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要約

ここでは、インビボで同じ試料上の浅い深度での高分解能画像化と低分解能深部組織画像化の両方が可能な切り替え可能な音響分解能（AR）および光学分解能（OR）光音響顕微鏡法（AR-OR-PAM）

要約

光音響顕微鏡法（PAM）は、オプティクスと超音波の両方を組み合わせた高速成長型のインビボイメージングモダリティであり、光学的平均自由行程（肌で1mm以下）を超えて高分解能で侵入します。単一のモダリティで超音波の高空間分解能と光吸収コントラストを組み合わせることにより、この技術は深部組織に浸透することができます。光音響顕微鏡検査システムは、音響分解能が低く、プローブが深く、または光学分解能が高く、プローブが浅くてもよい。単一のシステムで高い空間分解能と深度の浸透を達成することは困難です。この研究は、浅い深度での高解像度イメージングとインビボでの同じサンプルの低解像度深部組織イメージングの両方が可能なAR-OR-PAMシステムを提示する。光学集束を用いた1.4mmの撮像深度を有する4μmの横分解能と、音響集束を用いた7.8mmの撮像深度を有する45μmの横分解能が成功した組み合わせたシステムを使って実証されました。ここで、生体内での小動物の血管系画像化を行って、その生物学的イメージング能力を実証する。

概要

光干渉断層撮影法、共焦点顕微鏡法、および多光子顕微鏡法などの高分解能光画像化様式は、多数の利点を有する。しかしながら、空間分解能は、撮像深度が増加するにつれて著しく減少する。これは、軟組織1,2における光輸送の拡散性のためである。光励起と超音波検出の統合は、深部組織における高解像度光学イメージングの課題を克服する解決策を提供する。光音響顕微鏡（PAM）は、他の光学イメージング様式よりも深いイメージングを提供することができるそのような様相の1つである。これは、インビボの構造的、機能的、分子的および細胞イメージングに首尾よく適用されている3,4,5,6,7,8 、 > 9,10,11,12,13の研究を行った。

PAMでは、短いレーザーパルスが組織/試料を照射する。発色団（ 例えば、メラニン、ヘモグロビン、水など ）による光の吸収は、温度上昇をもたらし、その結果、音響波（光音響波）の形態の圧力波が生成される。生成された光音響波は、組織境界外の広帯域超音波変換器によって検出することができる。弱い光学的およびタイトな音響集束を利用して、深部組織撮像は音響解像度光音響顕微鏡（AR-PAM）14,15,16において達成することができる。 ARでは-PAM、45μmの横方向分解能、3mmまでの撮像深度が実証されている15 。単一毛細管（約5μm）を音響的に解決するためには、> 400MHzの中心周波数で動作する超音波トランスデューサが必要である。このような高い周波数では、侵入深さは100μm未満である。タイトな光学的集束を使用して、密着した音響集束によって生じる問題を解決することができる。光学的解像度光音響顕微鏡法（OR-PAM）は、単一の毛細血管または単一の細胞17を分解することができ、0.5μmの横方向分解能は18,19,20,21,22,23,24に達している。フォトニックナノジェットの使用は、回折限界解像度以上の解像度を達成するのに役立ちますn 25,26 。 OR-PAMでは、光の集束のために侵入深さが制限され、生物組織23の内部で約1.2mmまで撮像することができる。従って、AR-PAMはより深く、より低い解像度で画像を形成することができ、OR-PAMは、非常に高い解像度で画像化することができるが、画像深度は限られる。 AR及びOR-PAMシステムの画像化速度は、主として、レーザ光源27のパルス繰り返し速度に依存する。

