建立以临床为基础的生物制剂

摘要

经Mohs显微手术后，皮肤肿瘤经常被丢弃。这里描述了一种方案，使临床支持人员有效地处理和存储下游实验室应用的皮肤肿瘤（ 如鳞状细胞癌，基底细胞癌和黑色素瘤）样品，而不会干扰临床操作。

摘要

在过去几年中，皮肤癌（ 例如鳞状细胞癌，基底细胞癌和黑素瘤）的发病率一直在增加。预计对于生物医学研究研究的皮肤肿瘤样本将会有平行的需求。然而，由于建立生物制剂的成本和缺乏可用于获得不干扰临床操作的临床样品的方案，组织的可用性是有限的。建立了一项协议，收集和处理在莫氏手术之日对常规临床手术影响最小的皮肤肿瘤和相关血液和唾液样品。 Mohs组织学技术人员从经历第一层莫氏手术的患者收集并加工肿瘤样本，用于活检证实的皮肤恶性肿瘤。在手术闭合时收集相邻的正常组织。可能收集的其他样品是全血和颊拭子。通过使用通常丢弃的组织样本，生成生物反应器，其通过基于临床和实验室设置提供了几个关键优点。这些包括广泛收集的样品;获取未确定的患者记录，包括病理报告;而对于典型的捐助者，在后续访问期间可以获得额外的样本。

引言

癌症和生物标志物研究依赖于提供优质的人体组织样本，有限的供应阻碍了研究^1,2 。许多皮肤病学研究受到供应不足，质量变化以及与使用人体组织有关的成本的限制。建立大型专用生物库的成本估计约为200万美元³ ，这些成本将人体组织的使用放在许多研究人员的触角之外。此外，生成和存储研究样本的过程有可能影响临床操作，并延迟患者护理，如果不慎重执行。已经建立了一个具有成本效益，基于诊所的生物反应器，其重点是按照推荐的最佳实践和样品验证^4,5,6 。

该协议已经在皮肤科诊所中开发，该诊所执行大量的Mohs显微手术以去除鳞状细胞癌（SCC），基底细胞癌（BCC）和黑素瘤皮肤癌。志愿者捐助者可以从这个病人群中招募。重要的是在收集部位建立生物反应器，以迅速从同意的患者中获取组织和血液，而不会延迟治疗。收集相同诊所的样品可最大限度地减少采集技术的变化，并最大限度地减少样品质量的变化，这对于下游应用^7,8可能是有问题的。

莫氏显微手术技术的目的是确保所有的癌组织被去除，同时保留尽可能多的健康组织。该过程涉及逐渐去除肿瘤组织的薄层。每个连续的层是他的通过皮肤科医师进行病理学检查（在对肿瘤组织进行冷冻切片并进行H＆E染色后），以确定是否所有的癌组织都被去除。当患者留在办公室时，执行随后的组织层的切除和检查。该技术被认为是SCC ⁹的最佳治疗方案。此时，伤口闭合，为了改善愈合和美容外观，常常切除相邻的正常组织（ANT）。因此，这种去除肿瘤的外科手术理想地适用于收集组织学表征的组织用于将来的研究。

用于获得肿瘤组织，相邻正常组织，唾液和血液样本的采购程序被设计为对正常人员职责的影响最小（ 图1 ）。医疗助理在准备患者手术时进行抽血。在完成莫氏程序后，哦，组织技术人员准备标本的附加组织学载玻片并将组织转移到生物支架。与建立生物反应器相关的成本包括购买冷冻保存冷冻机，创建适度的临床实验室空间以及开发库存跟踪计划。

图1:样本收集和负责人员的顺序。病人登记并取得病人同意后，医疗助理将收集颊拭子并进行抽血。然后皮肤科医师和医疗助理人员切除肿瘤并关闭伤口，在此期间分别收集SCC和ANT标本。专门的实验室技术人员处理血液和切片SCC和ANT标本，用于组织培养，保存和进入生物支架。ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg"target ="_ blank">请点击此处查看此图的较大版本。

