JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

要約

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs).

We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

概要

心臓は胚1、2に開発した最初の機能的器官です。循環器系に関連して、開発中に、酸素、栄養素、および廃棄物処理機構に供給する。三週間受精後、人間の心は初めて打つとその適切な規制は、心筋細胞（のCM）によって維持されています。これらの特殊化した細胞の不可逆的損失は、したがって、進行性の心不全の根底にある基本的な問題です。このようなゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのようないくつかの生物は、心臓の再生の可能性を有しているが、大人の哺乳類の心臓は3、5、6、より限定されています。このように、心の重要な機能を考えると、心臓病は米国だけで60万人が死亡7を占め、世界における死亡の主な原因であることは驚くべきではありません。ザrefore、効率的に負傷した心筋を修理または交換するために、細胞ベースの治療は臨床上非常に興味深いものです。

山中ら8の精液の研究は、4つの転写因子の強制発現は、多能性幹細胞に完全に分化した線維芽細胞に変換するのに十分であることを示しました。しかし、すべての多能性幹細胞戦略の腫瘍形成能力は、治療目的のためのそれらの使用における重大な関心事となっています。これは、多能性段階を回避しながら細胞を分化転換するための代替方法を検索するための科学的なフィールドをやる気。最近、いくつかのグループは、転写の異所性発現は、GATA4、MEF2C、TBX5、および後に、Hand2（GMTとGHMT因子を用いて誘導心筋細胞様細胞（iCLMs）にマウス線維芽細胞の直接変換を表示することにより、この戦略の実現可能性を示していますそれぞれ）9,10。 Furthermore、同じ戦略は、 インビボおよびヒト由来の組織9、11、12で行うことができます。最近の研究では、追加の因子またはさらなる心臓再プログラミング効率13、14、15を改善するために調節することができるシグナル伝達経路を強調しています。まとめると、これらの研究は、再生治療のために向かう分化転換の可能性を示します。しかし、方法論的差異16にCMの再プログラミング、未知の分子機構、一貫性のない再現性の低効率、およびiCLMsの不均一な性質は、アドレス指定されないままです。

直接iCLM不均一性を評価するために、我々は、サルコメアの開発および心臓系統specificatioの同定のために離散的で堅牢な単一細胞アッセイを設計しましたn-2の機能的心筋細胞の必要な特性。それらの場所でユニークな電気的特性によって定義されたCMの少なくとも三つの主要なタイプは、心臓である：心房（AM）は、心室（VM）及びペースメーカー（PM）17、18、19、20。オーケストレーションの組み合わせで、それらは、血液の適切なポンピングを可能にします。心臓損傷の間、一つまたはすべてのサブタイプが影響を受ける可能性があり、および細胞治療のタイプは、ケースバイケースで対処する必要があります。少し作業は、サブタイプの仕様を調節する分子メカニズムを研究するために行われている間、現在、ほとんどの戦略は、心筋細胞の全体的な世代に焦点を当てています。

以下の研究は、適切によく組織サルコメアを定量化し、心筋細胞のサブタイプの多様なセットを識別する方法について詳しく説明します。ペースメーカー（PM）特異的レポーターマウスを用いて、Iを適用することができます誘導された心房のような筋細胞（IAM）、誘導された心室のような筋細胞（IVM）、および誘導されたPM-様筋細胞（IPMS）21を区別するためにmmunocytochemicalアプローチ。我々の観察に基づいて、サルコメア組織を示す細胞のみが自発的な拍動することが可能です。このユニークな再プログラミングプラットフォームは役割を評価することができます サルコメア組織、サブタイプの仕様、および単一セルの解像度でCMの再プログラミングの効率の特定のパラメータの。

プロトコル

動物プラクティスを含む全ての実験手順は、UTサウスウェスタン医療センターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

