Création d'un biorepository basé sur une clinique

Résumé

Les tumeurs cutanées sont souvent éliminées suite à la chirurgie micrographique de Mohs. Un protocole est décrit ici qui permet au personnel de soutien clinique de traiter et de stocker efficacement les échantillons de tumeur cutanée ( p. Ex., Carcinome épidermoïde, carcinome basique et mélanome) pour des applications en laboratoire en aval sans interférer avec les opérations cliniques.

Résumé

L'incidence du cancer de la peau ( p. Ex., Carcinome épidermoïde, carcinome basocellulaire et mélanome) a augmenté au cours des dernières années. On s'attend à ce qu'il y ait une demande parallèle pour les échantillons de tumeurs cutanées pour des études de recherche biomédicales. La disponibilité des tissus, cependant, est limitée en raison du coût de l'établissement d'un biorepository et du manque de protocoles disponibles pour l'obtention d'échantillons cliniques qui n'interfèrent pas avec les opérations cliniques. Un protocole a été établi pour collecter et traiter la tumeur cutanée et les échantillons de sang et de salive associés qui ont un impact minimal sur les procédures cliniques de routine à la date de la chirurgie de Mohs. Les échantillons de tumeurs sont recueillis et traités à partir de patients subissant leur première couche de chirurgie de Mohs pour des tumeurs malignes cutanées éprouvées par biopsie par l'histotechnologiste de Mohs. Le tissu normal adjacent est recueilli au moment de la fermeture chirurgicale. Des échantillons supplémentaires qui peuvent être collectés sont des écouvillons sanguins et buccales. En utilisant des échantillons de tissus qui sont normalement rejetés, un biorepository a été généré qui offre plusieurs avantages clés en étant basé dans la clinique par rapport au paramètre de laboratoire. Ceux-ci incluent une large gamme d'échantillons collectés; Accès aux dossiers de patients identifiés, y compris les rapports de pathologie; Et, pour le donneur typique, accéder à des échantillons supplémentaires lors des visites de suivi.

Introduction

La recherche sur le cancer et les biomarqueurs repose sur une offre d'échantillons de tissus humains de qualité, et une offre limitée a entravé la recherche ^{1 , 2} . De nombreuses études dermatologiques sont limitées par l'offre insuffisante, la qualité variable et les coûts associés à l'utilisation du tissu humain. Le coût de l'établissement d'une importante biobanche dédiée a été estimé à environ deux millions de dollars ³ , et ces coûts mettent l'utilisation des tissus humains hors de la portée de nombreux chercheurs. En outre, le processus de génération et de stockage d'échantillons de recherche pose le risque d'affecter les opérations cliniques et de retarder les soins aux patients, si cela n'est pas soigneusement exécuté. Un biorepository basé sur une clinique rentable a été établi qui se concentre sur les échantillons de cancer de la peau selon les meilleures pratiques recommandées et la validation des échantillons ^{4 , 5 , 6} .

Ce protocole a été développé dans une clinique de dermatologie qui effectue un grand volume de chirurgies micrographiques de Mohs pour éliminer le carcinome épidermoïde (SCC), le cancer de base (BCC) et les cancers de la peau du mélanome. Les bailleurs de fonds volontaires peuvent être recrutés auprès de cette population de patients. Il est important d'établir le biorepository sur le site de collecte pour capturer rapidement les tissus et le sang des patients consentis sans délai de traitement. La collecte d'échantillons de la même clinique minimise les variations dans les techniques de collecte et minimise les variations de la qualité des échantillons, ce qui peut poser problème aux applications en aval ^{7 , 8} .

