Estabelecimento de um Biorepository baseado em Clínica

Resumo

Os tumores cutâneos são frequentemente descartados após a cirurgia micrográfica de Mohs. Descreve-se aqui um protocolo que permite que a equipe de suporte clínico processe e armazene eficazmente amostras de tumores cutâneos ( por exemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular e melanoma) para aplicações laboratoriais a jusante sem interferir com as operações clínicas.

Resumo

A incidência de cancro da pele ( por exemplo, carcinoma epidermóide, carcinoma basocelular e melanoma) tem vindo a aumentar nos últimos anos. Espera-se que haja uma demanda paralela de amostras tumorais cutâneas para estudos de pesquisa biomédica. A disponibilidade de tecidos, no entanto, é limitada devido ao custo de estabelecimento de um biorrepositório e à falta de protocolos disponíveis para a obtenção de amostras clínicas que não interfiram com as operações clínicas. Um protocolo foi estabelecido para coletar e processar tumores cutâneos e sangue associado e amostras de saliva que tem impacto mínimo em procedimentos clínicos de rotina na data de uma cirurgia de Mohs. As amostras de tumor são recolhidas e processadas a partir de pacientes submetidos à sua primeira camada de cirurgia de Mohs para neoplasias cutâneas comprovadas por biopsia pelo histotecnista de Mohs. O tecido normal adjacente é recolhido no momento do fecho cirúrgico. As amostras adicionais que podem ser coletadas são swabs de sangue total e bucal. Utilizando amostras de tecido que são normalmente descartadas, um biorrepositório foi gerado que oferece várias vantagens fundamentais por estar baseado na clínica versus o laboratório. Estes incluem uma vasta gama de amostras recolhidas; Acesso a registros de pacientes não identificados, incluindo relatórios de patologia; E, para o doador típico, o acesso a amostras adicionais durante as visitas de acompanhamento.

Introdução

A pesquisa com câncer e biomarcadores depende de uma oferta de amostras de tecido humano de qualidade, e a oferta limitada tem dificultado a pesquisa ^{1 , 2} . Muitos estudos dermatológicos são limitados pela oferta inadequada, qualidade variável e custos associados ao uso de tecido humano. O custo de estabelecer um grande biobank dedicado foi estimado em aproximadamente dois milhões de dólares ³ , e esses custos colocam o uso de tecido humano fora do alcance de muitos pesquisadores. Além disso, o processo de geração e armazenamento de amostras de pesquisa apresenta o risco de afetar as operações clínicas e retardar o atendimento ao paciente se não for executado cuidadosamente. Um biorepository custo-eficaz, clínico-baseado foi estabelecido que se centre em amostras do cancro da pele que seguem as mais melhores práticas recomendadas e a validação da amostra ^{4 , 5 , 6} .

7 ^{, 8} .

O objetivo da técnica de cirurgia micrográfica Mohs é garantir que todo o tecido do câncer é removido, preservando o máximo de tecido saudável possível. O procedimento envolve a remoção progressiva de camadas finas de tecido tumoral. Cada camada sucessiva é suaExaminado toxicologicamente (após criosecção do tecido tumoral e realização de coloração de H & E) por um dermatologista para determinar se todo o tecido de câncer foi removido. A excisão e exame de camadas subsequentes de tecidos é executado enquanto o paciente permanece no consultório. Esta técnica é considerada a melhor opção de tratamento para SCC ⁹ . Neste ponto, a ferida é fechada e, para melhorar a cicatrização e aparência cosmética, o tecido normal adjacente (ANT) é frequentemente excisado. Deste modo, este procedimento cirúrgico para remover um tumor é idealmente adequado para a recolha de tecido histologicamente caracterizado para futuros estudos.

O procedimento de aquisição para obtenção de tecido tumoral, tecidos normais adjacentes, saliva e amostras de sangue foi concebido para ter um impacto mínimo sobre as tarefas normais do pessoal ( Figura 1 ). Assistentes médicos realizar o sangue desenha durante a preparação do paciente para o procedimento. Após a conclusão do procedimento de Mohs, o M Ohs histotechnologist prepara slides histológicos adicionais do espécime e transfere o tecido para o biorepository. Os custos associados ao estabelecimento do biorrepositório incluem a compra de congeladores de criopreservação, a criação de modestos laboratórios clínicos e o desenvolvimento de um programa de rastreamento de inventário.