HCN4-GFP E12.5マウス胚線維芽細胞（MEFの）の1の単離

  1. ホモ接合HCN4-GFPの雄とCD-1雌との間の時限交配を設定します。
  2. 二酸化炭素安楽死とその後の頸椎脱臼によりE12.5で妊娠中の女性を生け贄に捧げます。
    1. 2+、以前22記載されているように鉗子を解剖して子宮角を取り除き23、およびCa 2+又はMgなしの1xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で氷上でペトリ皿に入れます。
  3. 無菌技術を用いて組織培養フード内のすべての後続の手順を実行します。
    1. はさみを使用して鉗子を解剖SAC子宮と羊膜から胚を削除します。よりよい処理のために取り付けられた胎盤を保管してください。プレグナNT CD-1雌は一般的に10〜14の仔を出産します。
    2. 鉗子を用いて解剖、単離された胚を取り出し、すぐに70％（v / v）のエタノールで二回それをすすぎます。
      注：洗浄は、細胞死を最小にするために高速である必要があります。
    3. 孤立した胚からの心臓を含む、頭部、四肢、尾、と内臓を取り除きます。
    4. 約1mm 3サイズのに滅菌カミソリの刃を使用して、1×PBSと細かくミンチ1mLの10 cmディッシュに残っている組織を置きます。
    5. PBSで50 mLコニカルチューブにみじん切りの組織を転送します。
    6. 3分間300×gでスピン。慎重に過剰のPBSを吸引します。
    7. 胚あたりの滅菌0.25％トリプシンEDTAの1 mLを加え。 15分間37℃の水浴中で細胞をインキュベートします。優しくチューブごとに4分を混ぜます。組織の過消化は大幅に歩留まりを低下させるであろう。
    8. 4秒、最高速度（3,200 rpm）で渦細胞混合物。
    9. 胚あたりの線維芽細胞の培地2 mLを加え、混合します。フィルタートンストレーナーを通して細胞を補助するために、ピペットを用いて100μmの細胞ストレーナーhrough。後続のすべての媒体の製剤については、 表1を参照してください。
    10. 4分間300×gでスピン。注意深く上清を吸引。
    11. 3胚あたりの新鮮な線維芽細胞培地を10mLを加え、6-10回粉砕します。
    12. 調製したすべての3胚1 15 cmの組織培養皿において細胞をプレート。 37°C、5％CO 2インキュベーター内で培養一晩。
    13. 一晩のインキュベーションの後、プレート当たりメディアの新鮮な30mLでメディアを交換。一晩バックインキュベーターにセルを配置します。
      注：蛍光顕微鏡下でHCN4-GFP +細胞の混入を確認してください。文化はGFPであるべき-とのみ再プログラミングの際にGFP +になります。
    14. 翌日、新鮮予め温めておいた0.25％トリプシンEDTA 3mlで収穫細胞。細胞を計数し、凍結。一般的に、ミリリットル当たり3×10 6個の細胞で細胞を凍結します。予想yieldは胚あたり3×10 6個の細胞でなければなりません。

2.レトロウイルス生産とリプログラミング

注意：以下のプロトコルは、感染性レトロウイルスの生産と処理が必要です。 BSL-2ガイドラインおよび滅菌技術の下でバイオセーフティレベル2キャビネットには、次の手順を実行します。レトロウイルスに暴露され、すべての材料を処分するために10％の漂白剤を使用してください。