L'objectif de la technique de la chirurgie micrographique de Mohs est de s'assurer que tout le tissu cancéreux est éliminé tout en préservant autant de tissus sains que possible. La procédure implique l'élimination progressive de couches minces de tissu tumoral. Chaque couche successive est son(Après avoir critisé le tissu tumoral et réalisé une coloration H & E) par un dermatologue pour déterminer si tous les tissus cancéreux ont été enlevés. L'excision et l'examen des couches subséquentes de tissus sont exécutés alors que le patient reste dans le bureau. Cette technique est considérée comme la meilleure option de traitement pour SCC ⁹ . À ce stade, la plaie est fermée et, pour améliorer la guérison et l'apparence esthétique, le tissu normal adjacent (ANT) est souvent excisé. Ainsi, cette procédure chirurgicale pour éliminer une tumeur est idéale pour la collecte de tissu histologiquement caractérisé pour des études futures.

La procédure de passation des marchés pour l'obtention de tissus tumoraux, des tissus normaux adjacents, de la salive et du sang a été conçue pour avoir un impact minimal sur les tâches normales du personnel ( figure 1 ). Les assistants médicaux effectuent les tirages sanguins tout en préparant le patient pour la procédure. Après l'achèvement de la procédure Mohs, le M Oh histotechnologist prépare des diapositives histologiques supplémentaires du spécimen et transfère le tissu au biorepository. Les coûts associés à l'établissement du biorepository comprennent l'achat de congélateurs à cryoconservation, la création d'un espace de laboratoire clinique modeste et le développement d'un programme de suivi des stocks.

Figure 1: Séquence de la collecte des échantillons et du personnel responsable. Lors de l'enregistrement des patients et de l'obtention du consentement du patient, l'assistant médical collecte un prélèvement buccal et effectue un prélèvement sanguin. Le dermatologue et l'assistant médical excises la tumeur et ferment la plaie, au cours duquel les échantillons SCC et ANT sont collectés, respectivement. Un technicien de laboratoire spécialisé traite le sang et les sections des spécimens SCC et ANT pour la culture tissulaire, la préservation et l'entrée dans le biorepository.Ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La diversité des échantillons collectés permet une variété d'approches expérimentales ( figure 2 ). Les échantillons recueillis auprès du patient sont des écouvillons buccaux (la salive peut également être recueillie si nécessaire), du sang entier et du tissu excisé. Les écouvillons buccaux et un échantillon de sang entier sont sauvegardés, sans traitement, pour le génotypage et l'appariement des tissus. Le sang entier est séparé en globules blancs (WBC) et les fractions de plasma pour des analyses futures. Après le traitement de Mohs, la tumeur congelée est placée directement dans de l'azote liquide et transférée à un congélateur de -80 ° C. Les tissus tumoraux frais et viables et les échantillons ANT sont cultivés en utilisant des modifications des techniques précédentes ^{10 , 11} puis cryoconservées. Pendant la collecte, le nombre de chaque type d'échantillon est enregistré sur une feuille de calcul avant l'entrée dans Le programme de suivi des stocks pour faciliter un traitement précis ( tableau 1 ).

Figure 2: Résumé de la collecte et du traitement des échantillons biologiques à base de clinique. Un prélèvement buccal et un échantillon de sang sont recueillis auprès du patient et stockés pour le génotypage en aval et l'appariement des tissus. Le sang entier est ensuite traité pour l'isolement des globules blancs (WBC) et l'analyse CTC, ainsi que pour la collecte plasma et l'analyse de la biopsie liquide. Le tissu excisé pendant la procédure Mohs est traité histologiquement à des fins diagnostiques, après quoi les diapositives histologiques peuvent être utilisées expérimentalement pour d'autres analyses immunohistochimiques. Pourvu que l'échantillon de tissu excisé soit suffisamment grand, une partie de tissu frais est enlevée et sectionnée pour l'isolement de protéines et d'ARN et pour l'établissement de lignées cellulaires cultivées.55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Date de collecte:
	Patient 1	Patient 2	Patient 3	Patient 4	Patient 5
Initiales et date de naissance
Couleur des yeux
Échantillon type
Emplacement de l'échantillon
Salive
WTrou sang
Plasma
Tumoral viable
Tissu Normal Viable
Tumeur Mohs Nitrogen Liquide
Tissue Normal Nitrogen Liquide
Diapositives