AR-PAMとOR-PAMを組み合わせることは、高解像度と深い画像の両方を必要とするアプリケーションに大きな利点となります。これらのシステムを組み合わせるための努力はほとんどなされていない。通常、2つの異なるイメージングスキャナがイメージングに使用され、これはサンプルが両方のシステム間を移動することを必要とし、したがってインビボイメージングを実行することを困難にする。しかしながら、AR及びOR PAMの両方を用いたハイブリッド撮像は、スケーラブルな解像度深さ。 1つのアプローチでは、ARおよびOR PAMの両方の光を送達するために光ファイババンドルが使用される。このアプローチでは、2つの別々のレーザー（ARの場合は570 nmの高エネルギーレーザーとORの場合は532 nmの低エネルギー、高繰り返しレーザー）が使用され、システムが不便で高価になります。 OR-PAMレーザーの波長は固定されており、酸素飽和度などの多くの研究は、この複合システムを使用しては不可能です。 ARとOR PAMとの比較研究は、ARとORとの間のレーザ波長の違いのためにも不可能である。さらに、AR-PAMは明視野照明を使用する。したがって、皮膚表面からの強い光音響信号が画質を制限する。このため、このシステムは多くのバイオイメージングアプリケーションには使用できません。 ARおよびOR PAMを実行する別の手法では、光学的および超音波的な焦点がシフトされ、光の焦点および超音波の焦点の位置合わせが不整合になる。したがって、画質は最適ではない 29。この技術を使用すると、AR-PAMおよびOR-PAMは、それぞれ139μmおよび21μmの分解能しか達成できず、分解能の低いシステムになります。光ファイバーとコリメート光学系を変更することを含むもう1つのアプローチは、ARとOR PAMの間で切り替えることが報告されています。これらのすべての場合において、AR-PAMは暗視野照明を使用しなかった。暗視野照明の使用は、皮膚表面からの強い光音響信号の生成を低減することができる。したがって、深い光音響信号の検出感度が明視野照明の検出感度に比べて高いので、リング状照明を用いて深部組織撮像を行うことができる。

この研究は、両方の嚢に対して同じレーザーとスキャナーを使用して、同じサンプルの高分解能イメージングと低分解能深部組織イメージングの両方が可能な切り替え可能なARおよびOR PAM（AR-OR-PAM）イメージングシステムを報告していますems。 AR-OR-PAMシステムの性能は、ファントム実験を用いて空間分解能および画像深度を決定することによって特徴付けられた。 インビボでの血液血管造影画像をマウスの耳に対して実施して、その生物学的イメージング能力を実証した。

プロトコル

すべての動物実験は、シンガポール南陽技術大学の動物実験および使用委員会（Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263）の認可された規制およびガイドラインに従って行われた。

