可切换声光学分辨率光声显微镜<em&gt;体内</em&gt;小动物血液血管成像

摘要

这里展示了可在体内在相同样品上进行浅层深度高分辨率成像和低分辨率深层组织成像的可切换声学分辨率（AR）和光学分辨率（OR）光声显微镜（AR-OR-PAM）系统。

摘要

光声显微镜（PAM）是一种快速增长的invivo成像模式，结合光学和超声波，提供高分辨率穿透超过光学平均自由程（皮肤约1毫米）。通过将光学吸收对比度与单一模态中超声的高空间分辨率相结合，该技术可以穿透深层组织。光声显微镜系统可以具有较低的声学分辨率和探针深度或较高的光学分辨率和探针。通过单个系统实现高空间分辨率和大深度穿透是具有挑战性的。这项工作提出了一个AR-OR-PAM系统，能够在浅层深度进行高分辨率成像和体内相同样品的低分辨率深层组织成像。使用光学聚焦的1.4mm成像深度的横向分辨率为4μm，使用声学聚焦的具有7.8mm成像深度的45μm的横向分辨率成功利用组合系统进行演示。在这里， 进行体内小动物血液血管成像以证明其生物成像能力。

引言

高分辨率光学成像方式，如光学相干断层扫描，共聚焦显微镜和多光子显微镜，有许多好处。然而，随着成像深度的增加，空间分辨率显着降低。这是因为软组织中光传输的漫射性质^1,2 。光激发和超声检测的集成提供了一种解决方案，以克服深层组织中高分辨率光学成像的挑战。光声显微镜（PAM）是一种可以提供比其他光学成像模式更深的成像的方式。已成功应用于体内结构，功能，分子和细胞成像^{3,4,5,6,7,8 ， 9，10，11，12，13}研究结合强光学吸收对比度与超声波的高空间分辨率。

在PAM中，短的激光脉冲照射组织/样品。通过发色团（ 例如，黑色素，血红蛋白，水等 ）的光吸收导致温度升高，这又导致以声波（光声波）的形式产生压力波。产生的光声波可以由组织边界外的宽带超声换能器检测。利用弱光学和紧密的声学聚焦，可以在声分辨光声显微镜（AR-PAM） ^14,15,16中实现深层组织成像。在AR-PAM，横向分辨率为45μm，成像深度高达3mm，已被证明¹⁵ 。为了在声学上解析单个毛细管（约5μm），需要在> 400 MHz中心频率下运行的超声波换能器。在这样高的频率下，穿透深度小于100μm。使用紧密的光学聚焦可以解决紧密的聚焦造成的问题。光学分辨率光声显微镜（OR-PAM）能够分辨单个毛细管，甚至单个细胞¹⁷ ，并且已经实现了0.5μm的横向分辨率^{18,19,20,21,22,23,24} 。使用光子纳米喷嘴可以帮助实现超出衍射极限分辨率的分辨率n ^25，26 。在OR-PAM中，由于聚焦而使穿透深度受到限制，并且它可以在生物组织²³内形象高达^〜1.2mm 。因此，AR-PAM可以使图像更深，但分辨率更低，OR-PAM可以以非常高的分辨率进行成像，但成像深度有限。 AR和OR-PAM系统的成像速度主要取决于激光源²⁷的脉冲重复率。

结合AR-PAM和OR-PAM将对需要高分辨率和深度成像的应用非常有利。将这些系统结合在一起已经做了很少的努力。通常，使用两种不同的成像扫描仪进行成像，这要求样品在两个系统之间移动，因此难以进行体内成像。然而，使用AR和OR PAM的混合成像可实现具有可扩展分辨率a的成像深度。在一种方法中，使用光纤束来传送用于AR和OR PAM的光。在这种方法中，使用两个单独的激光器（对于AR为570nm的高能激光器，对于OR为532nm的低能量，高重复率激光器），使得系统不方便和昂贵²⁸ 。 OR-PAM激光波长是固定的，并且使用该组合系统不可能进行许多研究，例如氧饱和度。 AR和OR PAM之间的比较研究也是不可能的，因为AR和OR之间的激光波长不同。此外，AR-PAM使用明场照明;因此，来自皮肤表面的强光电信号限制了图像质量。因此，该系统不能用于许多生物成像应用。在另一种执行AR和OR PAM的方法中，光学和超声波聚焦被移动，这使得光焦点和超声波聚焦不对齐。因此，图像质量不是最佳的 ^{29。使用这种技术，AR-PAM和OR-PAM可以分别达到139μm和21μm的分辨率，使其分辨率不高。据报道另一种方法是改变光纤和准直光学器件，以便在AR和OR PAM之间进行切换，使得对准过程困难。在所有这些情况下，AR-PAM都不使用暗场照明。暗场照明的使用可以减少从皮肤表面产生强烈的光声信号。因此，使用环形照明可以进行深层组织成像，因为深色光声信号的检测灵敏度将比亮场照明的检测灵敏度高。}

