JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן ברזולוציה אקוסטית להחלפה (AR) ו רזולוציה אופטי (OR) מיקרוסקופית photacoustic (AR-OR-PAM) מערכת המסוגלת הן הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומק רדודים ברזולוציה נמוכה הדמיה רקמה עמוקה על אותו מדגם in vivo הוא הפגינו.

Abstract

מיקרוסקופ Photoacoustic (PAM) הוא מהיר הדמיה invivo מודולציה הדמיה המשלבת הן אופטיקה אולטרסאונד, מתן חדירה מעבר נתיב אופטי אופטי חינם (~ 1 מ"מ בעור) עם רזולוציה גבוהה. על ידי שילוב של ניגוד קליטה אופטי עם רזולוציה מרחבית גבוהה של אולטרסאונד במודל אחד, טכניקה זו יכולה לחדור ברקמות עמוק. מערכות מיקרוסקופיות פוטוקוסטיות יכולות להיות בעלות רזולוציה אקוסטית נמוכה או בדיקה עמוקה או רזולוציה אופטית גבוהה בדיקה רדוד. זה מאתגר להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה חדירה עומק גדול עם מערכת אחת. עבודה זו מציגה מערכת AR-OR-PAM המסוגלת הן הדמיה ברזולוציה גבוהה בעומקים רדודים ברזולוציה נמוכה הדמיה ברקמות עמוק של המדגם אותו in vivo . רזולוציה לרוחב של 4 מיקרומטר עם 1.4 מ"מ עומק הדמיה באמצעות מיקוד אופטי ברזולוציה לרוחב של 45 מיקרומטר עם 7.8 מ"מ עומק הדמיה באמצעות התמקדות אקוסטית היו מוצלחיםהוכיחו באמצעות המערכת המשולבת. הנה, ב vivo קטן vwo דם בעלי חיים הדמיה מבוצעת כדי להדגים יכולת הדמיה ביולוגית שלה.

Introduction

ברזולוציה גבוהה אופנות הדמיה אופטי, כגון טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית, מיקרוסקופיה confocal, ומיקרוסקופ multiphoton, יש יתרונות רבים. עם זאת, רזולוציה מרחבית פוחתת באופן משמעותי ככל עומק הדמיה עולה. זה בגלל אופי מפוזר של תחבורה קלה ברקמות רכות 1 , 2 . שילוב של עירור אופטית ואולטראסאונד אופטי מספק פתרון כדי להתגבר על האתגר של הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה ברקמות עמוק. מיקרוסקופיה פוטוקוסטית (PAM) היא שיטה אחת כזו שיכולה לספק הדמיה עמוקה יותר מאשר אופני הדמיה אופטיים אחרים. זה יושם בהצלחה ב vivo מבניים, תפקודית, מולקולרית, תא הדמיה 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 על ידי שילוב של ניגוד קליטה אופטי חזק עם רזולוציה מרחבית גבוהה מן אולטרסאונד.

ב PAM, דופק לייזר קצר מקריא את הרקמה / מדגם. ספיגת האור על ידי chromophores ( למשל, מלנין, המוגלובין, מים וכו ' ) גורם להגדלת הטמפרטורה, וכתוצאה מכך לייצר את גלי הלחץ בצורה של גלי אקוסטיקה (גלים photacoustic). גלים photacoustic שנוצר יכול להיות מזוהה על ידי מתמר קול רחב Broadband מחוץ לגבולות הרקמות. ניצול המיקוד האקוסטי חלש אופטי הדוק, הדמיה רקמה עמוקה יכולה להיות מושגת ברזולוציה אקוסטית מיקרוסקופיה photacoustic (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . ב AR-PAM, רזולוציה לרוחב של 45 מיקרומטר עומק הדמיה עד 3 מ"מ הודגמו 15 . על מנת לפתור נימים בודדים (~ 5 מיקרומטר) אקוסטי, מתמרים קוליים הפועלים ב> 400 MHz תדרים מרכזיים נדרשים. בתדרים גבוהים כאלה, עומק החדירה הוא פחות מ -100 מיקרומטר. הבעיה הנגרמת על ידי מיקוד אקוסטי הדוק ניתן לפתור באמצעות מיקוד אופטי הדוק. רזולוציה אופטית מיקרוסקופית פוטוקוסטית (OR-PAM) מסוגלת לפתור נימים בודדים, או אפילו תא בודד 17 , ורזולוציה לרוחב של 0.5 מיקרומטר הושגה 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . השימוש nanojet פוטוניים יכול לעזור להשיג החלטה מעבר לפתרון מוגבל עקיפהN 25 , 26 . ב OR-PAM, עומק החדירה מוגבל בשל התמקדות אור, והוא יכול תמונה עד ~ 1.2 מ"מ בתוך הרקמה הביולוגית 23 . לכן, AR-PAM יכול תמונה עמוקה יותר, אבל עם רזולוציה נמוכה יותר, ו- OR-PAM יכול תמונה עם רזולוציה גבוהה מאוד, אבל עם עומק הדמיה מוגבל. מהירות ההדמיה של מערכת AR ו- OR-PAM תלויה בעיקר בשיעור הדופק של מקור הלייזר 27 .