AR-OR-PAMシステム（ 図1 ）

  1. システム構成：AR-PAM
    1. ダイオード励起、固体状態のNd-YAGレーザー（532 nm）と、光照射源として559〜576 nmの可変範囲を有する色素レーザーからなるナノ秒の可変レーザーシステムを使用する。外部コントローラを使用してレーザー波長を570 nmに設定し、レーザーソフトウェアを使用してレーザーの繰り返し速度を1 kHzに設定します。
    2. ビームサンプラーをレーザーの前に45°の角度で置き、可変中性密度フィルター（NDF1; OD = 0-4.0）を介してレーザー出力の5％をフォトダイオードにそらす。
    3. ビームサンプラーの後で90°でレーザービームを方向転換する直角プリズム（RAP1）である。
    4. 別の直角プリズム（RAP2）を使用して、可変中性密度フィルター（NDF2; OD = 0-4.0）とマルチモードファイバー（MMF）を通過させ、ファイバーカプラー（FC）-a対物レンズの組み合わせ（開口数（NA）：0.25）およびXYトランスレータ。
    5. XYトランスレータを使用して、ファイバを走査ステージに固定します。ファイバー出力端から25 mm離れた平凸レンズ（L1）を置き、ファイバーからビームをコリメートします。
    6. コリメートされたビームを頂角130°の円錐レンズに通して、リング状のビームを生成する。コーンアングル70°と110°の自家製光学コンデンサー（OC）を使用し、中心に穴をあけて、リング状のビームを被写体に弱く集中させます。
    7. ホームメイドコンデンサーの中央に音響レンズ（AL）付きの50 MHz超音波トランスデューサー（UST）を置きます。
  2. システム構成：OR-PAM
    1. 使うダイオード励起、固体状態のNd-YAGレーザ（532nm）と、559〜576nmの可変範囲を有する色素レーザとからなるナノ秒可変レーザシステムを光照射源として使用する。外部コントローラを使用してレーザー波長を570 nmに設定し、レーザーソフトウェアを使用して5 kHzでレーザーの繰り返し速度を設定します。
    2. コンピュータ制御の回転ステージ（RAP1を保持）を90°回転させて、レーザービームをアイリス上に向けて整形し直します。
    3. 可変中性密度フィルター（OD：0〜4.0）をビームに沿って配置し、集光レンズ（CL）でビームを集束させるレーザービームを減衰させます。空間フィルタリングのためにCLから75 mm離れたピンホール（PH）に通してください。
    4. SMFに光ビームを集束させるための0.1NAの対物レンズからなるシングルモードファイバーカプラー（FC）を使用して、空間的にフィルターされたビームをシングルモードファイバー（SMF）に照射します。
    5. ファイバーカプラーを調整して最大の結合効率を達成してください。
    6. ファイバをtに固定します。スリッププレート（SP）を用いてステージを走査する。レーザ光をコリメートするために、無色レンズ（L2）をSMファイバから50mm離して置きます。
    7. 別の同一の色消しレンズ（L3）の背面開口部を満たすために、キネマティックに制御可能な楕円鏡（M）を使用して、平行化されたビームを90°に向けてください。レンズチューブ（LT）を使用して、焦点合わせに使用する色消しレンズを平行移動マウント（TM2）に置きます。
    8. 集束ビームを直角プリズム（RA）と菱形プリズム（RP）からなる手作りの光音響ビーム結合器に通し、その間にシリコンオイル（SO）の層を置きます。
      注：シリコンオイル層は、光学的に透明で音響的に反射する膜として機能します。
    9. 菱形プリズムの底面に音響レンズ（AL）を取り付けて、音響焦点（焦点直径：約46μm）を与えます。
    10. 菱形プリズムの上に50MHzの中心周波数を持つ超音波トランスデューサを置く。効果的な結合のためにエポキシ層を使用する。

2.システムの切り替えとアライメント

  1. 手作りの切り替え可能なプレートを、コンピュータに接続された3軸コントローラによって制御される3軸電動ステージに固定する（しっかりとねじ込む）。
  2. ケージ取り付けブラケットを使用して自家製プレートにARおよびORケージシステムを取り付けると、ARおよびORスキャンヘッドを簡単に切り替えることができます。スキャンヘッドをイメージング領域の上にスライドさせます。
  3. AR-OR-PAMスキャナーヘッドの底部を水で満たされたアクリル製タンク（13 cm x 30 cm x 3 cm）に浸して音響結合します。
  4. タンクの底板に直径7cmの画像ウィンドウを開き、光学的および音響的伝達のためにポリエチレン膜でシールします。
  5. パルスエコーアンプとオシロスコープを使用して、超音波トランスデューサの焦点を合わせます。
    1. 送信/受信モードでパルスエコーアンプのゲインを24 dbに設定します。
    2. 同期アウト信号frを使用するオシロスコープをトリガとし、オシロスコープを使用してスライドガラス（水槽の底部から挿入）から後方散乱信号を検出します。
      注：スライドには黒いテープが貼られているはずです。
    3. Z軸を動かして、パルスエコー信号の振幅を最大にします（オシロスコープで表示）。
      注：ガラス板にフォーカスがあると、エコーの振幅は最大になります。
  6. レーザーのスイッチを入れ、BNCケーブルを使用してUSTを2つのアンプに接続し、それぞれ24dBの固定ゲインを接続します。
    注：アンプの出力はデータ集録カード（DAQ）に接続されています。
  7. レーザーの前面にあるフォトダイオード（PD）からの信号を、データ集録システムのトリガーとして使用します。
  8. AR-PAMでは、円錐レンズ（con.L）と光凝縮器（OC）の距離を変えて、試験対象から生成された光音響信号の振幅を最大化します（ガラススライド上に黒いテープが貼り付けられます）。最大光音響（PA）信号振幅を決定することにより、光学焦点と音響焦点が共焦点であることを確認します。
    1. 最大PA信号の遅延に注意してください。これを後で使用して、データ集録ソフトウェアの焦点を確認してください。
  9. スキャンヘッドのネジを緩め、スキャンヘッドを手動でAR-PAMからOR-PAMに切り替えます。次に、ネジを締めます。
  10. OR-PAMでは、オシロスコープに表示されているPA信号の振幅を最大にするために、収束する無彩色ダブレット（レンズチューブ（LT）の内側）とオプトアコースティックコンバイナの間の距離を変えます。
    1. 最大PA信号の遅延に注意してください。
      注：共焦点配置を決定するには、細分化が必要です。

