Создание клиники на основе биоресурсов

Резюме

Кожные опухоли часто отбрасываются после микрографической хирургии Мооса. Здесь описывается протокол, который позволяет персоналу клинической поддержки эффективно обрабатывать и хранить образцы кожного новообразования ( например, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак и меланома) для последующих лабораторных исследований без вмешательства в клинические операции.

Аннотация

За последние несколько лет заболеваемость раком кожи ( например, плоскоклеточный рак, базально-клеточная карцинома и меланома) увеличивается. Ожидается, что параллельно будет спрос на образцы кожного новообразования для биомедицинских исследований. Однако доступность тканей ограничена из-за стоимости создания биоресурсов и отсутствия протоколов, доступных для получения клинических образцов, которые не влияют на клинические операции. Был установлен протокол для сбора и обработки кожных опухолей и связанных с ними проб крови и слюны, которые оказывают минимальное влияние на обычные клинические процедуры в день операции Мооса. Образцы опухолей собираются и обрабатываются у пациентов, перенесших первый слой хирургической операции Мооса для биопсии, подтвержденной кожными злокачественными новообразованиями гистонолога Мооса. Прилегающая нормальная ткань собирается во время хирургического закрытия. Дополнительные образцы, которые могут быть собраны, - цельная кровь и щечные тампоны, Используя образцы ткани, которые обычно отбрасываются, был создан биоресурс, который предлагает несколько ключевых преимуществ, основываясь на клинике и лабораторных условиях. Они включают в себя широкий спектр собранных образцов; Доступ к дефинированным записям пациентов, включая отчеты о патологии; И для типичного донора - доступ к дополнительным выборкам во время последующих визитов.

Введение

Исследования рака и биомаркеров основаны на поставке качественных образцов тканей человека, а ограниченное предложение затрудняет исследования ^{1 , 2} . Многие дерматологические исследования ограничены недостаточным предложением, изменчивым качеством и затратами, связанными с использованием тканей человека. Стоимость создания крупного специализированного биобанка оценивается примерно в 2 миллиона долларов ³ , и эти затраты ставят использование человеческих тканей недоступным для многих исследователей. Кроме того, процесс создания и хранения исследовательских образцов создает риск влияния на клинические операции и откладывание ухода за пациентом, если его не выполнить тщательно. Создан рентабельный, основанный на клиниках биоресурс, который фокусируется на образцах рака кожи, следуя рекомендуемым передовым методам и валидации образцов ^{4 , 5 , 6} .

7 ^{, 8} .

Цель техники микрографической хирургии Мооса заключается в том, чтобы удалить всю раковую ткань, сохраняя при этом как можно больше здоровых тканей. Процедура включает постепенное удаление тонких слоев опухолевой ткани. Каждый последующий слой - его(После криосекции опухолевой ткани и проведения окрашивания H & E) дерматологом, чтобы определить, была ли удалена вся раковая ткань. Иссечение и исследование последующих слоев тканей выполняется, пока пациент остается в кабинете. Этот метод считается лучшим вариантом лечения для SCC ⁹ . В этот момент рана закрывается, и для улучшения исцеления и косметического эффекта часто вырезается смежная нормальная ткань (ANT). Таким образом, эта хирургическая процедура для удаления опухоли идеально подходит для сбора гистологически охарактеризованной ткани для будущих исследований.

Процедура закупок для получения опухолевой ткани, смежных нормальных тканей, слюны и образцов крови была разработана для минимального воздействия на обычные обязанности персонала ( рисунок 1 ). Медицинские помощники выполняют анализ крови при подготовке пациента к процедуре. После завершения процедуры Мооса M Ohs histotechnologist готовит дополнительные гистологические слайды образца и переносит ткань в биоресурсор. Затраты, связанные с созданием биоресурсов, включают покупку морозильных камер для морозильной камеры, создание скромного клинического лабораторного пространства и разработку программы отслеживания запасов.