שילוב AR-PAM ו- OR-PAM יהיה בעל תועלת רבה ליישומים הדורשים הן רזולוציה גבוהה והן הדמיה עמוקה יותר. נעשה מאמץ קטן לשלב מערכות אלה יחד. בדרך כלל, שני סורקי הדמיה שונים משמשים הדמיה, אשר דורש כי המדגם יועברו בין שתי המערכות, ובכך מקשה לבצע הדמיה vivo . עם זאת, הדמיה היברידית עם שניהם AR ו - PAM או מאפשר הדמיה עם החלטות להרחבה אNd מעמקים. בגישה אחת, צרור סיבים אופטיים משמש כדי לספק אור הן AR ו- PAM. בגישה זו, שני לייזר לייזרים (לייזר אנרגיה גבוהה ב 570 ננומטר עבור AR ו אנרגיה נמוכה, שיעור חזרות גבוהה לייזר ב 532 ננומטר עבור OR) משמשים, מה שהופך את המערכת לא נוח ויקר 28 . אור הלייזר OR-PAM קבוע, ומחקרים רבים, כגון על רוויון החמצן, אינם אפשריים באמצעות מערכת משולבת זו. מחקרים השוואתיים בין AR ו- OR PAM גם הם בלתי אפשריים בגלל ההבדל באורכי גל לייזר בין AR ו- OR. יתר על כן, AR-PAM משתמש תאורה שדה בהיר; לכן, אותות חזקים photacoustic מ משטח העור להגביל את איכות התמונה. מסיבה זו, המערכת לא ניתן להשתמש ביישומים רבים ביו-בימוי. בגישה אחרת לביצוע AR ו- PAM, המיקוד האופטי והאולטראסאונד משתנה, מה שהופך את מוקד האור ואת המיקוד האולטראסאונד ללא שינוי. לכן, איכות התמונה אינה אופטימלית 29. באמצעות טכניקה זו, AR-PAM ו OR-PAM יכול להשיג רק 139 מיקרומטר ו 21 מיקרומטר החלטות, בהתאמה, מה שהופך אותו מערכת ברזולוציה ירודה. גישה אחרת, הכוללת שינוי סיבים אופטיים collimating אופטיקה, דווחו לעבור בין AR ו - PAM, מה שהופך את תהליך היישור קשה 30 . בכל המקרים הללו, AR-PAM לא להשתמש תאורה שדה כהה. השימוש בהארת שדה כהה יכול להפחית את הדור של אותות Photoacoustic חזקה ממשטח העור. לכן, הדמיה רקמות עמוק יכול להתבצע באמצעות תאורה בצורת טבעת, כמו רגישות זיהוי של אותות photacoustic עמוק יהיה גבוה יותר להשוות את זה של תאורה שדה בהיר.