Figura 1: Seqüência de coleta de amostras e pessoal responsável. Após o check-in do paciente e a obtenção do consentimento do paciente, o assistente médico coleta um cotonete bucal e realiza uma extração de sangue. O dermatologista e assistente médico, em seguida, excise o tumor e fechar a ferida, durante o qual tempo SCC e ANT espécimes são coletados, respectivamente. Um técnico de laboratório dedicado processa o sangue e separa os espécimes de SCC e ANT para cultura de tecidos, preservação e entrada no biorepositório.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

A diversidade de amostras coletadas possibilita uma variedade de abordagens experimentais ( Figura 2 ). As amostras coletadas do paciente são cotonetes bucais (saliva também pode ser coletada se necessário), sangue total e tecido excisado. Os swabs bucais e uma amostra do sangue total são salvos, sem processamento, para genotipagem e correspondência de tecido. O sangue completo é separado em glóbulos brancos (WBC) e frações de plasma para futuras análises. Após o processamento de Mohs, o tumor congelado é colocado directamente em azoto líquido e transferido para um congelador a -80 ° C. As amostras de tecido de tumor fresco e viável e ANT são cultivadas utilizando modificações das técnicas anteriores ^{10 , 11} e depois criopreservadas. Durante a coleta, o número de cada tipo de amostra é registrado em uma planilha antes da O programa de rastreamento de inventário para facilitar o processamento preciso ( Tabela 1 ).

Figura 2: Esboço de coleta e processamento de amostras de biorrepositores baseados em clínicas. Um cotonete bucal e uma amostra de sangue são recolhidos do doente e armazenados para genotipagem a jusante e correspondência de tecido. O sangue total é processado para o isolamento de glóbulos brancos (WBC) e análise de CTC, bem como para a coleta de plasma e análise de biópsia líquida. O tecido excisado durante o procedimento de Mohs é processado histologicamente para fins de diagnóstico, após o que as lâminas histológicas podem ser usadas experimentalmente para análises imunoistoquímicas adicionais. Desde que a amostra de tecido excisada seja suficientemente grande, uma porção de tecido fresco é removida e seccionada para isolamento de proteína e ARN e para o estabelecimento de linhas de células cultivadas.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Data da coleta:
	Paciente 1	Paciente 2	Paciente 3	Paciente 4	Paciente 5
Iniciais e data de nascimento
Cor dos olhos
Tipo de amostra
Localização da amostra
Saliva
WSangue do buraco
Plasma
Tumor viável
Tecido Normal Viable
Tumor Mohs Nitrogênio Líquido
Tecido Nitrogênio Líquido Normal
Slides

Tabela 1: Lista de verificação para registro de coletas de amostras. Os dados registados e registados com cada amostra recolhida incluem iniciais do doente, data de nascimento e cor dos olhos (para a tipificação da pele), bem como a localizaçãoNa remoção da amostra. O número de amostras de saliva, volumes de coleta de sangue e o número de espécimes de tecido viáveis ​​e conservados coletados também são registrados como referências para alocações para usos posteriores. Clique aqui para baixar este arquivo.

Para validar procedimentos de recolha de amostras, cada tipo de amostra foi testado em aplicações a jusante. Utilizando modificações das técnicas anteriores ¹² , o tumor e a ANT foram utilizados com sucesso no isolamento de proteínas e ARN e podem potencialmente ser utilizados para o isolamento do ADN. Os explantes viáveis ​​estabelecidos a partir das secções de tecido foram avaliados por microscopia, enquanto as lâminas histológicas armazenadas foram utilizadas para imuno-histoquímica e imunofluorescência.

Seguindo o protocolo aqui descrito, é possível estender este modelo para outras clínicas de dermatologia, outros tipos de tumores (tais como melanoma), E outras especialidades cirúrgicas e práticas para fornecer amostras de tecido humano para a investigação multifacetada em cancros humanos. Podem ser necessárias ligeiras modificações deste protocolo para outras práticas, mas, em princípio, este protocolo é aplicável a qualquer prática cirúrgica que descarte rotineiramente amostras de pacientes recolhidas no decurso do tratamento do doente.