  1. レトロウイルスの生産とMEFの準備
    注：以下のプロトコルは、24ウェルプレートにおけるレトロウイルス6ウェルプレートの生産とMEFの感染症のためのものです。他のフォーマットについては、 表2を参照してください。 MEFのは、1日目でプレーティングされているので、タイミングが（セクション2.3と図2を参照してください）各実験のために適切に調整される必要があります。
    1. ぷらっと-E（PE）製造者の推奨に従って細胞を維持します。簡潔には、DMEMで培養PE細胞を、10％FBS、を1μg/ mLのpuromyを補充しますCIN、を10μg/ mLのブラストサイジン、ペニシリン、およびストレプトマイシン。継代細胞1：4の文化は百分の70から90までの密集度に達するごとに2日。
    2. 日-2：トランスフェクションの前日に、トランスフェクション培地中で1×10で6個の細胞/ウェルで6ウェルプレート上のPlat-E細胞を播種します。細胞は、トランスフェクション時の百分の70から80までのコンフルエントであるべきです。
  2. 商業トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクション。
    注：市販の試薬は、トランスフェクション前に室温（RT）であるべきです。 DNAトランスフェクションのために、GHMTカクテル9を形成する個々のレトロウイルスプラスミドDNA（G、H、M、およびT）を加えます。
    1. 1日目は：15 mLコニカルポリスチレンチューブでは、6ウェルプレートフォーマットのための反応当たりのトランスフェクション試薬の6μLで還元血清培地の60μLを混ぜます。室温で5分間混合物をインキュベートします。
      注：ここで使用されるトランスフェクション試薬は、プラスチックに結合するので、A直接低血清培地をトランスフェクション効率の低下を避けるためにDD。
    2. 反応あたりGHMTカクテル2μgの合計を加え、穏やかにそれをミックスするタップします。ボルテックスしないでください。室温で15分間、反応をインキュベートします。
    3. ステップ2.2.3からの滴下方法で、PE細胞に混合物を追加します。
    4. 37℃、5％CO 2インキュベーター中で一晩トランスフェクトのPlat-E細胞をインキュベートします。トランスフェクションの時間を記録します。
  3. HCN4-GFPマウス胚線維芽細胞の播種。
    1. 1時間のMEFをメッキする前に、免疫細胞化学のための24ウェルプレートを準備します。
      1. ウェル当たり12ミリメートルのフィブロネクチンカバースリップを追加します。
      2. ウシコラーゲン溶液の300μL（ 例えば 、SureCoat）でコートウェルと1時間37℃のインキュベーターでインキュベートします。
      3. すぐにMEFメッキの前に吸引するコーティング液。
    2. HCN4-GFPのMEFの凍結バイアルを解凍し、予め温めておいfibroblとX1を洗います5分間、500×gでのASTメディア。
    3. トリパンブルー排除または類似の色素を用いて細胞生存率を決定します。以下の式を用いて培養物1mL当たりの生存細胞の数を計算します。
      ％生存細胞は= [1.00 - （総細胞の青色細胞の数/数）]×100
      1. 以下の式を用いて、生存細胞の総数を計算します。
        細胞懸濁液の生存細胞=％生存細胞のX希釈係数は、x万X全体積
    4. 先に調製したウシコラーゲン溶液フィブロネクチンカバーガラスと、24ウェルプレート上にウェルあたりシード3×10 4細胞。
  4. 形質導入とのMEFの再プログラミング
    注：メーカーのノートによると、適切ぷらっと-E細胞は、1×10 7感染単位/ mLの平均力価を生成維持しました。力価は直接各実験について測定されていないが、GFPコントロールは、常に感染効率の代理として含まれています。高いGFP発現と強度（GFP +> 95％）は、典型的には、iCLMsの成功GHMT媒介世代と相関します。
    1. 0日目：24時間トランスフェクション後は、0.45μmの細孔サイズの界面活性剤を含まない酢酸セルロースフィルターを通してPEレトロウイルスの媒体をフィルタリングし、15 mLコニカルチューブに移します。 8μgの/ mLの最終濃度にポリブレンを追加します。慎重に新鮮なトランスフェクション培地2mLで細胞を補充。
      注：メディアがあまりにも急激に変更された場合、細胞は、容易にプレートから切り離します。
    2. 培養したMEFの培地を吸引し、新鮮に収集したレトロウイルス培地を追加します。それは、6ウェルプレートのウェルあたりのメディアの1.7ミリリットルを得られるはずです。 24ウェルプレートのウェル当たり〜800μLを追加します。インキュベーターにMEFプレートを戻し、一晩インキュベートします。
    3. 1日目：ステップ2.4.1と2.4.2を繰り返します。 2 番目のウイルス回収後細胞を廃棄してください。インキュベーターに感染したMEFを返し、それらを一晩休ませて。
    4. 2日目：48時間誘導後、1×PBSで細胞馴化培地と洗浄×1を吸引。 24ウェルプレートのウェル当たり500μLの事前温めiCLMメディアを追加します。
    5. 3日間 - すべての2 iCLMメディアを交換してください。 14日、心臓再プログラミングの免疫細胞化学（ICC）分析のためのウイルス誘導後のプロセスプレート。