עבודה זו מדווחת על מערכת הדמיה מסוג AR ו - PAM (AR-OR-PAM) המיועדים להדמיה ברזולוציה גבוהה, והדמיה ברזולוציה נמוכה של הדגימה בעומק הדגימה של אותו מדגם, תוך שימוש באותו לייזר וסורק עבור שתי הסיסטותEms. הביצועים של מערכת AR-OR-PAM התאפיינו בקביעת הרזולוציה המרחבית ועומק ההדמיה באמצעות ניסויים רפאים. ב vivo הדם vasculature הדמיה בוצעה על אוזן העכבר כדי להדגים יכולת הדמיה ביולוגית שלה.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי התקנות שאושרו והנחיות של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת נניאנג טכנולוגית, סינגפור (פרוטוקול בעלי חיים מספר ARF-SBS / NIE-A0263).

1. AR-OR-PAM מערכת ( איור 1 )

  1. תצורת המערכת: AR-PAM
    1. השתמש nanosecond מערכת לייזר מתכוונן המורכב דיודה שאוב, מצב מוצק Nd-YAG לייזר (532 ננומטר) ו לייזר צבע עם טווח כוונון של 559-576 ננומטר כמקור קרינה אופטית. הגדר את אורך הלייזר ל 570 ננומטר באמצעות בקר חיצוני ושיעור החזרה של לייזר ל 1 קילוהרץ באמצעות תוכנת לייזר.
    2. מניחים דגימה קרן בזווית של 45 ° מול לייזר כדי להסיט 5% של כוח הלייזר כדי photodiode באמצעות משתנה משתנה צפיפות ניטרלית (NDF1, OD = 0-4.0).
    3. להסיט את קרן הלייזר לאחר sampler קרן ב 90 ° באמצעותזווית ישרה פריזמה (RAP1).
    4. השתמש במנסר אחר של זווית ישרה (RAP2) כדי לאפשר לקורה לעבור דרך מסנן צפיפות נייטרלי משתנה (NDF2, OD = 0-4.0) ולסיב multimode (MMF), המכוון אותו באמצעות מצמד סיבים (FC) - שילוב של מטרות (צמצם מספרי (NA): 0.25) ומתרגם XY.
    5. תקן את הסיבים על הבמה סריקה באמצעות מתרגם XY. מניחים עדשה פלמור קמור (L1) 25 מ"מ הרחק סוף התפוקה סיבים כדי לקרוע את קרן מתוך הסיבים.
    6. להעביר את קרן collimated דרך עדשה חרוטית עם זווית של זווית 130 מעלות כדי ליצור קרן בצורת טבעת. בחולשה להתמקד הקורה בצורת טבעת על הנושא באמצעות קונדנס אופטי אופטי (OC) תוצרת בית עם זוויות חרוט של 70 ° ו 110 ° עם חור במרכז.
    7. מניחים 50 מתדר קולי קולי (UST) עם עדשה אקוסטית (AL) במרכז הקבל תוצרת בית.
  2. תצורת מערכת: OR-PAM
    1. תשתמש בNanosecond לייזר מערכת מורכבת המורכב דיודה שאוב, מצב מוצק Nd-YAG לייזר (532 ננומטר) ו לייזר צבע עם טווח הכוננות של 559 - 576 ננומטר כמקור קרינה אופטי. הגדר את אורך הלייזר ב 570 ננומטר באמצעות בקר חיצוני ואת שיעור החזרה של הלייזר ב 5 קילוהרץ באמצעות תוכנת לייזר.
    2. סובב את הבמה סיבוב מבוקרת מחשב (מחזיק את RAP1) על ידי 90 ° כדי להסיט את קרן הלייזר על איריס לעיצוב מחדש.
    3. להזיז את קרן הלייזר הצבת משתנה צפיפות משתנה ניטרלי (OD: 0-4.0) לאורך הקורה ולאחר מכן למקד את קרן עם עדשה קונדנסר (CL). מעבירים אותו דרך חור פינה (PH) 75 מ"מ הרחק CL עבור סינון מרחבית.
    4. השקת קרן מסוננת מרחבית על סיבים במצב יחיד (SMF) באמצעות מצמד סיבים במצב יחיד (FC) המורכבת של המטרה 0.1 NA כדי למקד את קרן האור על SMF.
    5. התאם את coupler סיבים להשיג יעילות צימוד מקסימלית.
    6. תקן את הסיבים על גבי Tהוא סורק את הבמה באמצעות צלחת להחליק (SP). מניחים עדשה אכרומטית (L2) 50 מ"מ הרחק סיבים SM כדי collimate קרן הלייזר.
    7. הפנה את קרן collimated על ידי 90 ° באמצעות מראה אליפטי לשליטה kinematic (M) כדי למלא את הצמצם האחורי של עדשה אכרומטית זהה זהה (L3). מניחים את העדשה אכרומטי משמש להתמקדות תרגום הר (TM2) באמצעות צינור העדשה (LT).
    8. מעבירים את קרן המיקוד מבעד לקומבייזר אופטו-אקוסטי תוצרת בית המורכב מזכוכית בעלת זווית ישרה (RA) ופריזמה רומבוידית (RP), עם שכבה של שמן סיליקון (SO) בין לבין.
      הערה: שכבת שמן הסיליקון תפעל כפי שקוף אופקית אקוסטית הסרט.
    9. צרף עדשה אקוסטית (AL) כדי לספק מיקוד אקוסטי (קוטר מוקד: ~ 46 מיקרומטר) בתחתית המנסרה מעוין.
    10. מניחים את מתמר קולי עם תדר 50 MHz מרכז על גבי פריזמה rhomboid; השתמש שכבת אפוקסי עבור צימוד יעיל.