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Protocolo

Todas as experiências em amostras de tecido humano foram aprovadas pelo Western IRB (Protocolo WIRB # 20142461). O único critério para a coleta de tecidos para esses procedimentos é um diagnóstico de SCC comprovado por biópsia. Não foram descritos critérios de exclusão no protocolo IRB original, mas não foram utilizadas amostras de doentes com uma doença transmissível transmitida pelo sangue conhecida. O consentimento informado foi obtido antes da coleta de tecido cutâneo, sangue e saliva. O Midwestern Institutional Review Board aprovou o trabalho de validação com amostras de bio-depositário baseadas em clínicas na Midwestern University (AZ # 807).

1. Processamento de tecido tumoral cutâneo

NOTA: Isto deve ser realizado por um histotechnologist de Mohs.

1. Processamento de tecido de carcinoma de células escamosas (SCC) fresco para ARN e cultura de explantes
   1. Após a excisão do tecido pelo cirurgião Mohs, colher uma dose de 10 a 50 mg (≥ 10 mm ³ ) Amostra de tecido a partir do centro do lado apical do tecido durante o relaxamento (que é o processo de manipulação do tecido para permitir que ele se deitar plana sobre o slide) antes de processamento adicional.
      NOTA: Isto só é possível se o tumor for suficientemente grande para permitir que uma amostra de 10-50 mg (≥ 10 mm ² ) seja removida antes da avaliação histológica, que é parte do procedimento de Mohs. Se o tumor não for suficientemente grande para permitir que um mínimo de 2 mm ³ seja removido, não prosseguir com o processamento de ARN (ignorar o passo 5).
   2. Transferir o tecido viável para um tubo de 1,5 mL marcado contendo meio de cultura (mistura 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham, HEPES 25 mM, 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) utilizando uma pinça e assegurar que a O tecido é completamente imerso no meio. Guarde este tubo a 4 ° C antes do processamento adicional.
   3. Use o tecido para o isolamento e análise de expressão de ARN (ver etapa 5) e / ou oDe uma cultura de explante (ver etapa 6) em 24 h.
   4. Colocar o restante da amostra de tumor que foi removida do doente (passo 1.1.1) num suporte de tecido de criostato (ou "mandril"). Incorporar o tecido em um composto de temperatura de corte ótima (OCT), congelar o tecido dentro do suporte, para permitir a conclusão da histologia de Mohs e para a preparação de lâminas histológicas adicionais para análise experimental.
2. Preparação de lâminas histológicas
   1. Cortar cortes de tecido de 7 μm de espessura usando um criostato e criar duas (ou mais) lâminas para cada amostra de tumor. Certifique-se de que cada lâmina contém até três seções do tumor completo.
      NOTA: Uma das duas lâminas será corada usando H & E pelo histotechnologist de Mohs, e as lâminas adicionais podem ser processadas com a análise IF, IHC ou FISH.
   2. Coloque os slides em acetona por 1-2 s para corrigir o tecido. Definir estes slides de lado para secar. Não faz H & EMancha ou lamela a lâmina para ser usado para a futura imunofluorescência (IF), imunohistoquímica (IHC), ou fluorescência hibridização in situ (FISH), dependendo do protocolo experimental.
3. Processamento de Tecidos Pós-Mohs
   1. Uma vez que o processamento de Mohs tenha sido completado (passos 1.1-1.2), trabalhe na câmara de criostato e retire a amostra do meio de incorporação de cryo e coloque o tecido num tubo criogénico marcado.
   2. Colocar o frasco marcado em azoto líquido antes de o tecido ter descongelado. Se as amostras forem usadas para análise de proteínas e / ou DNA, elas podem ser transferidas para nitrogênio líquido ou um congelador de -80 ° C dentro de alguns minutos para serem armazenadas para análise futura de expressão protéica e mutação de DNA (ver etapas 4-5) .
      NOTA: Se for desejado RNA intacto a partir da amostra de pós-Mohs, é essencial manter a amostra congelada durante a remoção do meio de incorporação de crio. Se cuidados extremos não foremNeste passo, a amostra pós-Mohs deve ser reservada para análise de proteínas e / ou ADN.
4. Processamento de ANT fresco
   1. No momento do encerramento Mohs, obter ANT do cirurgião Mohs.
   2. Remover uma quantidade igual ou maior de ANT tal como foi colhida a partir da amostra de SCC (ver acima) a partir do lado apical do tecido normal e transferi-la para um tubo de 1,5 ml marcado contendo meio de cultura (mistura 1: 1 de DMEM: Ham F- 12 suplementado com HEPES 25 mM, 100 UI / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) utilizando pinças.
   3. Imergir completamente o tecido no mesmo meio de cultura e armazenar a 4 ° C até processamento posterior (ver passos 4-6).