再プログラムしたMEFの3免疫染色

  1. 14日誘導後、慎重にメディアを吸引除去します。
  2. 氷冷1×PBS300μlで各ウェルをすすぎます。過剰の溶液を吸引します。
  3. 24ウェルプレートのウェル当たり4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液を250μLで細胞を固定してください。 RTで15分間インキュベートします。
    注： - 染色の前に、2週間固定した細胞は、1、4℃でPBS中に保存することができます。
  4. 300μLの0.1％PBS-トリトンX 100（PBST）で洗浄ウェル×3によって透過処理細胞。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
  5. 10ブロック300μL/ウェルで1×ユニバーサルブロックBufferで室温で分。
  6. （ICC）染色バッファーを準備します。ブロッキング緩衝液1×PBSおよび1×ユニバーサルの1：1を追加します。 ICC染色緩衝液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩抗体をインキュベートします。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。
    1. IPMとIAM識別するための1つのマウスαアクチニンとスライドのペア、鶏αGFP、およびウサギNPPAを染色します。
    2. IPMとIVM識別のためのマウスαアクチニン、鶏αGFP、およびウサギMyl2とスライドの1組を染色します。
  7. 次の日には、300μLの0.1％PBSTでウェル×3を洗います。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。最後の洗浄の後、過剰の溶液を吸引します。
  8. ICC染色緩衝液中の二次抗体希釈液を調製します。お勧めの希釈用材料のセクションを参照してください。二次抗体を光から保護し、室温で1時間、インキュベートします。
    1. 以下の二次antibodieですべてのスライドを染色S：マウスアレクサ-555、鶏のAlexa-488、およびウサギのAlexa-647。
  9. 300μL、0.1％PBSTでウェル×3を洗ってください。洗浄の間に室温で5分間インキュベート。光から保護します。
  10. ガラス顕微鏡スライドを4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）1.5μgの/ mLを含むマウンティング培地の2.4μLを加えます。慎重に、24ウェルプレートのウェルからカバースリップを削除する過剰の溶液を除去し、実装メディアでガラススライドに移します。静かに過剰量と空気を除去するためにカバースリップを押してください。
  11. 好適なマニキュアやプラスチックシーラントでシール摺動します。ストアは、光から保護して4℃でスライドをマウントしました。

共焦点顕微鏡を使用した4心サブタイプの同定

注記：画像化のために、共焦点顕微鏡は、少なくとも2つの蛍光体405でのスペクトル検出が可能な検出器、488、555、及び639 nmの波長を備えたIPMS、アイムス、及びIVMSを識別するために必要です。 IMAGプランアポクロマート20X / 0.75客観以上使用して電子細胞。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて、走査ズーム画像は、40X油浸品質の画像を達成することができます。

