: על פי רשימותיו של היצרן, מתוחזקים היטב תאי פלאט-E לייצר כייל ממוצע של 1 x 10 ⁷ יחידות זיהום / מיליליטר. למרות כייל אינו נמדד ישירות עבור כל ניסוי, פקד GFP כלול תמיד כתחליף יעיל זיהום.ביטוי של GFP גבוה ועצמה (GFP ^+> 95%) בדרך כלל בקורלציה עם דור מוצלח בתיווך GHMT של iCLMs.
   1. יום 0: 24 שעות שלאחר transfection, לסנן המדיום retroviral PE דרך פילטר אצטט תאית פעילי שטח ללא גודל 0.45 מיקרומטר נקבוביות ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. להוסיף polybrene לריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. בזהירות לחדש תאים עם 2 מ"ל של מדיום transfection טריים.
      הערה: תאים בקלות לנתק מהצלחת אם התקשורת משתנה מהר מדי.
   2. לשאוב את המדיום של MEFs התרבותי ולהוסיף מדיום retroviral שנאסף טרי; זה אמור להניב 1.7 מ"ל של התקשורת לכל גם צלחת 6 באר. הוסף את ~ 800 μL לכל טוב של צלחת 24 גם. חזור צלחת MEF אל האינקובטור דגירת הלילה.
   3. יום 1: חזור על שלבי 2.4.1 ו 2.4.2. מחק תאים לאחר איסוף 2 ^nd וירוס. חזור MEFs הנגוע אל האינקובטור ולתת להם לנוח לילה.
   4. יום 2: 48 שעות לאחר אינדוקציה, לשאוב את x1 תקשורת לשטוף מותנית התא עם 1x PBS. הוספת 500 μL מחומם מראש מדיה iCLM לכל גם צלחת 24 באר.
   5. חלף תקשורת iCLM כל 2 - 3 ימים. צלחת תהליך 14 ימים לאחר אינדוקציה ויראלי עבור immunocytochemistry (ICC) ניתוח של תכנות מחדש של הלב.

3. Immunostaining של MEFs לתכנות מחדש

1. 14-ימים-אינדוקציה פוסט, לשאוב התקשורת בזהירות.
2. יש לשטוף היטב עם כל 300 μL של PBS 1x קר כקרח. לשאוב פתרון עודף.
3. תקן תאים עם 250 μL של paraformaldehyde 4% (PFA) פתרון לכל גם צלחת 24 באר. דגירה 15 דקות ב RT.
   הערה: קבוע התאים ניתן לאחסן PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 - 2 שבועות לפני מכתים.
4. תאים Permeabilize ידי x3 בארות כביסה עם 300 μL 0.1% PBS-TritonX 100 (PBST). דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
5. בלוק 10דקות ב RT עם הצפת 1x יוניברסל בלוק ב 300 μL / טוב.
6. הכן חיץ מכתים (ICC): הוסף 1: 1 של PBS 1x ו 1x יוניברסל חסימת חיץ. מדולל נוגדנים עיקריים במאגר מכתים ICC דגירת נוגדני הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים.
   1. כתם זוג אחד של שקופיות עם α-actinin עכבר, עוף αGFP וארנב Nppa עבור IPM והזדהות IAM.
   2. הכתם זוג אחד של שקופיות עם-actinin α העכבר, עוף αGFP וארנב Myl2 לזיהוי IPM ו IVM.
7. למחרת, לשטוף x3 בארות עם 300 μL 0.1% PBST. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. לשאוב פתרון עודף לאחר לשטוף האחרון.
8. כן דילולי הנוגדנים משני במאגר מכתים ICC. עיין בסעיף חומר דילולים מומלצים. דגירה נוגדנים משני 1 שעות ב RT, מוגן מפני אור.
   1. כתם כל השקופיות עם antibodie משני הבאs: עכבר Alexa-555, עוף Alexa-488, ארנב Alexa-647.
9. לשטוף x3 בארות עם 300 PBST 0.1% μL. דגירה 5 דקות ב RT בין שוטף. להגן מפני אור.
10. להוסיף 2.4 μL של התקשורת הרכבה המכיל 1.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. מוציאים בזהירות את coverslip מהבאר של צלחת 24 גם, להסיר פתרון עודף, ולהעביר לשקופית זכוכית עם התקשורת גובר. לחץ בעדינות את coverslip להסיר נפח אוויר עודף.
11. מגלשות חותמות עם לק העדיף או איטום פלסטיק. חנות רכובה שקופיות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.