Рисунок 1: Последовательность сбора проб и ответственный персонал. После регистрации пациента и достижения согласия пациента медицинский ассистент собирает трансбуккальный тампон и выполняет забор крови. Дерматолог и медицинский ассистент затем вырезают опухоль и закрывают рану, в течение которой собирают образцы SCC и ANT, соответственно. Специализированный лаборант обрабатывает кровь и разделы SCC и ANT образцов для культуры тканей, сохранения и входа в биоресурсы.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Разнообразие собранных проб позволяет использовать различные экспериментальные подходы ( рис. 2 ). Образцами, собранными у пациента, являются щечные тампоны (слюна также может быть собрана при необходимости), цельная кровь и иссеченная ткань. Буккальные тампоны и образец из цельной крови сохраняются без обработки для генотипирования и подбора тканей. Цельная кровь разделяется на лейкоциты (WBC) и фракции плазмы для будущих анализов. После обработки Мооса замороженную опухоль помещают непосредственно в жидкий азот и переносят в морозильник -80 ° C. Свежую, жизнеспособную опухолевую ткань и образцы ANT культивируют с использованием модификаций предыдущих методик ^{10 , 11} и затем замораживают. Во время сбора данных количество каждого типа выборки записывается в электронную таблицу до Программа отслеживания запасов для упрощения точной обработки ( таблица 1 ).

Рисунок 2: Схема сбора и обработки проб биоресурсов на базе клиник. Буккальный мазок и образец крови собираются у пациента и хранятся для последующего генотипирования и тканевого соответствия. Цельная кровь дополнительно обрабатывается для выделения белых кровяных клеток (WBC) и анализа CTC, а также для сбора плазмы и анализа жидкой биопсии. Ткань, вырезанная во время процедуры Мооса, гистологически обрабатывается в диагностических целях, после чего гистологические слайды могут быть использованы экспериментально для дальнейших иммуногистохимических анализов. При условии, что образец иссеченной ткани достаточно велик, часть свежей ткани удаляют и секционируют для выделения белков и РНК и для установления культивируемых клеточных линий.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дата сбора:
	Пациент 1	Пациент 2	Пациент 3	Пациент 4	Пациент 5
Инициалы и дата рождения
Цвет глаз
Тип образца
Пример местоположения
слюна
WДыра в крови
плазма
Опухоль жизнеспособна
Ткань нормальная жизнеспособная
Жидкий азот опухоли Мооса
Ткань Нормальный жидкий азот
Слайды

Таблица 1: Контрольный список для записи выборочных наборов. Данные, отслеживаемые и регистрируемые с каждым собранным образцом, включают инициалы пациентов, дату рождения и цвет глаз (для опечатывания кожи), а также локатиНа удаление образца. Количество образцов слюны, объемы сбора крови и количество собранных жизнеспособных и консервированных образцов тканей также записываются в качестве ссылок для распределения для последующего использования. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Чтобы проверить процедуры сбора образцов, каждый тип образца был протестирован в последующих приложениях. Используя модификации предыдущих методик ¹² , опухоль и ANT успешно используются в изоляции белков и РНК и могут потенциально использоваться для выделения ДНК. Жизнеспособные экспланты, созданные из срезов тканей, были оценены с помощью микроскопии, тогда как сохраненные гистологические слайды использовались для иммуногистохимии и иммунофлюоресценции.

Следуя описанному здесь протоколу, можно распространить эту модель на другие дерматологические клиники, другие типы опухолей (такие как меланома), И другие хирургические специальности и практики для обеспечения образцов человеческой ткани для многогранных исследований рака человека. Небольшие модификации этого протокола, вероятно, будут необходимы для других практик, но в принципе этот протокол применим к любой хирургической практике, которая рутинно отбирает образцы пациентов, собранные в ходе лечения пациента.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на образцах тканей человека были одобрены Western IRB (WIRB Protocol # 20142461). Единственным критерием для сбора тканей для этих процедур является проверенный биопсией диагноз ГТК. В оригинальном протоколе IRB не было указано никаких критериев исключения, но образцы от пациентов с известным передаваемым кровью инфекционным заболеванием не использовались. Информированное согласие было получено до сбора кожных тканей, крови и слюны. Совет по обзору институтов в Среднем Западе одобрил работу по валидации с образцами биоресурсов на базе клиник в Университете Среднего Запада (AZ # 807).