Tableau 1: Liste de contrôle pour enregistrer les collections d'échantillons. Les données suivies et enregistrées avec chaque échantillon recueilli comprennent les initiales du patient, la date de naissance et la couleur des yeux (pour la typage de la peau), ainsi que la localisationSur l'enlèvement de l'échantillon. Le nombre d'échantillons de salive, les volumes de collecte de sang et le nombre de spécimens de tissus viables et conservés collectés sont également consignés comme références pour les allocations aux utilisations ultérieures. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Pour valider les procédures de collecte des échantillons, chaque type d'échantillon a été testé dans les applications en aval. En utilisant des modifications des techniques précédentes ¹² , la tumeur et l'ANT ont été utilisés avec succès dans l'isolement des protéines et de l'ARN et peuvent éventuellement être utilisés pour l'isolement de l'ADN. Les explants viables établis à partir des sections de tissu ont été évalués par microscopie, tandis que des diapositives histologiques stockées ont été utilisées pour l'immunohistochimie et l'immunofluorescence.

En suivant le protocole décrit ici, il est possible d'étendre ce modèle à d'autres cliniques de dermatologie, à d'autres types de tumeurs (comme le mélanome), Et d'autres spécialités et pratiques chirurgicales pour fournir des échantillons de tissus humains pour la recherche à multiples facettes sur les cancers humains. De légères modifications de ce protocole sont susceptibles d'être nécessaires pour d'autres pratiques, mais, en principe, ce protocole s'applique à toute pratique chirurgicale qui répète systématiquement les échantillons de patients recueillis au cours du traitement du patient.

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Protocole

Toutes les expérimentations sur des échantillons de tissus humains ont été approuvées par l'IRB de l'Ouest (protocole WIRB n ° 20142461). Le critère unique pour la collecte des tissus pour ces procédures est un diagnostic éprouvé par biopsie de SCC. Aucun critère d'exclusion n'a été décrit dans le protocole IRB original, mais les échantillons de patients atteints d'une maladie transmissible transmissible par le sang connue n'ont pas été utilisés. Le consentement éclairé a été obtenu avant la collecte des tissus cutanés, du sang et de la salive. Midwestern Institutional Review Board a approuvé le travail de validation avec des échantillons de biorepository basés sur la clinique à Midwestern University (AZ # 807).

1. Traitement des tissus tumoraux cutanés

REMARQUE: ceci doit être réalisé par un histotecchiste de Mohs.