זיהוי 4. של תת לב באמצעות מיקרוסקופ Confocal

הערה: עבור הדמיה, מיקרוסקופ confocal מצויד לפחות 2 גלאי פלורסנט מסוגל זיהוי רפאים ב 405, 488, 555, ו 639 אורכי גל nm הוא הכרחי על מנת לזהות iPMs, איימס, ו iVMs. iMAGתאי דואר באמצעות תוכנית-Apochromat 20X / 0.75 אובייקטיבי או טוב יותר. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של היצרן, סריקת תמונות זום יכול להשיג תמונות באיכות טבילת 40X-שמן.

1. תמונה הספרייה: לקחת תמונות של 8 סיביות עם DAPI, Alexa-488, Alexa-555, וערוצי Alexa-647 (ch.). פיקסל להתעכב זמן של 6 שניות, גודל מסגרת 1024, צעד בתור 2, והעמיד ממוצע של 2 מספיק עבור תמונות ברזולוציה גבוהות.
2. עבור כל שקופית, להתחיל מקצה אחד ולהתחיל סריקה למעלה ולמטה בערוץ ניאון אדום (ch.) עבור-actinin α ⁺ תאים sarcomere ⁺ (עיין איור 3 ואיור 5A לדוגמאות). פסי sarcomere קלים יותר לזהות ויזואלית את אורך גל 555 ננומטר.
   1. ברגע α-actinin ⁺ תא sarcomere ⁺ זוהה, לעבור CH ירוק. ולשמור פתק, ככל שהיא חיובית (IPM). Switch למחשב להעריך את פרק 647 מרחיקות אדום. (IAM או IVM).
      הערה: תאים שאינם α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / Nppa ^- / Myl2 ^- מיועדים iPMs. ביטוי של GFP יהיה לראות ברחבי התא (איור 4 א).
   2. מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Nppa (ארנב-Alexa647), ו DAPI. תאים הם α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Nppa ⁺ הם IAM. מכתים Nppa יופיע perinuclear ו punctate (איור 4B).
   3. מגלשות הכתם עם-actinin α (עכבר Alexa555), Hcn4-GFP (עוף-Alexa488), Myl2 (ארנב-Alexa647). תאים חיוביים-actinin α ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Myl2 ⁺ הם iVMs. מכתים Myl2 יפגין צורה מפוספסת לאורך נימת sarcomere. בשל וריאציות באיכות מכתים והמטוס-Z, תלמים לא תמיד גלוי בקלות (איור 4C).

= "Jove_title"> 5. קְבִיעַת כָּמוּת

הערה: על מנת להעריך את המספר האמיתי של MEFs לתכנות מחדש באופן פוטנציאלי, 2 בארות צלחת 24 גם הם זורעים במקביל הבארות הניסיוניות נקצרות יום אחד לאחר הציפוי. המספר הכולל של תאים מצופה מכן נקבע על ידי חישוב ממוצע שתי הבארות. זה הופך את התאים הכוללים בפועל המצופים (aTotal).