1. Кожная обработка опухолевой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно быть выполнено гистонологом Мооса.

1. Обработка тканевой карциномы свежей плоской клетки (SCC) для РНК и эксплантированной культуры
   1. После того, как ткань была вырезана хирургом Мооса, собрать 10-50 мг (≥10 мм ³ ) Образец ткани от центра апикальной стороны ткани во время релаксации (которая является процессом манипулирования тканью, чтобы позволить ей лежать на слайде) перед дополнительной обработкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это возможно только в том случае, если опухоль достаточно большая, чтобы можно было удалить образец размером 10-50 мг (≥10 мм ² ) до проведения гистологической оценки, что является частью процедуры Mohs. Если опухоль не достаточно велика, чтобы можно было удалить как минимум 2 мм ³ , не начинайте обработку для РНК (пропустите шаг 5).
   2. Перенесите жизнеспособную ткань в пробирку с 1,5 мл метки, содержащую культуральную среду (смесь 1: 1 DMEM: F-12 Ham, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) с помощью пинцета и убедитесь, что Ткань полностью погружена в среду. Перед дополнительной обработкой храните эту пробирку при температуре 4 ° C.
   3. Используйте ткань для выделения и анализа экспрессии РНК (см. Шаг 5) и / или установкиКультивирования эксплантов (см. Шаг 6) в течение 24 часов.
   4. Поместите остальную часть образца опухоли, который был удален у пациента (шаг 1.1.1), на держателе ткани криостата (или «патроне»). Вставьте ткань в соединение оптимальной температуры резания (OCT), замораживая ткань внутри держателя, чтобы обеспечить завершение гистологии Мооса и для подготовки дополнительных гистологических слайдов для экспериментального анализа.
2. Подготовка гистологических препаратов
   1. Отрежьте срезы ткани толщиной 7 мкм с использованием криостата и создайте два (или более) слайда для каждого образца опухоли. Убедитесь, что каждый слайд содержит до трех разделов полной опухоли.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Один из двух слайдов будет окрашен с помощью H & E гистонологом Mohs, а дополнительный слайд (ы) можно обработать с помощью анализа IF, IHC или FISH.
   2. Поместите слайды в ацетон на 1-2 с для фиксации ткани. Установите эти слайды в сторону для просушки. Не H & EПятна или покровное стекло для использования в будущих иммунофлюоресценции (IF), иммуногистохимия (IHC) или флуоресцентный анализ in situ гибридизации (FISH), в зависимости от экспериментального протокола.
3. Обработка ткани пост-Мооса
   1. Как только обработка Мооса будет завершена (шаги 1.1-1.2), работайте в камере криостата и вытащите образец из среды для впитывания криогенных веществ и поместите ткань в промаркированную криогенную трубку.
   2. Помещенный маркированный флакон в жидком азоте прежде, чем ткань оттаяла. Если образцы должны использоваться для анализа белка и / или ДНК, они могут быть перенесены в жидкий азот или замораживатель -80 ° С в течение нескольких минут для хранения для будущей экспрессии белка и анализа мутации ДНК (см. Шаги 4-5) ,
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если от образца после Мооса требуется интактная РНК, важно сохранить образец замороженным во время удаления из среды для криосадочного впитывания. Если чрезмерная забота неНа этом этапе образец после Мооса следует зарезервировать для анализа белка и / или ДНК.
4. Переработка свежего ANT
   1. Во время закрытия Мооса, получите АНТ от хирурга Мооса.
   2. Удалите равное или большее количество ANT, как было собрано из образца SCC (см. Выше), с апикальной стороны нормальной ткани и перенесите его в пробирку с 1,5 мл метки, содержащую культуральную среду (смесь DMEM: F- 12 с добавлением 25 мМ HEPES, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) с использованием пинцета.
   3. Полностью погрузить ткань в ту же культуральную среду и хранить при 4 ° С до последующей обработки (см. Шаги 4-6).