1. Traitement du tissu de carcinome à cellules squameuses fraîches (SCC) pour l'ARN et la culture explicite
   1. Une fois que le tissu a été excisé par le chirurgien Mohs, récoltez 10 à 50 mg (≥ 10 mm ³ ) Échantillon de tissu du centre du côté apical du tissu pendant la relaxation (qui est le processus de manipulation du tissu pour lui permettre de rester à plat sur la glissière) avant un traitement supplémentaire.
      NOTE: Ceci n'est possible que si la tumeur est suffisamment grande pour permettre l'élimination d'un échantillon de 10 à 50 mg (≥ 10 mm ² ) avant l'évaluation histologique, qui fait partie de la procédure Mohs. Si la tumeur n'est pas suffisamment grande pour permettre un retrait d'au moins 2 mm ³ , ne pas procéder au traitement pour l'ARN (passer l'étape 5).
   2. Transférer le tissu viable sur un tube de 1,5 ml étiqueté contenant un milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: F-12 de jambon, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine) en utilisant une pince à épiler et assurez-vous que Le tissu est complètement immergé dans le milieu. Conservez ce tube à 4 ° C avant un traitement supplémentaire.
   3. Utilisez le tissu pour l'analyse de l'isolement et de l'expression de l'ARN (voir étape 5) et / ou l'établissementD'une culture d'explant (voir étape 6) dans les 24 h.
   4. Placez le reste de l'échantillon de tumeur qui a été retiré du patient (étape 1.1.1) sur un porte-tissu cryostat (ou "mandrin"). Incorporer le tissu dans un composé de température de coupe optimale (OCT), en gelant le tissu dans le support, pour permettre l'achèvement de l'histologie de Mohs et pour la préparation de diapositives histologiques supplémentaires pour l'analyse expérimentale.
2. Préparation des diapositives histologiques
   1. Couper les sections de tissu de 7 μm d'épaisseur en utilisant un cryostat et créer deux (ou plus) diapositives pour chaque échantillon de tumeur. Assurez-vous que chaque diapositive contient jusqu'à trois sections de la tumeur complète.
      REMARQUE: L'une des deux diapositives sera colorée en utilisant H & E par l'auteur histotecnologique de Mohs, et la ou les glissières supplémentaires peuvent être traitées avec des analyses IF, IHC ou FISH.
   2. Placez les lames dans de l'acétone pendant 1-2 s pour réparer le tissu. Réglez ces glissières de côté pour sécher. Ne pas H & ELa tache ou la lamelle couvre la diapositive pour être utilisée pour l'immunofluorescence future (IF), l'immunohistochimie (IHC) ou l'analyse par hybridation in situ fluorescente (FISH), selon le protocole expérimental.
3. Traitement du tissu post-Mohs
   1. Une fois que le traitement de Mohs a été complété (étapes 1.1-1.2), travaillez dans la chambre du cryostat et évacuez l'échantillon à partir du milieu de cryo-incorporation et placez le tissu dans un tube cryogénique étiqueté.
   2. Placez le flacon marqué dans de l'azote liquide avant que le tissu ne soit décongelé. Si des échantillons doivent être utilisés pour des analyses de protéines et / ou d'ADN, ils peuvent être transférés dans de l'azote liquide ou un congélateur de -80 ° C en quelques minutes pour être stockés pour une future analyse de la protéine et de la mutation de l'ADN (voir les étapes 4-5) .
      REMARQUE: Si l'on désire l'ARN intact à partir de l'échantillon post-Mohs, il est essentiel de garder l'échantillon congelé lors du retrait du milieu de cryo-incorporation. Si les soins extrêmes ne sont pas exercés àCette étape, l'échantillon post-Mohs devrait être réservé pour l'analyse des protéines et / ou de l'ADN.
4. Traitement de l'ANT frais
   1. Au moment de la fermeture de Mohs, obtenez ANT du chirurgien Mohs.
   2. Supprimez une quantité égale ou supérieure de ANT telle que récoltée à partir de l'échantillon SCC (voir ci-dessus) du côté apical du tissu normal et transférez-le à un tube de 1,5 ml étiqueté contenant du milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: Ham- 12 complété par 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine) à l'aide d'une pince à épiler.
   3. Plonger complètement le tissu dans le même milieu de culture et conserver à 4 ° C jusqu'à un traitement ultérieur (voir étapes 4-6).

2. Traitement du sang, de la salive et du prélèvement buccal

1. Obtenir environ 10 ml de sang dans les tubes de collecte EDTA par ponction veineuse.
2. Transférer le sang des tubes de collecte vers un tube de centrifugeuse stérile de 15 ou 50 mL. Retirer environ 200 μL dans un tube cryogénique de 1,5 ml, en évitant les bulles; Conserver cet échantillon de sang entier à -80 ° C, pour être utilisé pour le génotypage futur et l'appariement des tissus, si nécessaire.
   1. Faites passer le sang restant à 1000 xg pendant 30 minutes et suivez les procédures standard pour collecter la fraction plasmatique.
   2. Aliquoter le plasma dans des incréments de 1 ml dans des tubes cryogéniques de 1,5 ml et stocker à -80 ° C pour une utilisation lors des futures analyses de biopsies liquides.
3. Utilisez un écouvillon stérile pour obtenir un échantillon d'écouvillon buccal et rangez l'écouvillon dans un tube stérile à température ambiante.
4. Si nécessaire, obtenir un échantillon de salive et stocker dans un tube stérile à température ambiante.
   REMARQUE: Ces échantillons peuvent être utilisés pour le génotypage futur et l'appariement des tissus, si nécessaire.