1. sarcomere ⁺
   1. ראייה לבדוק כל תא על coverslip עבור-actinin α נכונה ⁺ / sarcomere ⁺ (לוחות מימין איור 3) ולהקליט (איור 5 ב-ט).
   2. לסדר בטבלה את המספר הכולל של-actinin α ⁺ / sarcomere ⁺ על כל coverslip ומתחלקים על ידי התאים הכולל בפועל מצופה (aTotal) (איור 5 ב-iii). לדוגמא, אם aTotal = 12,500 תאים, ו -100 תאים היו אלפא-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ אז, 0.8% של MEFs המצופה היו לתכנות מחדש. ממוצעניסוי reprograming יניב 1% α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ תאים (איור 5 ג).
2. סוג משנה ⁺
   הערה: לקבלת השלבים הבאים, עיין איור 5 ב / C עבור זרימת עבודה כימות נציג iCLM. בקצרה, לכל sarcomere ⁺ תא, לסדר בטבלה אם הוא ייחודי עבור תת סוג (איור 5 ב-ט). חישוב סוג משנה% (איור 5 ב-iii) על ידי חלוקת מספר התאים תת סוג ⁺ מעל sarcomere הממוצע ⁺ תאים x 100 (איור 5 ב-ט). כדי לחשב את היעילות המוחלטת% תת סוג (איור 5 ב-ד), חלק את המספר תת סוג ⁺ תא מ איור 5 ב-i במספר הכולל של תאים הזורעים x 100 (איור 5 ב-ii).
   1. עבור כל אחת actinin-α ⁺ / sarcomere ⁺ תאים, להעריך אם הם GFP ^+, Nppa ^+, או Myl2 +.
   2. לסדר בטבלה המספר הכולל של α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ⁺ / Nppa ^- / Myl2 ^-, actinin ⁺ / sarcomere ⁺ / Hnc4-GFP ^- / Nppa _^+, ו α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ /-GFP Hnc4 ^- / Myl2 ⁺ תאים (איור 5 _ב-ט).
   3. כדי לחשב את האחוז כל תת-סוג, לחלק את מספר תאי סוג משנה ⁺ במספר הכולל של α-actinin ⁺ / sarcomere ⁺ תאים כי גם להכפיל 100. GHMT מייצר iPMs, איימס, ו iVMs בערך יחסים שווים (איור 5B-iii).
   4. כדי לחשב את מספרם המוחלט של תת-סוג ⁺ תאים, לחלק את המספר הכולל של תת-סוג ⁺ תאים עבור תנאי הניסוי ידי aTotal ולהתרבות על ידי 100 (איור 5 ב-ii). ביום iPMs הממוצע מייצג 0.3% מכלל אוכלוסיית התא הנגוע הכוללת, איימס 0.3%, ו0.25% iVMs (איור 5 ב-ד).

תוצאות

ניצול של העכבר הכתב PM-ספציפי, פיתחנו אסטרטגיה immunostaining זמנית לזהות מיוציטים אנדוגני מגוונים כמו מתואר באיור 1. בעקבות צעדי תכנות מחדש שמוצגים באיור 2, אינדוקציה של CMS ספציפי תת סוג ניתן לאתר מוקדם ככל יום 4 ^21, אם כי שיעור ?...

Discussion

המחקר הנוכחי מספק אסטרטגיה ישיר תכנות מחדש לגיור של MEFs לתוך קבוצה מגוונת של תת הלב באמצעות ביטוי בתיווך רטרו-וירוס של שעתוק לב גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ו Hand2 (GHMT). שימוש בגישת immunostaining זמנית בשילוב עם עכבר כתב PM-ספציפי, אנו מסוגלים לזהות IAM, iVMs, ו iPMs ברזולוצית תא בודד. כזה assay מאפש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)	Sigma	F2442	Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Component of iCLM media
MEM vitamin solution	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Component of iCLM media
MEM amino acids	Thermo Fisher Scientific	1601149	Component of iCLM media
Non-Essential amino acids	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Component of iCLM media
Antibiotic-Antimycotics	Thermo Fisher Scientific	15240062	Component of iCLM media
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Component of iCLM media
NaPyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Component of iCLM media
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A11139-03	Component of Plat-E media
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Component of Plat-E media
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700	Zeiss		For confocal analysis
FuGENE 6 transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfection reagent
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTA	Thermo Fisher Scientific		For MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)	Sigma	A7811	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Vector Labs	H-1500	Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slides	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslips	NeuVitro Corp	GG-12-1.5	Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainer	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	For virus filtration
6 mL Syringes	Covidien	8881516937	For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488	Abcam	AB150169	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	For cell permeabilization
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal Blocking reagent	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	Electro Microscopy Sciences	15710	Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  plates	Olympus	25-260
6-well plates	Genesee Scientific	25-105
24-well plates	Genesee Scientific	25-107
10 cm Tissue culture dishes	Corning	4239
15 cm  Tissue culture dishes	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Conical tubes	Corning	4308
50 mL Conical tubes	Corning	4249
0.4% Trypan blue solution	Sigma	T8154	For viability
Ethyl Alcohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleach	Thermo Fisher Scientific	6009