收集的样品的多样性可实现多种实验方法（ 图2 ）。从患者收集的样品是颊拭子（如果需要，也可以收集唾液），全血和切除的组织。颊拭子和来自全血的样品在不加工的情况下被保存用于基因分型和组织匹配。将全血分离成白细胞（WBC）和血浆级分用于未来分析。在Mohs加工之后，将冷冻的肿瘤直接置于液氮中并转移至-80℃的冷冻器中。使用先前技术10,11的修饰培养新鲜可行的肿瘤组织和ANT样品，然后冷冻保存。在收集期间，每个样本类型的数量在进入之前记录在电子表格上库存跟踪程序便于准确处理（ 表1 ）。

图2:基于临床的生物样品采集和处理的概述。从患者收集颊拭子和血液样品，并存储用于下游基因分型和组织匹配。全血进一步处理白细胞（WBC）分离和CTC分析，以及血浆采集和液体活检分析。在Mohs手术期间切除的组织进行组织学处理以用于诊断目的，之后组织学载玻片可用于实验用于进一步的免疫组织化学分析。假设切除的组织样本足够大，一部分新鲜组织被去除并切片以进行蛋白质和RNA分离，并建立培养的细胞系。55583 / 55583fig1large.jpg"target ="_ blank">请点击此处查看此图的较大版本。

收藏日期:
	病人1	病人2	病人3	病人4	病人5
姓名和出生日期
眼睛的颜色
样品类型
样品位置
唾液
w ^洞血
等离子体
肿瘤生存
组织正常生存
肿瘤莫氏液氮
组织正常液氮
幻灯片

表1:记录样品收集的清单。收集的每个样本跟踪和记录的数据包括患者姓名，出生日期和眼睛颜色（皮肤分类）以及位置取样。唾液样本的数量，采血量以及收集的活的和保存的组织标本的数量也被记录作为后续用途分配的参考。 请点击这里下载此文件。

为了验证样品收集程序，已经在下游应用中测试了每种样品类型。使用先前技术的修改¹² ，肿瘤和ANT已经成功地用于蛋白质和RNA分离，并且可以潜在地用于DNA分离。已经通过显微镜评估从组织切片建立的活的外植体，而存储的组织学载玻片已被用于免疫组织化学和免疫荧光。

通过遵循这里描述的方案，可以将该模型扩展到其他皮肤科诊所，其他肿瘤类型（如黑素瘤），以及其他外科专业和实践，为人类癌症的多方面研究提供人体组织样本。对于其他实践，可能需要对该协议进行轻微的修改，但原则上该协议适用于常规地丢弃患者治疗过程中收集的患者样本的任何外科手术。

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研究方案

所有对人体组织样品的实验均经Western IRB（WIRB Protocol＃20142461）批准。用于这些程序的组织收集的单一标准是SCC的活检证实的诊断。原始IRB方案中没有概述排除标准，但未使用已知血源性传染病患者的样本。在收集皮肤组织，血液和唾液之前获得知情同意书。中西部机构审查委员会批准了在西西里大学（AZ＃807）的基于临床的生物样品样品的验证工作。

