クリニックベースのバイオリポジトリの設立

要約

皮膚腫瘍は、しばしば、モース顕微鏡手術後に捨てられる。臨床支援スタッフが、臨床操作を妨害することなく、下流の実験室用途のための皮膚腫瘍（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、および黒色腫）試料を効果的に処理および保存することを可能にするプロトコールがここに記載される。

要約

皮膚癌（ 例えば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌および黒色腫）の発生率は、過去数年間にわたって増加している。生物医学研究研究のための皮膚腫瘍サンプルが並行して要求されることが期待される。しかしながら、組織の入手可能性は、バイオリポジトリを確立するコストと、臨床操作を妨害しない臨床サンプルを得るために利用可能なプロトコルがないために限定されている。モース外科手術の日にルーチンの臨床手順に最小限の影響を与える皮膚腫瘍および関連する血液および唾液サンプルを収集および処理するためのプロトコルが確立された。腫瘍試料は、モース組織工学者による生検で証明された皮膚悪性腫瘍のための第1層のモース手術を受けている患者から収集され、処理される。隣接する正常組織は、手術終了時に収集される。採取することができる追加のサンプルは、全血および口腔スワブ。通常は廃棄される組織サンプルを利用することにより、診療所と臨床検査室の設定に基づいていくつかの重要な利点を提供するバイオリポジトリが生成された。これらには、幅広い収集サンプルが含まれています。病理学的報告を含む、識別されていない患者記録へのアクセス;典型的なドナーの場合、フォローアップ訪問中の追加サンプルへのアクセス。

概要

がんやバイオマーカーの研究は質の高いヒトの組織サンプルの供給に依存しており、限られた供給は研究^1,2を妨げている。多くの皮膚科学的研究は、供給不足、品質の変化、およびヒト組織の使用に関連するコストによって制限される。大規模な専用バイオバンクを構築するコストは約200万ドルと推定されており、これらのコストは人体組織の使用を多くの研究者の手の届かないところに置きます。さらに、研究サンプルを生成し保存するプロセスは、注意深く実行されなければ、臨床操作に影響を与え、患者のケアを遅らせるリスクをもたらす。推奨されるベストプラクティスとサンプルのバリデーション4,5,6に従って、皮膚癌サンプルに焦点を当てた費用効果の高いクリニックベースのバイオリポジトリが確立されました。

Mohs顕微鏡手術技術の目標は、可能な限り多くの健康な組織を保存しながら、すべての癌組織を確実に除去することです。この手順は、腫瘍組織の薄層の漸進的除去を含む。それぞれの連続する層は彼のものです皮膚科医によって（腫瘍組織を凍結切除し、H＆E染色を行った後に）論理的に検査して、すべての癌組織が除去されたかどうかを決定する。患者がオフィスに留まる間、組織の次の層の切除および検査が実行される。この手法は、SCC ^9の最良の治療選択肢と考えられています。この時点で、創傷は閉鎖され、治癒および美容的外観を改善するために、隣接する正常組織（ANT）が頻繁に摘出される。したがって、腫瘍を除去するためのこの外科的処置は、将来の研究のために組織学的に特徴付けられた組織を収集するのに理想的に適している。

腫瘍組織、隣接する正常組織、唾液、および血液サンプルを取得するための調達手順は、通常の職務に最小限の影響を及ぼすように設計されています（ 図1 ）。医療アシスタントは、手順のために患者を準備しながら血液採取を行う。 Mohs手順の完了後、Mオハイオ組織学者は標本の追加の組織スライドを準備し、その組織をバイオリポジトリに移す。バイオリポジトリの確立に関連するコストには、凍結保存フリーザの購入、適度な臨床検査スペースの作成、および在庫追跡プログラムの開発が含まれる。

図1：サンプル収集と責任スタッフのシーケンス。患者のチェックインと患者の同意が得られると、医療アシスタントは頬の綿棒を採取して採血を行う。皮膚科医および医療補助員は、腫瘍を切除し、創傷を閉鎖し、その間SCCおよびANT標本をそれぞれ収集する。専用の実験技術者が血液を処理し、組織培養、保存、およびバイオリポジトリへの入室についてSCCおよびANT標本を区分する。ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

収集されたサンプルの多様性は、さまざまな実験的アプローチを可能にします（ 図2 ）。患者から採取した試料は、頬拭き（唾液も必要に応じて採取することができる）、全血、および切除組織である。口腔スワブおよび全血由来のサンプルは、遺伝子タイピングおよび組織適合のために、処理することなく保存される。将来の分析のために、全血を白血球（WBC）と血漿画分に分離する。モース処理後、凍結した腫瘍を液体窒素に直接入れ、-80℃の冷凍庫に移す。新鮮な生存可能な腫瘍組織およびANT試料を、以前の技術10,11の改変を用いて培養し、次いで凍結保存する。収集中、各サンプルタイプの数は、スプレッドシートに記録されてから正確な処理を容易にする在庫追跡プログラム（ 表1 ）。