这项工作报告了一个可切换的AR和OR PAM（AR-OR-PAM）成像系统，能够对相同样品进行高分辨率成像和低分辨率深层组织成像，使用相同的激光和扫描仪进行两个系统EMS。 AR-OR-PAM系统的性能通过使用幻影实验确定空间分辨率和成像深度来表征。 在小鼠耳朵上进行体内血液血管成像以证明其生物成像能力。

研究方案

所有动物实验均按照新加坡南洋理工大学机构动物保护和使用委员会（动物标本编号ARF-SBS / NIE-A0263）的批准规定和指导方针进行。

AR-OR-PAM系统（ 图1 ）

1. 系统配置:AR-PAM
   1. 使用由二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532nm）和可调谐范围为559-576nm的染料激光器组成的纳秒可调谐激光器系统作为光学照射源。使用外部控制器将激光波长设置为570 nm，使用激光软件将激光重复率设置为1 kHz。
   2. 在激光前面放置45°角的光束采样器，通过可变中性密度滤光片（NDF1; OD = 0-4.0）将5％的激光功率转移到光电二极管。
   3. 使用光束采样器将激光束转向90°直角棱镜（RAP1）。
   4. 使用另一个直角棱镜（RAP2）允许光束通过可变中性密度滤光片（NDF2; OD = 0-4.0）并通过多模光纤（MMF），将其引导通过光纤耦合器（FC）目标组合（数值孔径（NA）:0.25）和XY平移器。
   5. 使用XY转换器将光纤固定到扫描台上。将距离光纤输出端25毫米的平凸透镜（L1）放置在光纤以外的位置。
   6. 将准直光束通过顶角为130°的锥形透镜，以产生环形光束。使用自旋式光学冷凝器（OC），锥形角度为70°和110°并在中心有一个孔，将环形光束轻微聚焦到被摄体上。
   7. 在自制冷凝器的中心放置一个带有声透镜（AL）的50 MHz超声波换能器（UST）。
2. 系统配置:OR-PAM
   1. 用一个由二极管泵浦的固态Nd-YAG激光器（532nm）和可调谐范围为559-576nm的染料激光器组成的纳秒可调谐激光器系统作为光学照射源。使用外部控制器将激光波长设置为570 nm，使用激光软件将激光重复率设置为5 kHz。
   2. 将计算机控制的旋转台（保持RAP1）旋转90°，将激光束转移到光圈上进行重新整形。
   3. 沿着光束使激光束放置一个可变的中性密度滤光片（OD:0-4.0），然后用聚光透镜（CL）对光束进行聚焦。将其穿过距离CL 75 mm的针孔（PH），进行空间过滤。
   4. 使用由0.1 NA物镜组成的单模光纤耦合器（FC）将空间滤波光束发射到单模光纤（SMF）上，以将光束聚焦到SMF上。
   5. 调整光纤耦合器以实现最大耦合效率。
   6. 将光纤固定到t上他使用滑板（SP）扫描舞台。放置距离SM光纤50 mm的消色差透镜（L2），以准直激光束。
   7. 使用运动学可控椭圆镜（M）将准直光束转向90°，以填充另一个相同的消色差透镜（L3）的后孔。使用透镜管（LT）将用于聚焦的消色差透镜放置在平移支架（TM2）上。
   8. 将聚焦光束通过由直角棱镜（RA）和菱形棱镜（RP）组成的自制光声光束组合器，其间具有一层硅油（SO）。
      注意:硅油层将作为光学透明和声反射膜。
   9. 安装声透镜（AL），以提供菱形棱镜底部的声聚焦（焦距:〜46μm）。
   10. 将超声波换能器的中心频率为50 MHz放置在菱形棱镜的顶部;使用环氧树脂层进行有效耦合。