  1. イメージ・ライブラリーは：DAPI、アレクサ488、アレクサ555、およびAlexa-647チャンネルを8ビット画像を撮る（CH。）。画素が2で6 S 1024フレームサイズ、ライン工程の滞留時間、および2の平均化は、高解像度の画像のために十分です。
  2. 各スライドについて、一方のエッジから開始し、アップスキャンを開始し、αアクチニン+サルコメア+細胞用の赤色蛍光チャネル（CH。）におけるダウン（例については、図3を参照してくださいと、図5（a））。サルコメア条線は555 nmの波長で視覚的に識別するのが容易です。
    1. αアクチニン+サルコメア+細胞が同定されたならば、緑CHに切り替えます。それが正の場合と（IPM）をメモしておきます。遠赤647 CHを評価するために、コンピュータに切り替えます。 （IAMまたはIVM）。
      注：している細胞αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - IPMSとして指定されています。 GFPの発現は、細胞（ 図4A）を通して理解されます。
    2. αアクチニン（マウス-Alexa555）、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）で染色スライド、NPPA（ウサギ-Alexa647）、およびDAPI。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPである細胞- / NPPA +は IAMあります。 NPPA染色は核周囲や点状（ 図4B）が表示されます。
    3. αアクチニン（マウス-Alexa555）で染色スライド、HCN4-GFP（鶏-Alexa488標識）、Myl2（ウサギ-Alexa647）。 αアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP陽性の細胞- / Myl2 +は IVMSです。 Myl2染色はサルコメアフィラメントに沿って横紋形を示すであろう。染色およびZ-面の品質のばらつきに、条線は常に（ 図4C）簡単に表示されない場合があります。

5。定量化

注：潜在的に再プログラミングされたMEFの実際の数を評価するために、24ウェルプレートの2ウェルを実験ウェルに平行に播種され、メッキ1日後に収穫されます。播種した細胞の総数は、2つのウェルを平均することによって決定されます。これは、メッキ、実際の総細胞（aTotal）となります。

  1. サルコメア+
    1. 視覚的に適切なαアクチニン+ /サルコメア+（右パネルは図3を参照 ）とレコード（ 図5B-I）のためのカバースリップ上の各セルを検査します。
    2. メッキ実際の総細胞（aTotal）により、各カバースリップと除算にαアクチニン+ /サルコメア+の合計数を集計した （ 図5B-III）。 aTotal = 12,500細胞、及び100細胞はα-アクチニンた場合たとえば、+ /サルコメア+は、その後、メッキのMEFの0.8％を再プログラムしました。平均reprograming実験は、1％のαアクチニンは+ /サルコメア+細胞（ 図5C）を得ます。
  2. サブタイプ+
    注：以下の手順については、代表的なiCLM定量ワークフローについては、 図5B / Cを参照してください。それはどちらかのサブタイプ（ 図5B-I）のために一意である場合簡単に言えば、各筋節+セルのために、集計。平均サルコメア+細胞×100（ 図5B-I）オーバーサブタイプ+細胞の数を割ることによって（ 図5B-III）％のサブタイプを計算します。絶対％亜型効率（ 図5B-IV）を計算するには、×100（ 図5B-II）播種した細胞の総数で、図5B-Iからサブタイプ+細胞数を割ります。
    1. αアクチニン+ /サルコメア+細胞のそれぞれについて、彼らはGFP +、NPPA +、またはMyl2あるかどうかを評価 +アップ。
    2. / Myl2 - - 、アクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP - / NPPA +、およびαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFPαアクチニン+ /サルコメア+ / Hnc4-GFP + / NPPAの総数を集計- / Myl2 +細胞（ 図5B-I）。
    3. 各サブタイプの割合を計算するには、そのウェルで+ /サルコメア+細胞αアクチニンの総数でサブタイプ+細胞の数を分割し、100 GHMTを掛けIPMS、アイムス、およびIVMSでほぼ同じ比率を生成する（ 図5B-III）。
    4. 亜型+細胞の絶対数を計算するには、aTotalによる実験条件のサブタイプ+細胞の総数を除算し、100（ 図5B-II）を掛け。平均IPMSのIAMS 0.3％、総感染細胞集団の0.3％を表し、そしてIVMS 0.25％（ 図5B-IV）。

結果

PM固有のレポーターマウスを利用して、我々は、 図1に示されるように、多様な内因性の筋細胞を同定するための多重免疫戦略を開発しました。 図2に示す書き換え手順に続いて、サブタイプ特異的のCMの誘導は、低レートではあるが、早ければ4日目21として検出することができます。 14日目では、実験は、サルコメア組織（...