2. Processamento de sangue, saliva e compressa bucal

1. Obter aproximadamente 10 mL de sangue em tubos de coleta de EDTA por venipunção.
2. Transfira o sangue dos tubos de coleta para um tubo de centrífuga estéril de 15 ou 50 mL. Remover aproximadamente 200 μl em um tubo criogênico de 1,5 mL, evitando bolhas; Armazenar esta amostra de sangue total a -80 ° C, a ser utilizado para futura genotipagem e correspondência de tecidos, se necessário.
   1. Girar o sangue restante a 1.000 xg durante 30 min e seguir procedimentos padrão para coletar a fração de plasma.
   2. Alíquota o plasma em incrementos de 1 mL em tubos criogênicos de 1,5 mL e armazenar a -80 ° C para uso durante futuras análises de biópsia líquida.
3. Use um cotonete esterilizado para obter uma amostra de esfregaço bucal e armazene o esfregaço em um tubo estéril à temperatura ambiente.
4. Se necessário, obter uma amostra de saliva e armazenar em um tubo estéril à temperatura ambiente.
   NOTA: Estas amostras podem ser utilizadas para futura genotipagem e correspondência de tecidos, se necessário.

3. Manutenção de amostras

1. Transferir informações da lista de verificação de amostras de pacientes para o banco de dados do biorepository. Inclua informações do paciente e diagDo gráfico do paciente.
2. Imprima rótulos com um código de barras para cada amostra e registre cada um no banco de dados para vincular cada amostra coletada com os dados do paciente.
3. Registre a distribuição das amostras desidentificadas no banco de dados do depósito biológico antes de transferir as amostras para o laboratório de pesquisa.

4. Isolamento de Proteínas e Análise de Western Blot

1. Colocar cada amostra de tecido (SCC e / ou ANT) num frasco contendo 500 μL de tampão de lise celular contendo inibidores de protease por 100 mg de tecido para lisar o tecido.
   NOTA: Utilizou-se um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA), composto por 50 mM de Tris a pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1,0% de NP-40 e 0,1% de SDS. Podem ser utilizados outros tampões de lise celular.
2. Homogeneizar os tecidos utilizando um homogeneizador de tecidos durante 5 min em intervalos de 20 s a 4 ° C. Girar as amostras a 21.000 xg e 4 ° C durante 20 min e recolher o sobrenadante contendo proteína em um fresco tuestar. Re-spin o sobrenadante usando as mesmas condições e coletar o sobrenadante final em um tubo fresco.
3. Electrophorese 30-50 μ g de proteína de cada amostra usando um 4-20% SDS-polyacrylamide gradiente gel. Mancha o gel com Coomassie Blue para visualizar bandas de proteína, se desejado.
4. Se for necessária a análise Western blot das proteínas expressas, transferir as proteínas do gel para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) seguindo protocolos padrão. Após a transferência, Ponceau mancha a membrana de PVDF para visualizar bandas de proteína, se desejado.
5. Bloquear a membrana PVDF e sonda para detectar proteínas de interesse seguindo protocolos padrão. Utilizar anticorpos primários específicos para a (s) proteína (s) de interesse, juntamente com os anticorpos secundários correspondentes específicos para os anticorpos primários, em concentrações recomendadas pelo fabricante para análise de Western blot.
6. Exposição da membrana sondada usando um substrato quimioluminescente e imagem da membrana usando um imagiNg.