2.系统切换和对准

1. 将自制的可切换板固定（通过拧紧）到由连接到计算机的3轴控制器控制的3轴电动平台。
2. 使用保持架安装支架将AR和OR笼系统连接到自制板上，以便在AR和OR扫描头之间轻松切换。将扫描头滑动到成像区域的顶部。
3. 使用Z级将AR-OR-PAM扫描仪头部的底部淹没在充满水的丙烯酸罐（13 cm x 30 cm x 3 cm）中，进行声耦合。
4. 打开容器底板上直径为7厘米的成像窗口，并用聚乙烯膜密封以进行光学和声学传播。
5. 使用脉冲回波放大器和示波器将超声波换能器对准。
   1. 在发送/接收模式下，将脉冲回波放大器的增益设置为24db。
   2. 使用同步信号fr使用脉冲回波放大器作为触发，并使用示波器检测来自玻璃滑块（从水箱底部插入）的背散射信号。
      注意:幻灯片应该粘在黑色的胶带上。
   3. 移动Z轴以最大化脉冲回波信号的幅度（在示波器上查看）。
      注意:当玻璃板对焦时，回波将具有最大幅度。
6. 使用BNC电缆打开激光器并将UST连接到两个放大器，每个放大器具有24 dB固定增益。
   注意:放大器的输出端连接到数据采集卡（DAQ）。
7. 使用位于激光器前面的光电二极管（PD）的信号作为数据采集系统的触发器。
8. 在AR-PAM中，改变锥形透镜（con.L）和光学聚光器（OC）之间的距离，以使从测试对象产生的光声信号（黑带粘贴在载玻片上）的振幅最大化。通过确定最大光声（PA）信号幅度，确保光和声聚焦是共焦的。
   1. 注意最大PA信号的延迟;请稍后再查看数据采集软件的重点。
9. 松开扫描头的螺丝，并将扫描头从AR-PAM手动切换到OR-PAM。然后拧紧螺丝。
10. 在OR-PAM中，改变聚焦消色差双重（透镜管（LT）内）和光声组合器之间的距离，以最大化示波器上显示的PA信号幅度。
    1. 注意最大PA信号的延迟。
       注意:Finetuning是确定共焦排列的必要条件。