2. מעבר ומערך של המערכת

  1. תקן (על ידי הברגה בחוזקה) את צלחת Switchable תוצרת בית לשלב 3-ציר ממונע הנשלט על ידי בקר 3-ציר מחובר למחשב.
  2. צרף את AR ו - OR מערכת כלוב על צלחת תוצרת בית באמצעות סוגריים הרכבה כלוב כדי לאפשר מעבר קל בין AR ו - OR ראשי סריקה. החלק את ראש הסריקה מעל אזור ההדמיה.
  3. השתמש שלב Z- להטביע את החלק התחתון של ראש סורק AR-OR-PAM במיכל אקרילי מלא מים (13 ס"מ x 30 ס"מ x 3 ס"מ) עבור צימוד אקוסטי.
  4. פתח חלון הדמיה עם קוטר 7 ס"מ על צלחת התחתונה של הטנק וחותמת אותו עם קרום פוליאתילן עבור שידור אופטי ואקוסטי.
  5. השתמש מגבר הד הדופק ו אוסצילוסקופ ליישר את מתמר אולטרסאונד להתמקד.
    1. הגדר את הרווח במגבר הד הדופק ל 24 db במצב שידור / קבלה.
    2. השתמש בפרמטר אות סינכרוןOm מגבר הד הדופק כמו ההדק ולזהות את האות backscattered משקופית זכוכית (מוכנס מהחלק התחתון של מיכל מים) באמצעות אוסצילוסקופ.
      הערה: השקופית צריכה קלטת שחורה דבוק לה.
    3. הזז את ציר ה- Z כדי למקסם את משרעת האות הד הדופק (שנצפו על אוסצילוסקופ).
      הערה: כאשר לוח הזכוכית נמצא במיקוד, ההד יהיה במשרעת המרבי שלו.
  6. להדליק את הלייזר ולחבר את UST לשני מגברים, כל אחד עם 24 dB רווח קבוע, באמצעות כבלי BNC.
    הערה: התפוקות של המגברים מחוברים לכרטיס רכישת הנתונים (DAQ).
  7. השתמש האות מן photodiode (PD) להציב מול לייזר כגורם מפעיל עבור מערכת רכישת נתונים.
  8. ב AR-PAM, לשנות את המרחק בין העדשה הקונית (con.L) ואת הקבל האופטי (OC) כדי למקסם את המשרעת של האות photacoustic שנוצר מאובייקט הבדיקה (סרט שחור תקוע על שקופית זכוכית).ודא כי המיקודים האופטיים והאקוסטיים הם confocal על ידי קביעת המשרעת המרבי photacoustic (PA) משרת.
    1. שים לב לעיכוב של אותות הרשות המרבי; להשתמש מאוחר יותר כדי לבדוק את המיקוד של תוכנת רכישת נתונים.
  9. שחרר את הבורג של סריקת הראש והעבר באופן ידני את ראש הסריקה מ- AR-PAM ל- OR-PAM. לאחר מכן, להדק את הברגים.
  10. ב OR-PAM, לשנות את המרחק בין הכפיל achromatic המיקוד (בתוך צינור העדשה (LT)) ואת compino optoacoustic כדי למקסם את משרעת האות PA המוצגת על אוסצילוסקופ.
    1. שים לב לעיכוב של אותות PA המרביים.
      הערה: Finetuning יש צורך לקבוע את הסדר confocal.