3.実験ステップ

  1. 横方向分解能および画像深さ定量化
    1. 直径100ナノメートルの金ナノ粒子を使用して、ARの側方分解能を決定する。d ORシステム。
    2. 等量の水で0.1mLのナノ粒子溶液を希釈する。カバースリップ上に0.1 mLの希釈溶液を分配し、タンクの下のポリエチレンメンブレンに接触させて置きます。
    3. スキャンの前に、AR-PAMとOR-PAMがデータ収集ソフトウェア（表の表を参照）に焦点を合わせていることを確認します（ステップ2.8と2.10）。
      注：サンプリングレート（250 MS / s）を掛けた2.9と2.10のステップからの最大PA信号のマイクロ秒の遅延を知ることによって、画像はデータ収集ソフトウェアでフォーカスされます。データ取得中に省略しなければならない遅延は、後処理のために必要なデータポイントのみを保存するようにソフトウェアで決定することができる。
    4. AR-PAMのスキャンパラメータを設定し、「スキャン」ボタンを押してラスタスキャンを開始します。
      1. データ収集ソフトウェアのAR-PAMのスキャンパラメータを「速度」の「4」mm / sスキャン速度で設定します。; 「パルス繰返し率」タブでは「1」kHz、「Yスキャン範囲」タブでは「0.5」mm、「Xスキャン範囲」タブでは「0.5」mmである。 dxタブのx方向のステップサイズを "4"μmに設定します。
        注：y方向のステップサイズは、ステージのスキャン速度速度とパルス繰り返し速度（この場合、4,000μm/ 1,000 Hz = 4μm）から自動的に決定されます。
    5. OR-PAMのスキャンパラメータを設定し、「スキャン」ボタンを押してラスタスキャンを開始します。
      1. データ収集ソフトウェアのスキャンパラメータを「速度」タブの「2.5」mm / sスキャン速度、「パルス繰り返し速度」タブの「5」kHz、「Yスキャン範囲」の「0.5」mm、タブ、「Xスキャン範囲」タブでは「0.5」mmです。 「dx」タブで、x方向のステップサイズを「0.5」μmに設定します。
        注：sステージの走査速度速度とパルス繰返し速度（この場合2,500μm/ 5,000Hz =0.5μm）からy方向のテップサイズが自動的に決定されます。
    6. スキャン処理中に、データが継続的にキャプチャされ、コンピュータに保存されていることを確認します
      注：データは、Yステージの1つの移動方向にのみキャプチャされます。
    7. コンピュータに保存された複数のBスキャンデータを使用して、画像処理ソフトウェア（ 表の表を参照）を使用して最大振幅投影（MAP）画像を検索します。
    8. 走査からの単一のナノ粒子画像（複数の画像のうちの1つ）を使用して、ナノ粒子画像の中央領域を通る線を手動でプロットして横方向の解像度を決定し、ガウス曲線のような点広がり関数を得る。 図2を参照してください。
    9. Gauを用いて単一のナノ粒子画像から得られた点広がり関数を適合させる画像処理ソフトウェア（ 表の表を参照）を使用して半値全幅（FWHM）を測定します。これを横方向の解像度として使用します。 図2を参照してください。
    10. 奥行き画像のためのターゲットオブジェクトとしてスライスチキンティッシュの一部に斜めに黒いテープを挿入します。水タンクにテープ付きのティッシュを置きます。
      注：黒いテープは、組織にテープを取り付けるのを助ける、鋭い先端を備えた金属プレートに貼り付けられています。
    11. AR-PAMのスキャンパラメータをデータ収集ソフトウェアに設定し、「スキャン」ボタンを押して単一のBスキャン画像をキャプチャして最大画像深度を決定します。