实验步骤

1. 横向分辨率和成像深度量化
   1. 使用直径为100纳米的金纳米颗粒来确定AR a的横向分辨率d OR系统。
   2. 用等量的水稀释0.1mL的纳米颗粒溶液。将0.1 mL稀释的溶液分布在盖板上，并将其与罐下方的聚乙烯膜接触。
   3. 在扫描之前，确保AR-PAM和OR-PAM在数据采集软件（参见材料表）中保持对焦（步骤2.8和2.10）。
      注意:通过了解步骤2.9和2.10中最大PA信号的微秒延迟乘以采样率（250 MS / s），图像将在数据采集软件中处于焦点。可以在软件中确定在数据采集期间必须省​​略的延迟，以便仅保存用于后处理的必要数据点。
   4. 设置AR-PAM的扫描参数，然后按"扫描"按钮开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中以"4"mm / s的扫描速度在"速度"中设置AR-PAM的扫描参数;选项卡，"脉冲重复率"选项卡中的"1"kHz，"Y扫描范围"选项卡中的"0.5"mm，"X扫描范围"选项卡中的"0.5"mm。在"dx"选项卡中将x方向的步长设置为"4"μm。
         注意:从方向的扫描速度速度和脉冲重复率（在这种情况下为4,000μm/ 1,000 Hz = 4μm）自动确定y方向的步长，
   5. 设置OR-PAM的扫描参数，然后按"扫描"按钮开始光栅扫描。
      1. 在"速度"选项卡中，将扫描参数设置为"2.5"mm / s的扫描速度，"脉冲重复率"选项卡中的"5"kHz，"Y扫描范围"为0.5"mm，选项卡，"X扫描范围"选项卡中为"0.5"mm。在"dx"选项卡中将x方向的步长设为"0.5"μm。
         注意:从台阶的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下，2500μm/ 5000Hz =0.5μm）自动确定y方向的尺寸。
   6. 确保在扫描过程中，数据被连续捕获并存储在计算机上
      注意:数据将仅在Y级的一个运动方向上捕获。
   7. 使用存储在计算机中的多个B扫描数据使用图像处理软件检索最大幅度投影（MAP）图像（参见材料表 ）。
   8. 使用来自扫描的单个纳米颗粒图像（多个图像中的多个图像）通过手动绘制通过纳米颗粒图像的中心区域的线来确定横向分辨率，以获得看起来像高斯曲线的点扩展函数。参见图2 。
   9. 使用Gau适应从单个纳米颗粒图像获得的点扩散函数ssian拟合函数，并使用图像处理软件测量半高宽（FWHM）（见材料表 ）。使用它作为横向分辨率。参见图2 。
   10. 将一块黑色胶带倾斜地放在一块切片的鸡肉组织上作为目标物体进行深度成像。将纸带放在水箱中。
       注意:黑色胶带卡在具有尖锐尖端的金属板上，这有助于将胶带粘贴到纸巾上。
   11. 将AR-PAM的扫描参数设置到数据采集软件中，然后按"扫描"按钮捕获单个B扫描图像，以确定最大成像深度。
       1. 在"速度"标签中将扫描参数设置为"15"mm / s，"脉冲重复率"选项卡中为"1"kHz，"Y扫描范围"选项卡中为"5"cm，"0.1" "mm"在"X扫描范围"选项卡。设定t在"dx"选项卡中，在x方向上的步长为"0.1"mm。
   12. 设置OR-PAM的扫描参数，然后按"扫描"按钮捕获单个B扫描图像，以确定最大成像部分。
       1. 将数据采集软件中的扫描参数设置为"速度"选项卡中的"15"mm / s扫描速度，"脉冲重复率"选项卡中的"5"kHz，"Y扫描范围"中的"2"选项卡，"X扫描范围"选项卡中为"0.1"mm。在"dx"选项卡中，将x方向的步长设置为"0.1"mm。
          注意:由于X扫描范围和dx相同，因此只能捕获一次B扫描。时间分辨的PA信号乘以软组织中的声速（1,540m / s）将产生A线图像。在Y级的连续运动期间捕获多条A线以产生B扫描。
2. 体内</ em>成像的小鼠耳血管血管
   1. 使用体重25克，年龄4周的雌鼠。
   2. 使用氯胺酮（120mg / kg）和西咪嗪（16mg / kg）腹腔注射（剂量为0.1mL / 10g）麻醉动物。
   3. 使用脱毛霜从动物耳朵上取下头发。擦拭区域清洁。用无菌眼软膏覆盖动物的眼睛，以避免任何分散的激光束落在眼睛上。
   4. 将动物放在还有一个微型板的台上定位耳朵。
   5. 在成像期间，用吸入的异氟烷（0.75L，1L / min氧气）维持麻醉。
   6. 将脉搏血氧计固定到鼠标腿或尾部并监测生理状态。使用超声波凝胶使成像区域与聚乙烯膜接触。
   7. 设置AR-PAM的扫描参数，然后按"扫描"按钮启动光栅扫描ING。
      1. 在"速度"选项卡中，在数据采集软件中以"15"mm / s扫描速度设置AR-PAM的扫描参数，"脉冲重复率"选项卡中的"1"kHz，" Y扫描范围"选项卡，"X扫描范围"选项卡中为"6"mm。在"dx"选项卡中将x方向的步长设置为"30"μm。
         注意:从方向的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下，为15,000μm/ 1,000 Hz = 15μm）自动确定y方向的步长。
   8. 完成AR-PAM扫描后，将成像头位置从AR-PAM切换到OR-PAM（如第2节所述）。
   9. 设置OR-PAM的扫描参数，然后按"扫描"按钮开始光栅扫描。
      1. 在数据采集软件中以"15"mm / s扫描速度在"速度"中设置OR-PAM的扫描参数y"选项卡，"脉冲重复率"选项卡中的"5"kHz，"Y扫描范围"选项卡中的"10"mm，"X扫描范围"选项卡中的"6"mm，设置步长在"dx"标签中的x方向为"6"μm。
         注意:沿着方向的扫描速度和脉冲重复率（在这种情况下为15,000μm/ 5,000 Hz = 2μm），自动确定y方向的步长。
   10. 使用计算机中存储的多个B扫描数据，使用图像处理软件检索MAP图像。
   11. 在整个成像期间观察动物。