3. Conservation des échantillons

1. Transférer les informations de la liste de contrôle des échantillons de patients à la base de données biorepository. Inclure l'information du patient et le diagnosticNosis du tableau des patients.
2. Imprimez les étiquettes avec un code à barres pour chaque échantillon et enregistrez chacun dans la base de données pour lier chaque échantillon collecté aux données du patient.
3. Enregistrez la distribution des échantillons identifiés dans la base de données biorepository avant de transférer les échantillons au laboratoire de recherche.

4. Isolation des protéines et analyse Western Blot

1. Placez chaque échantillon de tissu (SCC et / ou ANT) dans un flacon contenant 500 μL de tampon de lyse cellulaire contenant des inhibiteurs de protéase par 100 mg de tissu pour lyser le tissu.
   NOTE: Nous avons utilisé un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA), composé de 50 mM de Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,5% de désoxycholate de sodium, 1,0% de NP-40 et 0,1% de SDS. D'autres tampons de lyse cellulaire peuvent être utilisés.
2. Homogénéiser les tissus en utilisant un homogénéisateur de tissu pendant 5 min dans des intervalles de 20 s à 4 ° C. Faire passer les échantillons à 21 000 xg et 4 ° C pendant 20 min et collecter le surnageant contenant de la protéine dans un tu fraisêtre. Ré-tourner le surnageant en utilisant les mêmes conditions et collecter le surnageant final dans un tube frais.
3. Electrophorèse 30-50 μg de protéines de chaque échantillon en utilisant un gel gradient SDS-polyacrylamide à 4-20%. Tenez le gel avec Coomassie Blue pour visualiser les bandes de protéines, si désiré.
4. Si l'analyse Western Blot des protéines exprimées est nécessaire, transférez les protéines du gel à une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) en suivant des protocoles standard. Après le transfert, Ponceau tache la membrane PVDF pour visualiser les bandes de protéines, si désiré.
5. Bloquer la membrane et la sonde PVDF pour détecter les protéines d'intérêt suivant les protocoles standard. Utiliser des anticorps primaires spécifiques à la (des) protéine (s) d'intérêt, ainsi que des anticorps secondaires correspondants spécifiques aux anticorps primaires, aux concentrations recommandées par le fabricant pour l'analyse Western Blot.
6. Exposer la membrane sondée à l'aide d'un substrat chimioluminescent et image de la membrane à l'aide d'une imagiSystème ng.