      1. 「速度」タブでは「15」mm / s、「パルス繰返し率」タブでは「1」kHz、「Yスキャン範囲」タブでは「5」cm、 "mm"を "Xスキャン範囲"タブに表示します。セットする「dx」タブの「0.1」mmでのx方向のステップサイズ。
    12. OR-PAMのスキャンパラメータを設定し、「スキャン」ボタンを押して単一のBスキャン画像をキャプチャし、最大イメージング部を決定します。
      1. "速度"タブでは "15" mm / sのスキャン速度、 "パルス繰り返し率"タブでは "5" kHz、 "Yスキャン範囲"では "2" cmとデータ収集ソフトウェアのスキャンパラメータを設定します。 「Xスキャン範囲」タブでは「0.1」mmとなります。 「dx」タブのx方向のステップサイズを「0.1」mmに設定します。
        注：Xスキャン範囲とdxは同じであるため、1つのBスキャンしかキャプチャされません。時間分解されたPA信号に軟組織の音速（1,540m / s）を乗じると、Aライン画像が得られます。 Yステージの連続動作中に複数のAラインが捕捉されてBスキャンが生成される。
  2. インビボで</ em>マウス耳血管系のイメージング
    1. 体重25g、年齢4週の雌マウスを使用する。
    2. ケタミン（120mg / kg）およびキシラジン（16mg / kg）のカクテルを腹腔内注射（0.1mL / 10g投与）して動物を麻酔する。
    3. 脱毛クリームを使用して動物の耳から毛を取り除く。エリアをきれいに拭きます。散乱したレーザービームが眼に当たるのを避けるために、動物の目を滅菌眼軟膏で覆う。
    4. 耳を置くためのミニプレートもあるステージ上に動物を置く。
    5. 撮影期間中、吸入イソフルラン（1L /分酸素で0.75％）で麻酔を維持する。
    6. 脈拍オキシメーターをマウスの脚または尾に締め付け、生理的状態をモニターする。超音波ゲルを用いてイメージング領域をポリエチレン膜と接触させる。
    7. AR-PAMのスキャンパラメータを設定し、「スキャン」ボタンを押してラスタスキャンを開始しますing。
      1. データ収集ソフトウェアのAR-PAMのスキャンパラメータを「速度」タブの「15 mm / s」スキャン速度、「パルス繰り返し速度」タブの「1 kHz」、「パルス繰り返し速度」タブの「10 mm」、 「Yスキャン範囲」タブ、および「6スキャン」範囲タブの「6」mmである。 「dx」タブで、x方向のステップサイズを「30」μmに設定します。
        注：y方向のステップサイズは、ステージのスキャン速度速度とパルス繰返し速度（この場合、15,000μm/ 1,000 Hz = 15μm）から自動的に決定されます。
    8. AR-PAMスキャンが終了したら、イメージングヘッドの位置をAR-PAMからOR-PAMに切り替えます（セクション2を参照）。
    9. OR-PAMのスキャンパラメータを設定し、「スキャン」ボタンを押してラスタスキャンを開始します。
      1. データ収集ソフトウェアのOR-PAMのスキャンパラメータを「15mm / sスキャン速度」の「速度「Yスキャン範囲」タブでは「10」mm、「Xスキャン範囲」タブでは「6」mmとすることができる。 x方向に「dx」タブの「6」μmと表示されます。
        注：y方向のステップサイズは、ステージのスキャンスピードとパルス繰り返しレート（この場合、15,000μm/ 5,000 Hz = 2μm）から自動的に決定されます。
    10. コンピュータに保存された複数のBスキャンデータを使用して、画像処理ソフトウェアを使用してMAP画像を検索します。
    11. 撮影期間全体を通して動物を観察する。