図2：臨床医ベースのバイオリポジトリのサンプル収集と処理の概要。頬側スワブおよび血液サンプルを患者から採取し、下流の遺伝子型決定および組織適合のために保存する。全血は、白血球（WBC）単離およびCTC分析ならびに血漿採取および液体生検分析のためにさらに処理される。 Mohs手順中に切除された組織は、診断目的のために組織学的に処理され、その後、組織学的スライドはさらなる免疫組織化学的分析のために実験的に使用され得る。切除された組織試料が十分に大きい場合、新鮮な組織の一部を取り出し、タンパク質およびRNAの単離および培養細胞系の確立のために切片化する。55583 / 55583fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

コレクション日：
	患者1	患者2	患者3	患者4	患者5
頭文字と誕生日
目の色
サンプルタイプ
サンプルの場所
唾液
W穴の血
プラズマ
腫瘍の生存率
組織正常Viable
腫瘍モース液体窒素
組織正常液体窒素
スライド

表1：サンプルコレクションを記録するチェックリスト収集された各サンプルと共に追跡され、記録されたデータには、患者のイニシャル、生年月日、および肌の色のための目の色、試験片除去のオン。唾液サンプル数、採血量、および採取した生存および保存された組織標本の数も、後の使用のための参考文献として記録される。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。

サンプル収集手順を検証するために、各サンプルタイプはダウンストリームアプリケーションでテストされています。以前の技術^12の改変を用いて、腫瘍およびANTはタンパク質およびRNA単離に首尾よく用いられ、DNA単離のために潜在的に使用され得る。組織切片から確立された生存外植片を顕微鏡検査し、保存された組織スライドを免疫組織化学および免疫蛍光のために使用した。

本明細書に記載されたプロトコールに従って、このモデルを他の皮膚科診療所、他の腫瘍型（メラノーマなど）にまで拡張することが可能であり、、およびヒト癌への多面的研究のためのヒト組織サンプルを提供するための他の外科的専門性および実践を含む。このプロトコルのわずかな変更は、他のプラクティスにとって必要である可能性が高いが、原則として、このプロトコルは、患者治療の過程で収集された患者サンプルを日常的に廃棄する任意の外科手術に適用可能である。

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プロトコル

ヒト組織サンプルに関する全ての実験は、Western IRB（WIRB Protocol＃20142461）によって承認された。これらの処置のための組織収集の単一の基準は、生検で証明されたSCCの診断である。除外基準は元のIRBプロトコルで概説されていませんが、血液媒介性伝染性疾患の患者のサンプルは使用されませんでした。皮膚組織、血液、および唾液の採取に先立ち、インフォームドコンセントが得られた。 Midwestern Institutional Review Boardは、Midwestern University（AZ＃807）の診療所ベースのバイオリポジトリサンプルでの検証作業を承認しました。