5. Isolation de l'ARN et réaction en chaîne quantitative de la polymérase (qPCR)

1. Préparer immédiatement des échantillons de tissus frais (SCC et / ou ANT) dans un tube de 1,5 mL contenant une solution de stabilisation d'ARN et placer des échantillons de tissus post-Mohs dans un tube de 1,5 ml contenant une solution de transition de tissu congelé, conformément aux recommandations du fabricant. Assurez-vous que le tissu est complètement immergé. Conservez ces échantillons à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
2. Retirez les échantillons d'ARN de -80 ° C et décongélation sur de la glace. Transférer le tissu à un nouveau tube de 1,5 ml contenant 1 ml de tampon d'extraction d'ARN (phénol / thiocyanate de guanidine) par 50 à 100 mg de tissu.
3. Lyse les tissus en utilisant un homogénéisateur de tissu. Effectuer six cycles d'homogénéisation, suivis d'une période de refroidissement de l'échantillon; Chaque cycle se compose de 20 s d'homogénéisation à 4 ° C et d'une période de refroidissement de 40 s. Après homogénéisation, incuber l'échantillon pendant 5 minutes à température ambiante.
4. Ajouter 0,2Ml de chloroforme pour 1 ml de tampon d'extraction d'ARN et agiter vigoureusement le tube à la main pendant 15 s. Incuber pendant 2 à 3 minutes à température ambiante.
5. Faire passer les échantillons à 12 000 xg et 4 ° C pendant 15 min. Retirer la phase aqueuse de l'échantillon et la placer dans un nouveau tube de 1,5 ml.
6. Ajouter 0,5 ml d'isopropanol à 100% pour 1 ml du tampon d'extraction d'ARN utilisé à l'étape 5.2 à la phase aqueuse et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
   NOTE: Si les rendements d'ARN sont prévus pour être faibles ( c.-à-d., Le volume de tissus de départ est inférieur à 10 mg), les échantillons peuvent être précipités pendant une nuit à -80 ° C. De plus, 5 pg de glycogène sans RNase par 500 μL de tampon d'extraction d'ARN peuvent être ajoutés pendant l'étape de précipitation d'isopropanol pour améliorer les rendements d'ARN.
7. Faire tourner l'échantillon à 12 000 xg à 4 ° C pendant 10 min. Retirer le surnageant et laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 75%.
8. Vortez l'échantillon brièvement, puis tournez-le à 7 500 xg et 4 °C pendant 5 min. Jeter le lavage et sécher à l'air la pastille pendant 5-10 min.
9. Remettre en suspension la pastille d'ARN dans 20 μL d'eau sans RNase.
   1. Si désiré, purifiez chaque échantillon d'ARN en utilisant un kit de nettoyage d'ARN suivant les recommandations du fabricant.
      REMARQUE: Les petits ARN seront perdus de l'échantillon si cette étape est effectuée.
10. Électrophorèse un échantillon de 1 μg en utilisant un gel d'agarose à 1,2% de formaldéhyde-MOPS pour analyser la qualité de l'ARN.
    NOTE: En variante, analysez les échantillons en utilisant un bioanalyseur pour obtenir un numéro RIN ¹³ .
11. Inverser la transcription de l'ARN à l'ADNc en utilisant un protocole de transcription inverse pour l'analyse qPCR des ARNm cibles (ou des miRNA) d'intérêt.

6. Les cultures sensibles aux tissus

1. Stériliser le tissu excisé avant la culture en immergeant le tissu en 70% d'éthanol.
2. Placez le tissu sur une lame ou un plat et ajoutez suffisamment de milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: Ham & #F-12 F-12 complété par 10% de FBS, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / ml de streptomycine) pour couvrir le tissu (pour éviter que le tissu ne se séche). Coupez soigneusement le tissu en fragments (<1 mm ³ ) en utilisant une lame de scalpel.
3. Transférer les fragments de tissu dans un plat de culture tissulaire de 35 mm et ajouter environ 20 μL de sérum bovin fœtal (FBS) au-dessus de chaque fragment.
4. Laisser le plat ouvert dans un capot de culture pendant 20 à 30 minutes, ou jusqu'à ce qu'il soit presque sec.
5. Ajouter 1 ml de milieu de culture (mélange 1: 1 de DMEM: F-12 de jambon supplémenté avec 10% de FBS, 25 mM d'HEPES, 100 UI / mL de pénicilline et 100 μg / ml de streptomycine) à chaque plat et incuber à 37 ° C dans 5% de CO ₂ . Sous-culture ou sous-clone les cultures si nécessaire.

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Résultats

La tumeur et l'ANT ont été utilisés avec succès dans l'isolement des protéines et testés par Western Blot. Comme le montre la figure 3 , les marqueurs de carcinomes épidermiques cutanés (Muc1 ¹⁴ , FHL-1 ¹⁵ et p40 ^{16 , 17} ) peuvent être détectés dans des échantillons de patients collectés et stockés dans notre biorepository basé sur la clinique...

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Discussion

Pour la connaissance de l'auteur, ce protocole est le premier de son genre qui se concentre sur l'achat clinique d'échantillons de tissus cutanés dans une approche rentable et rapide. Les patients subissant une microchirurgie Mohs sont généralement programmés pendant des blocs de temps spécifiques, et la collecte est limitée à ces périodes. La collecte d'échantillons implique l'effort de l'assistant médical impliqué dans les soins aux patients, l'histotechnologue de Mohs qui trait...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3