3. צעדים ניסיוניים

  1. רזולוציה לרוחב וכימות עומק הדמיה
    1. השתמש זהב חלקיקים 100 ננומטר בקוטר כדי לקבוע את ההחלטה לרוחב של ARD או מערכת.
    2. מדולל 0.1 מ"ל של תמיסת nanoparticle עם כמות שווה של מים. להפיץ 0.1 מ"ל של פתרון מדולל על כיסוי להחליק ומניחים אותו במגע עם קרום פוליאתילן מתחת לטנק.
    3. ודא כי AR-PAM ו- OR-PAM ממוקדת בתוכנה רכישת נתונים (ראה טבלה של חומרים) לפני סריקה (צעדים 2.8 ו -2.10).
      הערה: על ידי עיכוב העיכוב המיקרו-שניות של אותות ה- PA המרביים מהשלבים 2.9 ו -2.10, מוכפל בשיעור הדגימה (250 MS / s), התמונה תהיה ממוקדת בתוכנת רכישת הנתונים. העיכוב שבו יש להשמיט במהלך רכישת נתונים ניתן לקבוע בתוכנה כדי לשמור רק את נקודות הנתונים הדרושים עבור שלאחר עיבוד.
    4. הגדר את פרמטרי הסריקה עבור ה - AR-PAM ולחץ על הלחצן "סריקה" כדי להתחיל בסריקה סריקה.
      1. הגדר את הפרמטרים סריקה עבור AR-PAM בתוכנה רכישת נתונים ב "4" מ"מ / s מהירות סריקה של "מהירות"; טאב, "1" kHz ב "הדופק החזרה שיעור" הכרטיסייה, "0.5" מ"מ בכרטיסייה "Y- סריקה טווח", ו "0.5" מ"מ בכרטיסייה "X- סריקה טווח". הגדר את גודל צעד בכיוון x בכיוון "4" מיקרומטר בכרטיסייה "dx".
        הערה: גודל צעד בכיוון y נקבע באופן אוטומטי ממהירות מהירות הסריקה של הבמה ושיעור החזרה של הדופק (במקרה זה, 4,000 מיקרומטר / 1,000 Hz = 4 מיקרומטר)
    5. הגדר את הפרמטרים לסריקה עבור ה- OR-PAM ולחץ על הלחצן "סריקה" כדי להתחיל בסריקה סריקה.
      1. הגדר את הפרמטרים לסריקה בתוכנת רכישת הנתונים ב "2.5" mm / s מהירות סריקה בכרטיסייה "מהירות", "5" kHz ב "הדופק החזרה שיעור" הכרטיסייה, "0.5" מ"מ "Y- סריקה טווח" הכרטיסייה, ו "0.5" מ"מ בכרטיסייה "X- סריקה טווח". הגדר את גודל צעד בכיוון x- "0.5" מיקרומטר בכרטיסייה "dx".
        הערה: Sגודל tep בכיוון y נקבע באופן אוטומטי ממהירות מהירות הסריקה של הבמה ושיעור החזרה של הדופק (במקרה זה, 2,500 μm / 5,000 Hz = 0.5 μm).
    6. ודא שבמהלך תהליך הסריקה, הנתונים נלכדים באופן קבוע ומאוחסנים במחשב
      הערה: הנתונים יילכדו רק בכיוון אחד של תנועה של שלב ה- Y.
    7. השתמש בנתונים מרובים B- סריקה המאוחסנים במחשב כדי לאחזר את הקרנה המשרעת מקסימלית (MAP) תמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים ).
    8. השתמש תמונה אחת nanoparticle (מתוך מספר רב של תמונות) מן הסריקה כדי לקבוע את הפתרון לרוחב ידנית על ידי זומם קו דרך האזור המרכזי של התמונה nanoparticle כדי להשיג פונקציה נקודה להפיץ, אשר נראה כמו עקומה גאוס. ראה איור 2 .
    9. להתאים את הפונקציה נקודת להפיץ המתקבל תמונה אחת nanoparticle באמצעות גאוSsian בכושר פונקציה למדוד את רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלה של חומרים ). השתמש בו כרזולוציה לרוחב. ראה איור 2 .
    10. הכנס חתיכת סרט שחור בעקיפין על חתיכת פרוסת עוף פרוס כאובייקט היעד עבור הדמיה עומק. מניחים את הרקמה עם הקלטת במיכל המים.
      הערה: סרט שחור הוא תקוע על צלחת מתכת עם קצה חד, אשר מסייע לצרף את הקלטת לרקמה.
    11. הגדר את הפרמטרים סריקה עבור AR-PAM לתוך התוכנה רכישת נתונים ולאחר מכן ללחוץ על כפתור "סריקה" כדי ללכוד תמונה אחת B- סריקה כדי לקבוע את עומק הדמיה מקסימלית.
      1. הגדר את הפרמטרים לסריקה ב "15" mm / s מהירות סריקה בכרטיסייה "מהירות", "1" kHz בכרטיסייה "הדופק החזרה", "5" ס"מ בכרטיסייה "Y- סריקה טווח", "0.1 "Mm בכרטיסייה" X-scan range ". הגדר tהוא צעד צעד בכיוון x ב 0.1 מ"מ מ"מ בכרטיסייה "dx".
    12. הגדר את הפרמטרים סריקה עבור OR-PAM ולחץ על כפתור "סריקה" כדי ללכוד תמונה אחת B- סריקה כדי לקבוע את הדמיה מקסימלית דיפ.
      1. הגדר את הפרמטרים סריקה בתוכנה רכישת נתונים כמו "15" mm / s מהירות סריקה בכרטיסייה "מהירות", "5" kHz ב "הדופק החזרה שיעור" הכרטיסייה, "2" ס"מ "Y- סריקה טווח" הכרטיסייה "0.1" מ"מ בכרטיסייה "X- סריקה טווח". הגדר את גודל צעד בכיוון x בכיוון "0.1" מ"מ בכרטיסייה "dx".
        הערה: מאחר שטווח הסריקה X ו- dx זהים, רק סריקה B אחת תילכד. זמן פתרונן האותות PA מוכפל מהירות הקול ברקמה רכה (1,540 m / s) ייתן תמונה קו. מספר רב של שורות נלכדים במהלך תנועה מתמשכת של שלב ה- Y לייצר B- סריקה.
  2. In vivo/ Em> הדמיה של אוזן הדם של האוזן של העכבר
    1. השתמש העכבר הנשי עם bodyweight של 25 גרם ו לגיל 4 שבועות.
    2. להרדים את החיה באמצעות קוקטייל של קטמין (120 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (16 מ"ג / ק"ג) מוזרק intraperitoneally (מינון של 0.1 מ"ל / 10 גרם).
    3. הסר את השיער מאוזן החיה באמצעות קרם להסרת שיער. נגב את האזור נקי. לכסות את העין של החיה עם משחה העין סטרילי, כדי למנוע קרן לייזר מפוזרים נופלים על העיניים.
    4. מקם את החיה על הבמה כי יש גם צלחת מיניאטורה למקם את האוזן.
    5. לשמור על הרדמה עם isoflurane בשאיפה (0.75% ב 1 L / min חמצן) במהלך תקופת ההדמיה.
    6. מהדק oximeter הדופק על רגל העכבר או הזנב ולנטר את המצב הפיזיולוגי. אפשר אזור הדמיה להיות במגע עם קרום פוליאתילן באמצעות ג'ל אולטראסאונד.
    7. הגדר את הפרמטרים סריקה עבור AR-PAM ולחץ על כפתור "סריקה" כדי להתחיל סריקה סריקה.
      1. הגדר את הפרמטרים לסריקה עבור AR-PAM בתוכנת רכישת הנתונים ב "15" mm / s מהירות סריקה בכרטיסייה "מהירות", "1" kHz ב "הדופק החזרה שיעור" הכרטיסייה, "10 מ"מ" Y- טווח סריקה ", ו" 6 "מ"מ בכרטיסייה" X- סריקה טווח ". הגדר את גודל צעד בכיוון x- כמו "30" מיקרומטר בכרטיסייה "dx".
        הערה: גודל המדרגה בכיוון y נקבע באופן אוטומטי ממהירות מהירות הסריקה של הבמה ושיעור החזרה של הדופק (במקרה זה, 15,000 מיקרומטר / 1,000 Hz = 15 מיקרומטר).
    8. לאחר סיום הסריקה של AR-PAM, העבר את מיקום הדמיה הראשית מ- AR-PAM ל- OR-PAM (כמתואר בסעיף 2).
    9. הגדר את הפרמטרים לסריקה עבור ה- OR-PAM ולחץ על הלחצן "סריקה" כדי להתחיל בסריקה סריקה.
      1. הגדר את הפרמטרים סריקה עבור OR-PAM בתוכנה רכישת נתונים ב "15" mm / s מהירות הסריקה של "מהירותY "", "5" kHz בכרטיסייה "הדופק החוזר", "10" מ"מ בכרטיסייה "Y-scan" ו - "6" mm בכרטיסייה X-scan range. ב x- כיוון כמו "6" מיקרומטר בכרטיסייה "dx".
        הערה: גודל צעד בכיוון y נקבע באופן אוטומטי ממהירות מהירות הסריקה של הבמה ושיעור חזרת הדופק (במקרה זה, 15,000 מיקרומטר / 5,000 Hz = 2 מיקרומטר).
    10. השתמש בנתוני B-Scan מרובים המאוחסנים במחשב כדי לאחזר את התמונות MAP באמצעות תוכנת עיבוד תמונה.
    11. שימו לב החיה במהלך כל תקופת ההדמיה.