1.皮膚腫瘍組織の処理

注：これは、モズの組織学者によって行われます。

1. RNAおよび外植片培養のための新鮮な扁平上皮癌（SCC）組織の処理
   1. 組織をモース外科医が切除した後、10〜50mg（≧10mm ³ ）組織サンプルを、追加の処理の前に、弛緩の間に組織の先端側の中心から除去する（これは、スライドを平らにするように組織を操作するプロセスである）。
      注：これは、腫瘍がMohs手術の一部である組織学的評価の前に10〜50mgのサイズの試料（10mm ^2以上 ）を除去するのに十分な大きさである場合にのみ可能です。腫瘍の大きさが最小で2mm ³を除去するのに十分でない場合は、RNAの処理を続行しないでください（ステップ5をスキップしてください）。
   2. ピンセットを用いて、培養培地（DMEM：Ham's F-12,25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンの1：1混合物）を含有する標識1.5mLチューブに生存可能な組織を移し、組織は完全に培地に浸される。このチューブを4℃で保存してから処理してください。
   3. 組織をRNA単離および発現解析（ステップ5を参照）および/または構築するために使用する24時間以内に外植培養（ステップ6参照）を行う。
   4. クライオスタットの組織ホルダー（または「チャック」）に、患者から取り出した腫瘍サンプルの残りの部分（ステップ1.1.1）を置きます。最適な切断温度（OCT）の化合物に組織を埋め込み、モース組織学の完成および実験分析のためのさらなる組織学的スライドの調製を可能にするために、ホルダー内の組織を凍結する。
2. 組織学的スライドの調製
   1. クライオスタットを使用して7μmの厚さの組織切片を切断し、各腫瘍サンプルに対して2つ（またはそれ以上）のスライドを作成する。各スライドに完全腫瘍の3つのセクションが含まれていることを確認します。
      注：2つのスライドのうちの1つは、Mohs histotechnologistによってH＆Eで染色され、追加のスライドはIF、IHC、またはFISH解析で処理されます。
   2. スライドを1〜2秒間アセトンに入れて組織を固定する。これらのスライドを乾燥させておく。 H＆Eをしないでください実験プロトコルに応じて、将来の免疫蛍光（IF）、免疫組織化学（IHC）、または蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）分析に使用するスライドを染色またはカバースリップする。
3. モホ組織の処理
   1. モースの処理が完了したら（ステップ1.1-1.2）、クライオスタットチャンバー内で作業し、クライオ包埋培地からサンプルを取り出し、標識された極低温チューブに組織を入れる。
   2. 組織が融解する前に、ラベルされたバイアルを液体窒素に入れます。サンプルをタンパク質および/またはDNA分析に使用する場合は、液体窒素または-80℃のフリーザーに数分以内で移して、将来のタンパク質発現およびDNA変異解析のために保存することができます（ステップ4-5を参照） 。
      注：ポストモースサンプルからインタクトなRNAが望まれる場合は、クライオ包埋培地からの除去中にサンプルを凍結した状態に保つことが不可欠です。極端な注意が行使されない場合このステップでは、モース後サンプルは、タンパク質および/またはDNA分析のために予約する必要があります。
4. 新しいANTの処理
   1. モースの閉鎖時に、モース外科医からANTを入手する。
   2. 正常組織の頂端側からSCCサンプル（上記参照）から採取したものと等しいかそれ以上の量のANTを除去し、それを培地（DMEM：Ham's F- 12に、25mM HEPES、100IU / mLのペニシリン、および100μg/ mLのストレプトマイシンを補充したもの）を使用した。
   3. 同じ培養液に組織を完全に浸し、その後の処理まで4℃で保存します（ステップ4-6参照）。

2.血液、唾液および口腔スワブ処理

1. 約10mLの血液を静脈穿刺を介してEDTA採取チューブで採取する。
2. 収集チューブから滅菌した15または50 mLの遠心チューブに血液を移します。気泡を避けて、約200μLを1.5mLの極低温管に移す。この全血サンプルを-80°Cで保存し、必要に応じて将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用します。
   1. 残りの血液を1000 xgで30分間遠心し、標準的な手順に従って血漿画分を集める。
   2. 分注した血漿を1.5 mLの低温チューブで1 mL刻みに分け、将来の液体生検分析で使用するために-80°Cで保存します。
3. 口腔内スワブサンプルを得るために滅菌スワブを使用し、室温で滅菌チューブにスワブを保存する。
4. 必要に応じて、唾液サンプルを入手し、室温で滅菌チューブに保存します。
   注：これらのサンプルは、必要に応じて、将来の遺伝子型同定および組織マッチングに使用することができます。

3.サンプルの記録保管

1. 情報を患者サンプルのチェックリストからバイオリポジトリデータベースに転送する。患者情報と診断情報を含める患者の表からの鼻。
2. 各サンプルのバーコード付きラベルを印刷し、データベースにそれぞれ記録して、収集した各サンプルを患者データとリンクさせます。
3. サンプルを研究室に移す前に、識別されていないサンプルの分布をバイオリポジトリデータベースに記録する。

4.タンパク質単離およびウエスタンブロット分析

1. 各組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を、100mgの組織当たりプロテアーゼインヒビターを含む500μLの細胞溶解バッファーを含むバイアルに入れ、組織を溶解する。
   注：50mMトリスpH8.0,150mM NaCl、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、1.0％NP-40、および0.1％SDSからなるラジオイムノ沈降アッセイ（RIPA）緩衝液を使用した。他の細胞溶解緩衝液を使用することができる。
2. 組織ホモジナイザーを用いて4℃で20秒間隔で5分間組織をホモジナイズする。サンプルを21,000 xgおよび4℃で20分間スピンし、タンパク質を含む上清を新鮮なtuに集めるさあ。同じ条件を用いて上清を再遠心し、最終上清を新しいチューブに集める。
3. 電気泳動4〜20％SDS-ポリアクリルアミドグラジエントゲルを用いて各サンプルから30〜50μgのタンパク質を抽出する。必要に応じて、クーマシーブルーでゲルを染色し、タンパク質バンドを可視化します。
4. 発現されたタンパク質のウェスタンブロット分析が必要な場合は、標準プロトコールに従ってゲルからポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にタンパク質を移す。移動後、PonceauはPVDF膜を染色して、必要に応じてタンパク質バンドを可視化する。
5. PVDF膜とプローブをブロックして、標準プロトコールに従って目的のタンパク質を検出します。ウェスタンブロット分析のために製造業者が推奨する濃度で、主要な抗体に特異的な対応する二次抗体と共に、目的のタンパク質に特異的な一次抗体を使用する。
6. 化学発光基質を用いてプローブされた膜を露出させ、imagiシステム。