2. Кровь, слюна и буккальная обработка мазка

1. Получают приблизительно 10 мл крови в пробирках для сбора ЭДТА через венопунктуру.
2. Перенесите кровь из приемных трубок в стерильную 15- или 50 мл центрифужную пробирку, Удалить около 200 мкл в 1,5 мл криогенной трубки, избегая пузырей; Храните этот образец цельной крови при -80 ° C, который будет использоваться для будущего генотипирования и тканевого соответствия, если это необходимо.
   1. Вращайте оставшуюся кровь при 1000 мкг в течение 30 мин и следуйте стандартным процедурам для сбора фракции плазмы.
   2. Алиготе плазмы в 1 мл приращения в 1,5 мл криогенных труб и хранить при температуре -80 ° C для использования во время будущих анализов жидкой биопсии.
3. Используйте стерильный тампон, чтобы получить образец щечного тампона, и храните тампон в стерильной пробирке при комнатной температуре.
4. Если необходимо, возьмите пробу слюны и храните в стерильной пробирке при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти образцы могут быть использованы для будущего генотипирования и тканевого соответствия, если это необходимо.

3. Ведение документации образцов

1. Передайте информацию из контрольного перечня образцов пациентов в базу данных биоресурсов. Включить информацию о пациенте и диагнозНос из таблицы пациентов.
2. Напечатайте этикетки со штрих-кодом для каждого образца и запишите каждую в базу данных, чтобы связать каждый собранный образец с данными пациента.
3. Запишите распределение неидентифицированных образцов в базе данных биоресурсов до передачи образцов в исследовательскую лабораторию.

4. Выделение белка и анализ вестерн-блоттинга

1. Поместите каждый образец ткани (SCC и / или ANT) в пробирку, содержащую 500 мкл буфера для лизиса клеток, содержащего ингибиторы протеазы на 100 мг ткани для лизиса ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Мы использовали буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), состоящий из 50 мМ Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5% дезоксихолата натрия, 1,0% NP-40 и 0,1% SDS. Могут использоваться другие буферы для лизиса клеток.
2. Гомогенизируйте ткани с использованием тканевого гомогенизатора в течение 5 мин с интервалом 20 с при 4 ° С. Спиновые образцы при 21000 xg и 4 ° C в течение 20 минут и собирают супернатант, содержащий белок, в свежеебыть. Повторно открутите супернатант, используя те же условия, и соберите конечный супернатант в свежую пробирку.
3. Электрофорез 30-50 мкг белка из каждого образца с использованием 4-20% SDS-полиакриламидного градиентного геля. При необходимости окрасьте гель с помощью Coomassie Blue, чтобы визуализировать полосы белка.
4. Если необходим вестерн-блот анализ экспрессированных белков, перенесите белки из геля в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF), следуя стандартным протоколам. После переноса Ponceau окрашивает PVDF мембрану для визуализации белковых полос, если это необходимо.
5. Заблокируйте PVDF-мембрану и зонд, чтобы обнаружить интересующие белки согласно стандартным протоколам. Используйте первичные антитела, специфичные к интересующему белку (белкам), наряду с соответствующими вторичными антителами, специфичными к первичным антителам, в концентрациях, рекомендованных производителем для вестерн-блот-анализа.
6. Выявление зондированной мембраны с использованием хемилюминесцентной подложки и изображение мембраны с использованием imagiНг системы.