結果

AR-OR-PAMシステムの概略図を図1に示します 。このセットアップでは、すべてのコンポーネントが光学ケージの設定で統合され、組み立てられました。ケージシステムを使用することにより、AR-OR-PAM走査ヘッドがコンパクトになり、単一の走査ステージ上に容易に組み立てられ、位置合わせされ、一体化される。

ディスカッション

結論として、より低いイメージング深度で高解像度イメージングとより高いイメージング深度で低解像度イメージングの両方を達成できる切り替え可能なARおよびOR PAMシステムが開発された。切り換え可能なシステムの横方向分解能および画像深度が決定された。この切り替え可能なPAMシステムの利点は、（1）きつい光学的集束を使用する高解像度イメージング、 （2）音響集束を用いた深?...

開示事項

すべての動物実験は、シンガポール南陽技術大学の動物実験および使用委員会（Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263）の承認されたガイドラインおよび規制に従って行われた。著者は、原稿に関連する金銭的関心はなく、開示する可能性のある他の利益相反はない。

謝辞

著者は、シンガポールの教育省（ARC2 / 15：M4020238）が資金を提供するTier 2助成金からの財政的支援を認めたいと考えています。著者は機械ショップの助けを借りてChow Wai Hoong Bobbyに感謝したいと思います。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Q-switched Nd:YAG laserEdgewaveBX80-2-LPump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye LaserSpectra physicsCREDO-DYE-NDye laser
Precision Linear StagePhysik InstrumentePLS 85 XY raster scanning stage
Translation stagePhysik InstrumenteVT 80 Confocal determine
Mounted Silicon photodiodeThorlabsSM05PD1ATriggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage ThorlabsCR1/M-Z7Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND FilterThorlabsNDC-50C-4MIntensity variable
Fiber Patch CableThorlabsM29L01Multimode fiber
Microscope objectiveNewportM-10XObjective 
XY translating mountThorlabsCXY1Translating mount
Plano convex lensThorlabsLA1951Collimating lens
Conical lens AltechnaAPX-2-B254Ring shape beam
Translation stageThorlabsCT1Translating stage
Optical condenserHome made
Ultrasonic transducerOlympus-NDTV214-BB-RM50MHz transducer
Plano concave lensThorlabsLC4573Acoustic lens
Pulser/ReceiverOlympus-NDT5073PRPulse echo amplifier 
Mounted standard irisThorlabsID12/MBeam shaping
Plano convex lensThorlabsLA4327Condenser lens
Mounted precision pinholeThorlabsP50SSpatial filtering
Single mode fiber patch cableThorlabsP1-460B-FC-1Single mode fiber
Fiber couplerNewportF-91-C1Single mode coupling
Achromatic doublet lensEdmund Optics32-317Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirrorThorlabsPFE10-P01Mirror
Right angle kinematic mirror mountThorlabsKCB1Mirror mount
Z-Axis Translation MountThorlabsSM1Zz translator
Lens tubeThorlabsSM05L10
UV Fused Silica Right-Angle PrismThorlabsPS615Right angle prism
Rhomboid prismEdmund Optics47-214Shear wave
DimethylpolysiloxaneSigma AldrichDMPS1MSilicon oil
AmplifierMini CircuitsZFL-500LNAmplifier
16 bit high speed digitizerSpectrumM4i.4420Data acquisition card
OscilloscopeAgilent TechnologiesDS06014A
Mice InVivos Pte.LtdICRAnimal model
Ultrasound gel Progress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000Acoustic coupling
Water tankHome made
Translation stageHomemadeSwitching AR-OR
Gold nanoparticlesSigma Aldrich742031Lateral resolution
Sterile ocular ointmentAlconDuratearsAnimal imaging
1951 USAF resolution test targetEdmund Optics38257Confocal alignment
Data acquisition softwareNational InstrumentLabviewHome made software using Labview
Image Processing softwareMathworksMatlabHome made program using Matlab

参考文献

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