ディスカッション

本研究は、心臓転写のレトロウイルス媒介発現を介して、心臓のサブタイプの多様なセットにしたMEFの変換のためのダイレクトリプログラミング戦略を提供することはGATA4、MEF2C、TBX5、およびHand2（GHMT）要因。 PM固有レポーターマウスと組み合わせて多重免疫染色法を用いて、我々は、単一細胞の解像度でIAM、IVMS、およびIPMSを識別することができます。このようなアッセイは、サブタイプの...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

A.F.-P. was supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship under Grant No.2015165336. N.V.M was supported by grants from the NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838), and the March of Dimes (#5-FY14-203). We acknowledge Young-Jae Nam, Christina Lubczyk, and Minoti Bhakta for their important contributions to protocol development and data analysis. We also thank John Shelton for valuable technical input and members of the Munshi lab for scientific discussion.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMSigmaD5796Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Component of iCLM media
Fetal bovine serrum (FBS)SigmaF2442Component of iCLM media, Plat-E media, fibroblast, and Transfection media
Insulin-Transferrin-Selenium GThermo Fisher Scientific41400-045Component of iCLM media
MEM vitamin solutionThermo Fisher Scientific11120-052Component of iCLM media
MEM amino acidsThermo Fisher Scientific1601149Component of iCLM media
Non-Essential amino acidsThermo Fisher Scientific11140-050Component of iCLM media
Antibiotic-AntimycoticsThermo Fisher Scientific15240062Component of iCLM media
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044Component of iCLM media
Heat-Inactivated Horse SerumThermo Fisher Scientific26050-088Component of iCLM media
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Component of iCLM media
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514022Component of Plat-E media and fibroblast media
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Component of Plat-E media
Blasticidin  Gemini Bio-Products400-128PComponent of Plat-E media
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Component of Fibroblast media
Confocal laser scanning LSM700ZeissFor confocal analysis
FuGENE 6 transfection ReagentPromegaE2692Transfection reagent 
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070Transfection reagent 
PolybreneMilliporeTR-1003-GInduction reagent. Use at a final concentration of 8 μM/mL
Platinium-E (PE) Retroviral Packagin Cell Line, EcotropicCellBiolabsRV-101Retroviral pacaking cell line
Trypsin 0.25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Mouse anti α-Actinin (Clone EA-53)SigmaA7811Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Chicken anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antibody for confocal analysis. Use at 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA AbgentAP8534AAntibody for confocal analysis. Use at 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAntibody for confocal analysis. Use at 1:200
Vectashield solution with DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Dye for confocal analysis
Superfrost Plus Microscope slidesThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronectin 12 mm coverslipsNeuVitro CorpGG-12-1.5Coverslips for confocal analysis
100 μm cell strainerThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μm Syringes filters SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106For virus filtration
6 mL SyringesCovidien8881516937For virus filtration
Goat anti-Chicken IgY (H&L) A488AbcamAB150169Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Donkey anti-rabbit A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Goat anti-mouse IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Secondary antibody for confocal analysis. Use at 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlFor cell permeabilization 
Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Universal Blocking reagentThermo Fisher ScientificNC9495720Dilute to 1x in H2O
16% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Use at 4% diluted in dH2O
6 cm  platesOlympus25-260
6-well platesGenesee Scientific25-105
24-well platesGenesee Scientific25-107
10 cm Tissue culture dishesCorning4239
15 cm  Tissue culture dishesThermo Fisher Scientific5442
15 mL Conical tubesCorning4308
50 mL Conical tubesCorning4249
0.4% Trypan blue solutionSigmaT8154For viability
Ethyl Alcohol 200 proofThermo Fisher Scientific7005
BleachThermo Fisher Scientific6009

参考文献

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231 (2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243 (2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137 (2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807 (2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E., Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

121 IPM IAM IVM GATA4 Hand2 MEF2C TBX5 HCN4 NPPA Myl2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved