Microscopia fotoacústica de resolução acústica e óptica comutável para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Vasculatura de Sangue de Pequeno Animal

Resumo

Aqui é demonstrado um sistema de resolução acústica (AR) e resolução óptica (OR) de microscopia fotoacústica (AR-OR-PAM) capaz de obter imagens de alta resolução em profundidade superficial e baixa resolução de imagens de tecido profundo na mesma amostra in vivo .

Resumo

A microscopia fotoacústica (PAM) é uma modalidade de imagem invivo de crescimento rápido que combina tanto a óptica como a ultra-sonografia, proporcionando penetração para além do caminho livre médio óptico (~ 1 mm na pele) com alta resolução. Ao combinar o contraste de absorção óptica com a alta resolução espacial do ultra-som em uma única modalidade, esta técnica pode penetrar nos tecidos profundos. Os sistemas de microscopia fotoacústica podem ter uma baixa resolução acústica e uma sonda profundamente ou uma alta resolução óptica e sondagem superficialmente. É desafiador alcançar alta resolução espacial e grande penetração de profundidade com um único sistema. Este trabalho apresenta um sistema AR-OR-PAM capaz de imagens de alta resolução em profundidades rasas e imagens de tecido profundo de baixa resolução da mesma amostra in vivo . Uma resolução lateral de 4 μm com profundidade de imagem de 1,4 mm usando focagem óptica e uma resolução lateral de 45 μm com profundidade de imagem de 7,8 mm usando focagem acústica foram bem sucedidasDemonstrou o uso do sistema combinado. Aqui, a imagem de vasculatura de sangue de animal pequeno in vivo é realizada para demonstrar sua capacidade de imagem biológica.

Introdução

As modalidades de imagem óptica de alta resolução, como a tomografia de coerência óptica, microscopia confocal e microscopia multiphoton, têm inúmeros benefícios. No entanto, a resolução espacial diminui significativamente à medida que a profundidade da imagem aumenta. Isto é devido à natureza difusa do transporte de luz nos tecidos moles ^{1 , 2} . A integração de excitação óptica e detecção de ultra-som fornece uma solução para superar o desafio da imagem ótica de alta resolução em tecidos profundos. A microscopia fotoacústica (PAM) é uma modalidade que pode proporcionar imagens mais profundas do que outras modalidades de imagem óptica. Foi aplicado com sucesso em imagens estruturais, funcionais, moleculares e celulares in vivo ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} , combinando o forte contraste de absorção óptica com a alta resolução espacial do ultra-som.

No PAM, um pulso laser curto irradia o tecido / amostra. A absorção de luz por cromóforos ( por exemplo, melanina, hemoglobina, água, etc. ) resulta em um aumento de temperatura, o que, por sua vez, resulta na produção de ondas de pressão sob a forma de ondas acústicas (ondas fotoacústicas). As ondas fotoacústicas geradas podem ser detectadas por um transdutor ultra-sônico de banda larga fora do limite do tecido. Utilizando fraca focagem acústica óptica e apertada, a imagem em tecido profundo pode ser alcançada em microscopia fotoacústica de resolução acústica (AR-PAM) ^{14 , 15 , 16} . Em AR-PAM, uma resolução lateral de 45 μm e uma profundidade de imagem de até 3 mm foram demonstradas ¹⁵ . Para resolver capilares únicos (~ 5 μm) acústicamente, são necessários transdutores ultra-sônicos que operam em freqüências centrais de 400 MHz. Em tais freqüências altas, a profundidade de penetração é inferior a 100 μm. O problema causado pela focagem acústica apertada pode ser resolvido usando focagem ótica apertada. A microscopia fotoacústica de resolução óptica (OR-PAM) é capaz de resolver capilares únicos, ou mesmo uma única célula ¹⁷ , e uma resolução lateral de 0,5 μm foi alcançada ^{18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24} . O uso de um nanojet fotônico pode ajudar a alcançar uma resolução além da resolução de difração limitadaN ^{25 , 26} . Em OR-PAM, a profundidade de penetração é limitada devido à focagem leve e pode representar uma imagem até ~ 1,2 mm dentro do tecido biológico ²³ . Portanto, AR-PAM pode imagem mais profunda, mas com uma resolução menor, e OR-PAM pode imagem com uma resolução muito alta, mas com profundidade de imagem limitada. A velocidade de imagem do sistema AR e OR-PAM depende principalmente da taxa de repetição de pulso da fonte laser ²⁷ .

A combinação de AR-PAM e OR-PAM será de grande benefício para aplicativos que exigem uma imagem de alta resolução e imagem mais profunda. Pouco esforço foi feito para combinar esses sistemas juntos. Normalmente, dois scanners de imagem diferentes são usados ​​para imagens, o que requer que a amostra seja movida entre os dois sistemas, dificultando assim a realização de imagens in vivo . No entanto, a imagem híbrida com AR e OR PAM permite a imagem com resoluções escaláveis ​​aE profundidades. Em uma abordagem, um feixe de fibra óptica é usado para fornecer luz tanto para AR como para OR PAM. Nesta abordagem, são utilizados dois laser separados (um laser de alta energia a 570 nm para o AR e um laser de baixa energia e alta repetição a 532 nm para o OR), o que torna o sistema inconveniente e caro ²⁸ . O comprimento de onda do laser OR-PAM é fixo, e muitos estudos, como a saturação de oxigênio, não são possíveis usando esse sistema combinado. Estudos comparativos entre AR e OR PAM também não são possíveis devido à diferença nos comprimentos de onda do laser entre o AR e o OR. Além disso, AR-PAM usa iluminação de campo brilhante; Portanto, sinais fortes fotoacústicos da superfície da pele limitam a qualidade da imagem. Por este motivo, o sistema não pode ser usado para muitas aplicações de bioimagem. Em outra abordagem para executar AR e OR PAM, o foco óptico e ultra-som é deslocado, o que torna o foco da luz e o foco ultra-sonográfico desalinhados. Assim, a qualidade da imagem não é otimizada ^{29. Usando esta técnica, o AR-PAM e o OR-PAM podem alcançar apenas resoluções de 139 μm e 21 μm, respectivamente, tornando-o um sistema de baixa resolução. Outra abordagem, que inclui a mudança da fibra óptica e das opticas colimantes, foi relatada para alternar entre AR e OR PAM, tornando o processo de alinhamento difícil 30 . Em todos estes casos, AR-PAM não usou iluminação de campo escuro. O uso da iluminação do campo escuro pode reduzir a geração de sinais fotoacústicos fortes da superfície da pele. Portanto, a imagem de tecido profundo pode ser realizada usando iluminação em forma de anel, pois a sensibilidade de detecção de sinais fotoacústicos profundos será maior que a de iluminação de campo brilhante.}

Este trabalho relata um sistema de imagem AR e OR PAM (AR-OR-PAM) comutável, capaz tanto de imagem de alta resolução quanto de imagem de baixa resolução de tecido profundo da mesma amostra, usando o mesmo laser e scanner para ambos os sistemasEms. O desempenho do sistema AR-OR-PAM foi caracterizado pela determinação da resolução espacial e da profundidade da imagem usando experiências fantasmas. A imagem de vasculatura de sangue in vivo foi realizada em uma orelha de rato para demonstrar sua capacidade de imagem biológica.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Tecnológica de Nanyang, Cingapura (Número de Protocolo Animal ARF-SBS / NIE-A0263).

1. Sistema AR-OR-PAM ( Figura 1 )

1. Configuração do sistema: AR-PAM
   1. Use um sistema a laser tunelável de nanosegundos consistindo de um laser de Nd-YAG com bombeamento diodo-bombeado (532 nm) e um laser de corante com uma faixa de tunability de 559-576 nm como fonte de irradiação óptica. Ajuste o comprimento de onda do laser para 570 nm usando um controlador externo e a taxa de repetição do laser para 1 kHz usando o software laser.
   2. Coloque uma amostra de feixe com um ângulo de 45 ° na frente do laser para desviar 5% da potência do laser para um fotodiodo através de um filtro de densidade neutro variável (NDF1; OD = 0-4.0).
   3. Desviar o raio laser após a amostragem do feixe a 90 ° usandoUm prisma de ângulo reto (RAP1).
   4. Use outro prisma de ângulo reto (RAP2) para permitir que o feixe passe através de um filtro de densidade neutro variável (NDF2; OD = 0-4.0) e em uma fibra multimodo (MMF), dirigindo-o através de um acoplador de fibra (FC) -a Combinação de objetivos (abertura numérica (NA): 0,25) e um tradutor XY.
   5. Corrija a fibra no estágio de digitalização usando um tradutor XY. Coloque uma lente plano-convexa (L1) a 25 mm da extremidade de saída da fibra para colimar o feixe para fora da fibra.
   6. Passe o feixe colimado através de uma lente cônica com um ângulo de vértice de 130 ° para gerar um feixe em forma de anel. Focalize fraco o feixe em forma de anel no sujeito usando um condensador óptico caseiro (OC) com ângulos de cone de 70 ° e 110 ° e com um furo no centro.
   7. Coloque um transdutor ultra-sônico de 50 MHz (UST) com uma lente acústica (AL) no centro do condensador caseiro.
2. Configuração do sistema: OR-PAM
   1. Use umSistema a laser sintonizável de nanosegundos consistindo de um laser Nd-YAG de bombeamento diodo-bombeado (532 nm) e um laser de corante com uma faixa de tunability de 559 - 576 nm como fonte de irradiação óptica. Defina o comprimento de onda do laser a 570 nm usando um controlador externo e a taxa de repetição do laser a 5 kHz usando o software laser.
   2. Gire o estágio de rotação controlado pelo computador (segurando o RAP1) em 90 ° para desviar o raio laser para uma íris para remodelar.
   3. Atenuar o feixe de laser colocando um filtro de densidade neutro variável (OD: 0-4.0) ao longo do feixe e, em seguida, concentre o feixe com uma lente de condensador (CL). Passe por um pinhole (PH) a 75 mm do CL para filtragem espacial.
   4. Lance o feixe filtrado espacialmente em uma fibra de modo único (SMF) usando um acoplador de fibra de modo único (FC) consistindo de um objetivo de 0,1 NA para focar o feixe de luz no SMF.
   5. Ajuste o acoplador de fibra para obter a máxima eficiência de acoplamento.
   6. Corrija a fibra para fora em tEtapa de varredura usando uma placa deslizante (SP). Coloque uma lente acromática (L2) a 50 mm da fibra SM para colimar o raio laser.
   7. Desvie o raio colimado em 90 ° usando um espelho elíptico controlável cinemático (M) para preencher a abertura traseira de outra lente acromática idêntica (L3). Coloque a lente acromática usada para focar em um suporte de tradução (TM2) usando um tubo de lente (LT).
   8. Passe o feixe de focagem através de um combinador de feixe optoacústico caseiro consistindo em um prisma de ângulo reto (RA) e um prisma de romboide (RP), com uma camada de óleo de silício (SO) no meio.
      NOTA: A camada de óleo de silício atuará como filme transparente e transparente acústica.
   9. Anexe uma lente acústica (AL) para fornecer focagem acústica (diâmetro focal: ~ 46 μm) na parte inferior do prisma romboidais.
   10. Coloque o transdutor ultra-sônico com uma freqüência central de 50 MHz em cima do prisma romboidal; Use uma camada de epoxi para acoplamento efetivo.

2. Comutação e Alinhamento do Sistema

1. Fixar (apertando firmemente) a placa comutável caseira para um estágio motorizado de 3 eixos controlado por um controlador de 3 eixos conectado ao computador.
2. Anexe o sistema de gaiolas AR e OR à placa caseira usando suportes de montagem de gaiola para permitir uma fácil troca entre as cabeças de varredura AR e OR. Deslize a cabeça de digitalização na parte superior da área de imagem.
3. Use o andar Z para submergir a parte inferior da cabeça do scanner AR-OR-PAM em um tanque de acrílico cheio de água (13 cm x 30 cm x 3 cm) para acoplamento acústico.
4. Abra uma janela de imagem com um diâmetro de 7 cm na placa inferior do tanque e selá-la com uma membrana de polietileno para transmissão óptica e acústica.
5. Use um amplificador de eco de pulso e um osciloscópio para alinhar o transdutor de ultra-som em foco.
   1. Defina o ganho no amplificador de eco de pulso para 24 db no modo de transmissão / recepção.
   2. Use o sinal de sincronização frOm o amplificador de eco de pulso como o gatilho e detectar o sinal retrodifusado de um slide de vidro (inserido no fundo do tanque de água) usando um osciloscópio.
      NOTA: O slide deve ter uma fita preta presa a ele.
   3. Mova o eixo Z para maximizar a amplitude do sinal de eco de pulso (visto no osciloscópio).
      NOTA: Quando a placa de vidro está em foco, o eco terá sua amplitude máxima.
6. Ligue o laser e conecte o UST a dois amplificadores, cada um com um ganho fixo de 24 dB, usando cabos BNC.
   NOTA: As saídas dos amplificadores estão conectadas ao cartão de aquisição de dados (DAQ).
7. Use o sinal do fotodiodo (PD) colocado na frente do laser como um gatilho para o sistema de aquisição de dados.
8. Em AR-PAM, variar a distância entre a lente cônica (con.L) eo condensador óptico (OC) para maximizar a amplitude do sinal fotoacústico gerado a partir do objeto de teste (fita preta presa em um slide de vidro).Certifique-se de que os focos ópticos e acústicos sejam confocais ao determinar a amplitude de sinal fotoacústica máxima (PA).
   1. Observe o atraso dos sinais máximos de PA; Use isso mais tarde para verificar o foco no software de aquisição de dados.
9. Solte o parafuso da cabeça de varredura e troque manualmente a cabeça de digitalização de AR-PAM para OR-PAM. Em seguida, aperte os parafusos.
10. Em OR-PAM, variar a distância entre o dupleto acromático de focagem (dentro do tubo da lente (LT)) e o combinador optoacústico para maximizar a amplitude do sinal PA mostrada no osciloscópio.
    1. Observe o atraso dos sinais máximos de PA.
       NOTA: Finetuning é necessário para determinar o arranjo confocal.

3. Etapas experimentais

1. Resolução lateral e quantificação de profundidade de imagem
   1. Use nanopartículas de ouro com 100 nm de diâmetro para determinar a resolução lateral da AR eD OU sistema.
   2. Diluir 0,1 mL de solução de nanopartículas com uma quantidade igual de água. Distribua 0,1 mL de solução diluída em uma folha de cobertura e coloque-a em contato com a membrana de polietileno embaixo do tanque.
   3. Certifique-se de que o AR-PAM e o OR-PAM estão focados no software de aquisição de dados (consulte a Tabela de Materiais) antes da digitalização (passos 2.8 e 2.10).
      NOTA: Ao conhecer o atraso de microssegundos dos sinais PA máximos das etapas 2.9 e 2.10, multiplicado pela taxa de amostragem (250 MS / s), a imagem estará focada no software de aquisição de dados. O atraso que deve ser omitido durante a aquisição de dados pode ser determinado no software de modo a salvar apenas os pontos de dados necessários para pós-processamento.
   4. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
      1. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM no software de aquisição de dados em "4" mm / s velocidade de digitalização na "velocidade"; Guia "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "0,5" mm na guia "Y-scan range" e "0,5" mm na aba "X-scan range". Defina o tamanho do passo na direção x em "4" μm na guia "dx".
         NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm)
   5. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
      1. Defina os parâmetros de varredura no software de aquisição de dados a uma velocidade de varredura de "2,5" mm / s na guia "velocidade", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "0,5" mm na "faixa de varredura Y" Guia e "0,5" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho do passo na direção x um "0,5" μm na aba "dx".
         NOTA: o sO tamanho do tep na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 2.500 μm / 5.000 Hz = 0.5 μm).
   6. Certifique-se de que durante o processo de digitalização, os dados são continuamente capturados e armazenados no computador
      NOTA: Os dados serão capturados apenas em uma direção de movimento do estágio Y.
   7. Use os vários dados de B-scan armazenados no computador para recuperar as imagens de projeção de amplitude máxima (MAP) usando software de processamento de imagem (consulte a Tabela de Materiais ).
   8. Use uma única imagem de nanopartícula (de várias imagens) a partir da varredura para determinar a resolução lateral, traçando manualmente uma linha através da região central da imagem de nanopartículas para obter uma função de propagação de pontos, que se parece com a curva gaussiana. Veja a Figura 2 .
   9. Ajustar a função de propagação de pontos obtida a partir de uma única imagem de nanopartículas usando um GauSsian fit function e medir a largura total a meio máximo (FWHM) usando software de processamento de imagem (veja a Tabela de Materiais ). Use isso como a resolução lateral. Veja a Figura 2 .
   10. Insira um pedaço de fita preta obliquamente sobre um pedaço de tecido de frango fatiado como objeto alvo para imagens em profundidade. Coloque o tecido com a fita no tanque de água.
       NOTA: A fita preta está presa a uma placa de metal com uma ponta afiada, o que ajuda a prender a fita no tecido.
   11. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM no software de aquisição de dados e, em seguida, pressione o botão "digitalizar" para capturar uma única imagem B-scan para determinar a profundidade máxima de imagem.
       1. Defina os parâmetros de varredura a uma velocidade de varredura de "15" mm / s na guia "velocidade", "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "5" cm na guia "Y-scan range" e "0.1 "Mm na guia" Varredura X-scan ". Set tEle pisa o tamanho na direção x em "0,1" mm na aba "dx".
   12. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para capturar uma única imagem de B-scan para determinar o departamento de imagens máximo.
       1. Defina os parâmetros de varredura no software de aquisição de dados como "15" mm / s velocidade de digitalização na guia "velocidade", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "2" cm no "intervalo de varredura Y" Guia e "0,1" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho da etapa na direção x em "0,1" mm na guia "dx".
          NOTA: uma vez que o alcance X-scan e dx são os mesmos, apenas uma B-scan será capturada. Os sinais de PA resolvidos no tempo multiplicados pela velocidade do som em tecidos macios (1.540 m / s) darão uma imagem da linha A. Várias linhas A são capturadas durante o movimento contínuo do estágio Y para produzir um B-scan.
2. In vivo </ Em> imagem da vasculatura do sangue da orelha do mouse
   1. Use um mouse fêmea com peso corporal de 25 g e uma idade de 4 semanas.
   2. Anestesiar o animal usando um coquetel de cetamina (120 mg / kg) e xilazina (16 mg / kg) injetados intraperitonealmente (dose de 0,1 mL / 10 g).
   3. Retire o cabelo da orelha animal usando creme de depilação. Limpe a área limpa. Cubra o olho do animal com uma pomada ocular estéril para evitar que o raio laser disperso caia nos olhos.
   4. Posicione o animal em um palco que também tenha uma placa em miniatura para posicionar a orelha.
   5. Manter anestesia com isoflurano inalado (0,75% em 1 L / min de oxigênio) durante o período de imagem.
   6. Aperte um oxímetro de pulso na perna ou cauda do mouse e monitore o estado fisiológico. Permitir que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando um ultra-som.
   7. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar o scannIng.
      1. Defina os parâmetros de varredura do AR-PAM no software de aquisição de dados a uma velocidade de varredura de "15" mm / s na guia "velocidade", "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "10 mm" na seção " Guia "Varredura Y" e "6" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho do passo na direção x como "30" μm na aba "dx".
         NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm).
   8. Depois de terminar a varredura AR-PAM, mude a posição da cabeça de imagem de AR-PAM para OR-PAM (conforme descrito na seção 2).
   9. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
      1. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM no software de aquisição de dados em "15" mm / s velocidade de varredura no "velocitE "guia", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "10" mm na guia "Varredura Y" e "6" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho da etapa Na direção x como "6" μm na aba "dx".
         NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm).
   10. Use os vários dados de B-scan armazenados no computador para recuperar as imagens do MAP usando o software de processamento de imagem.
   11. Observe o animal durante todo o período de imagem.

Resultados

O esquema do sistema AR-OR-PAM é mostrado na Figura 1 . Nesta configuração, todos os componentes foram integrados e montados em uma configuração de gaiola óptica. O uso de um sistema de gaiola torna a cabeça de varredura AR-OR-PAM compacta e facilmente montada, alinhada e integrada em uma única etapa de digitalização.

A varredura de quadriculação contínua bidimensional da cabeça de i...

Discussão

Em conclusão, foi desenvolvido um sistema AR e OU PAM comutável que pode atingir imagens de alta resolução em profundidades de imagem mais baixas e imagens de baixa resolução em maiores profundidades de imagem. A resolução lateral e a profundidade de imagem do sistema comutável foram determinadas. As vantagens deste sistema PAM comutável incluem: (1) a imagem de alta resolução usando focagem óptica apertada; (2) a imagem profunda do tecido usando focagem acústica; 3) a iluminação do campo escuro para AR-...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q-switched Nd:YAG laser	Edgewave	BX80-2-L	Pump laser
Credo-High Repetition Rate Dye Laser	Spectra physics	CREDO-DYE-N	Dye laser
Precision Linear Stage	Physik Instrumente	PLS 85	XY raster scanning stage
Translation stage	Physik Instrumente	VT 80	Confocal determine
Mounted Silicon photodiode	Thorlabs	SM05PD1A	Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage	Thorlabs	CR1/M-Z7	Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter	Thorlabs	NDC-50C-4M	Intensity variable
Fiber Patch Cable	Thorlabs	M29L01	Multimode fiber
Microscope objective	Newport	M-10X	Objective
XY translating mount	Thorlabs	CXY1	Translating mount
Plano convex lens	Thorlabs	LA1951	Collimating lens
Conical lens	Altechna	APX-2-B254	Ring shape beam
Translation stage	Thorlabs	CT1	Translating stage
Optical condenser	Home made
Ultrasonic transducer	Olympus-NDT	V214-BB-RM	50MHz transducer
Plano concave lens	Thorlabs	LC4573	Acoustic lens
Pulser/Receiver	Olympus-NDT	5073PR	Pulse echo amplifier
Mounted standard iris	Thorlabs	ID12/M	Beam shaping
Plano convex lens	Thorlabs	LA4327	Condenser lens
Mounted precision pinhole	Thorlabs	P50S	Spatial filtering
Single mode fiber patch cable	Thorlabs	P1-460B-FC-1	Single mode fiber
Fiber coupler	Newport	F-91-C1	Single mode coupling
Achromatic doublet lens	Edmund Optics	32-317	Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror	Thorlabs	PFE10-P01	Mirror
Right angle kinematic mirror mount	Thorlabs	KCB1	Mirror mount
Z-Axis Translation Mount	Thorlabs	SM1Z	z translator
Lens tube	Thorlabs	SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism	Thorlabs	PS615	Right angle prism
Rhomboid prism	Edmund Optics	47-214	Shear wave
Dimethylpolysiloxane	Sigma Aldrich	DMPS1M	Silicon oil
Amplifier	Mini Circuits	ZFL-500LN	Amplifier
16 bit high speed digitizer	Spectrum	M4i.4420	Data acquisition card
Oscilloscope	Agilent Technologies	DS06014A
Mice	InVivos Pte.Ltd	ICR	Animal model
Ultrasound gel	Progress/parker acquasonic gel	PA-GEL-CLEA-5000	Acoustic coupling
Water tank	Home made
Translation stage	Homemade		Switching AR-OR
Gold nanoparticles	Sigma Aldrich	742031	Lateral resolution
Sterile ocular ointment	Alcon	Duratears	Animal imaging
1951 USAF resolution test target	Edmund Optics	38257	Confocal alignment
Data acquisition software	National Instrument	Labview	Home made software using Labview
Image Processing software	Mathworks	Matlab	Home made program using Matlab