5. Выделение РНК и количественная полимеразная цепная реакция (qPCR)

1. Сразу же поместите свежие образцы тканей (SCC и / или ANT) в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую раствор для стабилизации РНК, и поместите образцы ткани после Мооса в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую раствор для замороженных тканей, в соответствии с рекомендациями производителя. Убедитесь, что ткань полностью погружена. Храните эти образцы при температуре -80 ° C до использования.
2. Удалить образцы РНК от -80 ° C и разморозить на льду. Перенесите ткань в новую пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл буфера для экстракции РНК (фенол / гуанидинтиоцианат) на 50-100 мг ткани.
3. Lyse тканей с использованием тканевого гомогенизатора. Выполните шесть циклов гомогенизации с последующим периодом охлаждения образца; Каждый цикл состоит из 20 с гомогенизации при 4 ° C и 40 секунд охлаждения. После гомогенизации инкубируйте образец в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Добавить 0,2Мл хлороформа на 1 мл буфера для экстракции РНК и энергично встряхивают пробирку вручную в течение 15 с. Инкубируйте в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
5. Отжимайте образцы при 12000 xg и 4 ° C в течение 15 минут. Удалите водную фазу образца и поместите ее в новую 1,5 мл пробирку.
6. Добавить 0,5 мл 100% изопропанола на 1 мл буфера для экстракции РНК, используемого на стадии 5.2, в водную фазу и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Если ожидается, что выход РНК будет низким ( т.е. начальный объем ткани меньше 10 мг), образцы могут осаждаться в течение ночи при -80 ° C. Кроме того, на этапе осаждения изопропанола можно добавить 5 мкг гликогена без РНКазы на 500 мкл буфера для экстракции РНК для улучшения выхода РНК.
7. Отжимайте образец при 12000 xg при 4 ° C в течение 10 минут. Удалить надосадочную жидкость и промыть гранулы 1 мл 75% этанола.
8. Медленно встряхните образец и затем поверните его на 7500 xg и 4 °С в течение 5 мин. Отменить промывку и высушить на воздухе в течение 5-10 мин.
9. Ресуспендируют гранулу РНК в 20 мкл воды, свободной от РНКазы.
   1. Если необходимо, очистите каждый образец РНК с помощью набора для очистки РНК, следуя рекомендациям изготовителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Малые РНК будут потеряны из образца, если этот шаг будет выполнен.
10. Электрофорез в 1 мкг образца с использованием 1,2% формальдегида-MOPS агарозного геля для анализа качества РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, анализируйте образцы, используя биоанализатор, чтобы получить RIN номер ¹³ .
11. Обратный транскрипт РНК кДНК с использованием протокола обратной транскрипции для qPCR-анализа интересующих мишеней мРНК (или miRNAs).

6. Тканевые культуры эксплантатов

1. Стерилизовать иссеченную ткань до культивирования путем погружения ткани в 70% этанола.
2. Поместите ткань на предметное стекло или блюдо и добавьте достаточное количество питательной среды (смесь 1: 1 DMEM: Ham & #39; s F-12 с добавлением 10% FBS, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) для покрытия ткани (для предотвращения высыхания ткани). Тщательно разрежьте ткань на фрагменты (<1 мм ³ ), используя лезвие скальпеля.
3. Передайте фрагменты ткани в 35-миллиметровую чашку для культуры ткани и добавьте приблизительно 20 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) поверх каждого фрагмента.
4. Оставьте блюдо открытым в капот культуры в течение 20-30 минут, или до почти сухой.
5. Добавить 1 мл культуральной среды (смесь 1: 1 DMEM: F-12 Ham с добавлением 10% FBS, 25 мМ HEPES, 100 IU / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) в каждую чашку и инкубировать при 37 ° C в 5% CO ₂ . Субкультура или субклонировать культуры, если это необходимо.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Опухоль и ANT успешно использовались в изоляции белка и тестировались с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на рисунке 3 , маркеры кожной чешуйчатой ​​плоскоклеточной карциномы (Muc1 ¹⁴ , FHL-1 ¹⁵ и p40 ^{16 , 17} ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Насколько известно автору, этот протокол является первым в своем роде, который фокусируется на клинических закупках образцов кожных тканей как с точки зрения затрат, так и с быстрым подходом. Пациенты, проходящие микрохирургию Мооса, как правило, назначаются в определенные периоды вре...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3