5. Isolamento de ARN e Reacção em Cadeia de Polimerase Quantitativa (qPCR)

1. Colocar imediatamente amostras de tecido fresco (SCC e / ou ANT) num tubo de 1,5 mL contendo uma solução de estabilização de ARN e colocar as amostras de tecido de Mohs num tubo de 1,5 mL contendo uma solução de transição de tecido congelado, seguindo as recomendações do fabricante. Certifique-se de que o tecido está completamente imerso. Guarde estas amostras a -80 ° C até à sua utilização.
2. Remover as amostras de ARN de -80 ° C e descongelar em gelo. Transferir o tecido para um novo tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de tampão de extração de ARN (fenol / tiocianato de guanidina) por 50-100 mg de tecido.
3. Lyse os tecidos usando um homogeneizador de tecidos. Realizar seis ciclos de homogeneização, seguidos de um período de arrefecimento da amostra; Cada ciclo consiste em 20 s de homogeneização a 4 ° C e um período de arrefecimento de 40 s. Após homogeneização, incubar a amostra durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Adicionar 0,2Ml de clorofórmio por 1 mL de tampão de extração de ARN e agitar vigorosamente o tubo à mão durante 15 s. Incubar durante 2-3 minutos à temperatura ambiente.
5. Girar as amostras a 12.000 xg e 4 ° C durante 15 min. Remover a fase aquosa da amostra e colocá-la em um novo tubo de 1,5 mL.
6. Adicionar 0,5 mL de isopropanol a 100% por 1 mL do tampão de extracção de ARN utilizado no passo 5.2 à fase aquosa e incubar durante 10 min à temperatura ambiente.
   NOTA: Se se prevê que os rendimentos de ARN sejam baixos ( isto é, o volume de tecido inicial é inferior a 10 mg), as amostras podem ser precipitadas durante a noite a -80 ° C. Adicionalmente, podem adicionar-se 5 μg de glicogénio isento de RNase por 500 μL de tampão de extracção de ARN durante o passo de precipitação com isopropanol para melhorar os rendimentos de ARN.
7. Girar a amostra a 12 000 xg a 4 ° C durante 10 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 75%.
8. Vortex a amostra brevemente e, em seguida, girá-lo em 7.500 xg e 4 °C durante 5 min. Descartar a lavagem e secar ao ar o sedimento por 5-10 min.
9. Ressuspender o sedimento de ARN em 20 μL de água isenta de RNase.
   1. Se desejado, purifique cada amostra de ARN utilizando um kit de limpeza de RNA seguindo as recomendações do fabricante.
      NOTA: RNAs pequenos serão perdidos da amostra se esta etapa é executada.
10. Eletroforese uma amostra de 1 μg usando um gel de agarose MOPS de formaldeído a 1,2% para analisar a qualidade do RNA.
    NOTA: Como alternativa, analise as amostras utilizando um bioanalisador para obter um número RIN ¹³ .
11. Reverse-transcrever o RNA para cDNA usando um protocolo de transcrição reversa para qPCR análise de mRNAs alvo (ou miRNAs) de interesse.

6. Culturas de explantes de tecidos

1. Esterilizar o tecido excisado antes da cultura por imersão do tecido em etanol a 70%.
2. Coloque o tecido em uma lâmina ou prato e adicione meio de cultura suficiente (mistura 1: 1 de DMEM: Ham & #39; s F-12 suplementado com 10% de FBS, 25 mM de HEPES, 100 UI / mL de penicilina e 100 ug / mL de estreptomicina) para cobrir o tecido (para evitar que o tecido seque). Cuidadosamente cortar o tecido em fragmentos (<1 mm ³ ) usando uma lâmina de bisturi.
3. Transferir os fragmentos de tecido para um prato de cultura de tecido de 35 mm e adicionar aproximadamente 20 μL de soro bovino fetal (FBS) por cima de cada fragmento.
4. Deixe o prato aberto em um capuz de cultura por 20-30 min, ou até quase seco.
5. Adicionar 1 mL de meio de cultura (mistura 1: 1 de DMEM: F-12 de Ham suplementado com FBS a 10%, HEPES 25 mM, penicilina 100 UI / mL e estreptomicina a 100 ug / mL) em cada placa e incubar a 37 ° C em 5% de CO2. Subcultura ou subclone das culturas, se necessário.

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Resultados

O tumor e a ANT foram utilizados com sucesso na isolação de proteínas e testados por Western blotting. Como mostrado na Figura 3 , os marcadores cutâneos de carcinoma de células escamosas (Muc1 ¹⁴ , FHL- ¹⁵ e p40 ^{16 , 17} ) podem ser detectados em amostras de pacientes coletadas e armazenadas em nosso biorrepositório clínico.

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Discussão

Para o conhecimento do autor, este protocolo é o primeiro de seu tipo que se concentra na aquisição clínica de amostras de tecido cutâneo, tanto em uma abordagem de custo eficaz e rápido. Pacientes submetidos a microcirurgia de Mohs são tipicamente agendados durante blocos específicos de tempo, ea coleta é limitada a esses períodos. A colheita de amostras envolve esforços do assistente médico envolvido na assistência ao paciente, o histotechnologist de Mohs que processa as amostras de tumor, e um membro do ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3