皮肤肿瘤组织加工

注意:这是由莫氏组织技术专家执行的。

1. 新鲜鳞状细胞癌（SCC）组织RNA和外植体培养的加工
   1. 组织被Mohs外科医生切除后，收获10至50毫克（≥10毫米^3） ）组织样品从松弛期间的组织顶端侧的中心（这是操纵组织以允许其平放在载玻片上的过程）。
      注意:仅当肿瘤足够大以允许在组织学评估之前移除10-50 mg大小的样品（≥10mm ² ），这是Mohs手术的一部分，才有可能。如果肿瘤不够大以至少要移除2mm ³ ，则不要进行RNA的处理（跳过步骤5）。
   2. 使用镊子将活组织转移到含有培养基（DMEM:Ham's F-12,25mM HEPES，100IU / mL的青霉素和100μg/ mL链霉素的1:1混合物）的标记的1.5mL管中，并确保组织完全浸没在培养基中。将此管存放在4°C，然后再进行加工。
   3. 使用组织进行RNA分离和表达分析（见步骤5）和/或建立在24小时内进行外植体培养（见步骤6）。
   4. 将从患者中取出的肿瘤样品的剩余部分（步骤1.1.1）放置在低温恒温器组织支架（或"卡盘"）上。将组织嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，冷冻保持器内的组织，以允许完成莫氏组织学和制备用于实验分析的另外的组织学载玻片。
2. 组织学幻灯片的制备
   1. 使用低温恒温器切割7μm厚的组织切片，并为每个肿瘤样品创建两个（或更多）个载玻片。确保每个幻灯片最多包含完整肿瘤的三个部分。
      注意:两个幻灯片中的一个将被Mohs组织技术学家用H＆E染色，另外的幻灯片可以用IF，IHC或FISH分析进行处理。
   2. 将载玻片放入丙酮中1-2s以固定组织。将这些幻灯片放在一边干燥。不要H＆E染色或盖玻片以用于将来的免疫荧光（IF），免疫组织化学（IHC）或荧光原位杂交（FISH）分析，这取决于实验方案。
3. 后Mohs组织的处理
   1. 一旦Mohs处理完成（步骤1.1-1.2），在低温恒温室中工作，并从低温包埋介质中撬起样品并将组织置于标记的低温管中。
   2. 在组织解冻之前，将标记的小瓶置于液氮中。如果将样品用于蛋白质和/或DNA分析，则可将其转移到液氮或-80℃冰箱中，以便将来储存以用于将来的蛋白质表达和DNA突变分析（参见步骤4-5） 。
      注意:如果从Mohs后期样品中需要完整的RNA，则必须在将样品从冷冻包埋介质中取出时保持冷冻。如果不行使极端的照顾此步骤后Mohs样品应保留用于蛋白质和/或DNA分析。
4. 新鲜ANT的加工
   1. 在Mohs关闭时，从Mohs外科医生那里获得ANT。
   2. 从正常组织的顶端取出从SCC样品（见上文）收获的等量或更大量的ANT，并将其转移到含有培养基（1:1混合DMEM:Ham's F- 12，补充有25mM HEPES，100IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素）。
   3. 将组织完全浸入同一培养基中并在4℃下储存，直到后续处理（见步骤4-6）。

血液，唾液和颊拭子加工

1. 通过静脉穿刺在EDTA收集管中获得约10 mL的血液。
2. 将血液从收集管转移到无菌的15或50 mL离心管中。将大约200μL去除在1.5 mL低温管中，避免气泡;将这种全血样品储存在-80°C，如有必要可用于将来的基因分型和组织匹配。
   1. 将剩余血液以1,000xg旋转30分钟，并按照标准程序收集血浆级分。
   2. 在1.5 mL低温管中将等离子体等分为1 mL增量，并储存于-80°C，以备将来进行液体活检分析。
3. 使用无菌拭子获得颊拭子样品，并将拭子在室温下储存在无菌管中。
4. 如果需要，获得唾液样品，并在室温下储存在无菌管中。
   注意:如有必要，这些样品可用于将来的基因分型和组织匹配。

3.记录样品

1. 将患者样本清单中的信息转移到生物参考数据库。包括患者信息和诊断nosis从病人图。
2. 使用每个样品的条形码打印标签，并将数据记录在数据库中，以将每个收集的样本与患者数据相链接。
3. 在将样品转移到研究实验室之前，记录未确定样品在生物数据库中的分布情况。

蛋白质分离和蛋白质印迹分析

1. 将每个组织样品（SCC和/或ANT）放入含有每毫升组织含有蛋白酶抑制剂的500μL细胞裂解缓冲液的小瓶中以裂解组织。
   注意:我们使用由50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，1.0％NP-40和0.1％SDS组成的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液。可以使用其它细胞裂解缓冲液。
2. 使用组织匀浆器在4℃以20秒间隔使组织匀化5分钟。将样品在21,000 xg和4℃下旋转20分钟，并将含有蛋白质的上清液收集到新鲜的tu中是。使用相同的条件重新旋转上清液，并将最终的上清液收集到新鲜管中。
3. 使用4-20％SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶从每个样品中电泳30-50μg蛋白质。如果需要，用考马斯蓝染色凝胶以显现蛋白条带。
4. 如果需要蛋白质印迹分析表达的蛋白质，按照标准方案将蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。转移后，如果需要，Ponceau染色PVDF膜以显现蛋白条带。
5. 阻止PVDF膜和探针以按照标准方案检测目标蛋白质。按照制造商推荐的蛋白质印迹分析的浓度，使用对所关注的蛋白质特异性的一级抗体以及对于一级抗体特异的相应的二级抗体。
6. 使用化学发光底物暴露探测膜，并使用图像对膜进行成像ng系统。