RNA単離および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）

1. 直ちに、RNA安定化溶液を含む1.5mLチューブに新鮮な組織サンプル（SCCおよび/またはANT）を置き、凍結組織転移溶液を入れた1.5mLチューブにMohs組織サンプルを置き、製造元の推奨に従ってください。組織が完全に浸漬されていることを確認します。これらのサンプルは、使用するまで-80℃で保存してください。
2. RNAサンプルを-80℃から取り出し、氷上で解凍する。 50〜100mgの組織当たり1mLのRNA抽出バッファー（フェノール/グアニジンチオシアネート）を含む新しい1.5mLチューブに組織を移す。
3. 組織ホモジナイザーを用いて組織を溶解する。 6サイクルのホモジナイゼーションを行い、続いてサンプルを冷却します。各サイクルは、4℃および40秒の冷却期間で20秒の均質化からなる。ホモジナイゼーション後、サンプルを室温で5分間インキュベートする。
4. 0.2を加える1mLのRNA抽出バッファーあたり1mLのクロロホルムで洗浄し、チューブを15秒間手で激しく振とうする。室温で2〜3分間インキュベートする。
5. サンプルを12,000 xg、4℃で15分間スピンします。サンプルの水相を取り出し、新しい1.5 mLチューブに入れます。
6. 水相にステップ5.2で使用したRNA抽出バッファー1 mLあたり100 mLのイソプロパノール0.5 mLを加え、室温で10分間インキュベートする。
   注：RNA収量が低いと予想される場合（ すなわち、開始組織量が10mg未満の場合）、サンプルは-80℃で一晩沈殿する可能性があります。さらに、500μLのRNA抽出バッファーあたり5μgのRNaseフリーグリコーゲンを、イソプロパノール沈殿工程の間に添加してRNA収量を改善することができる。
7. サンプルを12,000 xgで4℃で10分間スピンします。上清を除去し、ペレットを1mLの75％エタノールで洗浄する。
8. サンプルを短時間ボルテックスしてから、7,500 xgと4°で回転させます5分間Cで処理した。洗浄液を捨て、ペレットを5〜10分間風乾します。
9. RNAペレットを20μLのRNaseフリー水に再懸濁します。
   1. 必要に応じて、製造元の推奨に従ってRNAクリーンアップキットを使用して各RNAサンプルを精製します。
      注：このステップを実行すると、サンプルからRNAが失われます。
10. 1.2％ホルムアルデヒド-MOPSアガロースゲルを用いて1μgのサンプルを電気泳動し、RNAの品質を分析する。
    注：代替として、バイオアナライザーを使用してサンプルを分析し、RIN番号¹³を得る。
11. 関心対象の標的mRNA（またはmiRNA）のqPCR分析のために逆転写プロトコールを用いてRNAをcDNAに逆転写する。

6.組織外植片培養

1. 組織を70％エタノールに浸すことにより、培養前に切除した組織を滅菌する。
2. スライドまたはディッシュ上に組織を置き、十分な培地（DMEM：Ham＆＃1の1：1混合物）組織を（組織の乾燥を防ぐために）覆うために、10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリン、および100μg/ mLストレプトマイシンを補充したF-12。メスを用いて、組織を砕いて（<1 mm ³ ）破砕します。
3. 組織断片を35mm組織培養皿に移し、各断片の上に約20μLの胎児ウシ血清（FBS）を加える。
4. 培養フード内で20〜30分間、またはほとんど乾燥するまで、ディッシュを開いたままにしておきます。
5. 各ディッシュに1mLの培地（10％FBS、25mM HEPES、100IU / mLペニシリンおよび100μg/ mLストレプトマイシンを補充したDMEM：Ham's F-12の1：1混合物）を添加し、37℃でインキュベートする5％CO ₂中のC。必要に応じて継代培養するか、培養物をサブクローニングする。

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結果

腫瘍およびANTは、タンパク質単離において首尾よく使用され、ウェスタンブロッティングによって試験された。 図3に示すように、皮膚扁平上皮癌腫マーカー（Muc1 ¹⁴ 、FHL-1 ¹⁵ 、およびp40 ^16,17 ）は、本発明者らの診療所ベースのバイオリポジトリに収集および保存された患者サンプルで検出することが...

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ディスカッション

著者らの知る限り、このプロトコールは、費用対効果と迅速なアプローチの両方で皮膚組織サンプルの臨床調達に焦点を当てた最初のものです。 Mohsマイクロサージャリーを受けている患者は、通常、特定の時間帯にスケジュールされ、収集はこれらの期間に限定されます。サンプル収集には、患者のケアに携わる医療補助員、腫瘍サンプルを処理するモース組織学者、サンプルの採取およ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3