结果

AR-OR-PAM系统的原理图如图1所示。在这种设置中，所有组件都集成在一起，并组装在一个光学保持架中。使用笼式系统可使AR-OR-PAM扫描头紧凑，易于组装，对齐和集成到单个扫描台上。

在图像采集期间使用成像头的二维连续光栅扫描。时间分辨的PA信号乘以声速（1,540m / s）以获得A线。在Y阶段的连续运动?...

讨论

总而言之，已经开发出可切换的AR和OR PAM系统，其可以在更低的成像深度处实现高分辨率成像并且在较高的成像深度处实现较低分辨率的成像。确定可切换系统的横向分辨率和成像深度。该可切换PAM系统的优点包括:（1）使用紧密光学聚焦的高分辨率成像; （2）使用声学聚焦的深层组织成像; 3）AR-PAM的暗场照明，防止强烈的PA信号出现在皮肤表面; 4）将样品保持在一个地方，而不是在不同系统之间?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q-switched Nd:YAG laser	Edgewave	BX80-2-L	Pump laser
Credo-High Repetition Rate Dye Laser	Spectra physics	CREDO-DYE-N	Dye laser
Precision Linear Stage	Physik Instrumente	PLS 85	XY raster scanning stage
Translation stage	Physik Instrumente	VT 80	Confocal determine
Mounted Silicon photodiode	Thorlabs	SM05PD1A	Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage	Thorlabs	CR1/M-Z7	Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M	Intensity variable
Fiber Patch Cable	Thorlabs	M29L01	Multimode fiber
Microscope objective	Newport	M-10X	Objective
XY translating mount	Thorlabs	CXY1	Translating mount
Plano convex lens	Thorlabs	LA1951	Collimating lens
Conical lens	Altechna	APX-2-B254	Ring shape beam
Translation stage	Thorlabs	CT1	Translating stage
Optical condenser	Home made
Ultrasonic transducer	Olympus-NDT	V214-BB-RM	50MHz transducer
Plano concave lens	Thorlabs	LC4573	Acoustic lens
Pulser/Receiver	Olympus-NDT	5073PR	Pulse echo amplifier
Mounted standard iris	Thorlabs	ID12/M	Beam shaping
Plano convex lens	Thorlabs	LA4327	Condenser lens
Mounted precision pinhole	Thorlabs	P50S	Spatial filtering
Single mode fiber patch cable	Thorlabs	P1-460B-FC-1	Single mode fiber
Fiber coupler	Newport	F-91-C1	Single mode coupling
Achromatic doublet lens	Edmund Optics	32-317	Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror	Thorlabs	PFE10-P01	Mirror
Right angle kinematic mirror mount	Thorlabs	KCB1	Mirror mount
Z-Axis Translation Mount	Thorlabs	SM1Z	z translator
Lens tube	Thorlabs	SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism	Thorlabs	PS615	Right angle prism
Rhomboid prism	Edmund Optics	47-214	Shear wave
Dimethylpolysiloxane	Sigma Aldrich	DMPS1M	Silicon oil
Amplifier	Mini Circuits	ZFL-500LN	Amplifier
16 bit high speed digitizer	Spectrum	M4i.4420	Data acquisition card
Oscilloscope	Agilent Technologies	DS06014A
Mice	InVivos Pte.Ltd	ICR	Animal model
Ultrasound gel	Progress/parker acquasonic gel	PA-GEL-CLEA-5000	Acoustic coupling
Water tank	Home made
Translation stage	Homemade		Switching AR-OR
Gold nanoparticles	Sigma Aldrich	742031	Lateral resolution
Sterile ocular ointment	Alcon	Duratears	Animal imaging
1951 USAF resolution test target	Edmund Optics	38257	Confocal alignment
Data acquisition software	National Instrument	Labview	Home made software using Labview
Image Processing software	Mathworks	Matlab	Home made program using Matlab