RNA分离和定量聚合酶链反应（qPCR）

1. 立即将新鲜的组织样本（SCC和/或ANT）放入含有RNA稳定溶液的1.5mL管中，并将Mohs组织样品放入含有冷冻组织转换溶液的1.5mL管中，按照制造商的建议。确保组织完全浸没。将这些样品储存在-80°C直到使用。
2. 从-80°C取出RNA样品，并在冰上解冻。将组织转移到每50-100mg组织中含有1mL RNA提取缓冲液（苯酚/硫氰酸胍）的1.5mL管中。
3. 使用组织匀浆器裂开组织。进行六个循环的均质化，然后进行一段时间的样品冷却;每个循环由4℃均匀化和40s冷却期20s组成。均化后，在室温下孵育样品5分钟。
4. 加0.2mL氯仿/ 1mL RNA提取缓冲液，用手剧烈摇动管15秒。在室温下孵育2-3分钟。
5. 在12,000 xg和4℃下旋转样品15分钟。取出样品的水相并将其放入新的1.5 mL管中。
6. 每1mL步骤5.2中使用的RNA提取缓冲液加入0.5mL 100％异丙醇至水相，并在室温下孵育10分钟。
   注意:如果RNA产量预计为低（ 即起始组织体积小于10毫克），样品可能会在-80℃下沉淀过夜。另外，在异丙醇沉淀步骤期间，可以加入每500μLRNA提取缓冲液中5μg无RNA酶的糖原，以提高RNA产量。
7. 在4℃下以12,000xg旋转样品10分钟。取出上清液，用1 mL 75％乙醇洗涤沉淀。
8. 短暂旋转样品，然后以7,500 xg和4°旋转C 5分钟弃去洗涤物并将其干燥5-10分钟。
9. 将RNA沉淀重悬于20μL无RNase的水中。
   1. 如果需要，按照制造商的建议，使用RNA清洁试剂盒纯化每个RNA样品。
      注意:如果执行此步骤，小RNA将从样品中丢失。
10. 使用1.2％甲醛-MPS琼脂糖凝胶电泳1μg样品以分析RNA的质量。
    注意:作为替代方案，使用生物分析仪分析样品以获得RIN编号¹³ 。
11. 使用反转录方案将RNA逆转录为cDNA，以便对感兴趣的靶mRNA（或miRNA）进行qPCR分析。

6.组织外植体培养

1. 在将组织浸入70％乙醇中之前，将培养前的组织进行灭菌。
2. 将组织放在载玻片或碟上，加入足够的培养基（DMEM:Ham＆＃39; s F-12，补充有10％FBS，25mM HEPES，100IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素）以覆盖组织（以防止组织干燥）。使用解剖刀刀片小心地将组织切成碎片（<1 mm ³ ）。
3. 将组织碎片转移到35mm组织培养皿中，并在每个片段的顶部加入约20μL胎牛血清（FBS）。
4. 将培养皿放在培养罩中20-30分钟，或直到几乎干燥。
5. 向每个培养皿中加入1mL培养基（1:1混合DMEM:Ham's F-12，补充有10％FBS，25mM HEPES，100IU / mL青霉素和100μg/ mL链霉素），并在37℃下孵育C在5％CO _2中 。如果需要，进行亚文化或亚克隆培养。

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结果

肿瘤和ANT已经成功地用于蛋白质分离，并通过Western印迹进行测试。 如图3所示 ，可以在收集并存储在我们基于临床的生物反应器中的患者样品中检测到皮肤鳞状细胞癌标志物（Muc1 ¹⁴ ，FHL- ¹¹⁵和p40 ^16,17 ）。

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讨论

据笔者了解，该协议是首例以成本效益和速度快的方式重点关注皮肤组织样本的临床采购。经历莫氏显微外科手术的患者通常在特定的时间段内安排，收集限于这些时期。样本收集涉及病人护理中涉及的医疗助理，处理肿瘤样本的莫氏组织学技术人员以及处理样品进入和血液处理的指定实验室工作人员的努力。

收集队的三名成员（ 即医疗助理，莫斯组织技术员和实验?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3