תוצאות

סכמטי של מערכת AR-OR-PAM מוצג באיור 1 . במסגרת זו ההתקנה, כל הרכיבים היו משולבים התאספו ההתקנה כלוב אופטי. השימוש במערכת כלוב הופך את סורק ה- AR-OR-PAM לסריקה קומפקטית וקל להרכבה בקלות, מיושר ומשולב על שלב סריקה יחיד.

Discussion

לסיכום, מערכת AR ו - PAM הניתנים לשינוי ניתן להשיג הן הדמיה ברזולוציה גבוהה במעמקי הדמיה נמוכים יותר והן בהדמיה ברזולוציה נמוכה יותר במעמקי הדמיה גבוהים יותר. ההחלטה לרוחב ואת עומק הדמיה של מערכת switchable נקבע. היתרונות של מערכת ה- PAM הזאת הניתנים לשינוי כוללים: (1) הדמיה ברז?...

Disclosures

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו על פי הנחיות ותקנות שאושרו של טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת נניאנג טכנולוגית, סינגפור (פרוטוקול בעלי חיים מספר ARF-SBS / NIE-A0263). למחברים אין אינטרסים כלכליים רלוונטיים בכתב היד ואין שום ניגודי אינטרסים פוטנציאליים אחרים שיש לגלותם.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות בתמיכה הכספית ממענק מדרגה שנייה במימון משרד החינוך בסינגפור (ARC2 / 15: M4020238). המחברים היו גם להודות למר צ'או וואי הונג בובי לעזרה מכונת מכונת.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Q-switched Nd:YAG laserEdgewaveBX80-2-LPump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye LaserSpectra physicsCREDO-DYE-NDye laser
Precision Linear StagePhysik InstrumentePLS 85 XY raster scanning stage
Translation stagePhysik InstrumenteVT 80 Confocal determine
Mounted Silicon photodiodeThorlabsSM05PD1ATriggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage ThorlabsCR1/M-Z7Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND FilterThorlabsNDC-50C-4MIntensity variable
Fiber Patch CableThorlabsM29L01Multimode fiber
Microscope objectiveNewportM-10XObjective 
XY translating mountThorlabsCXY1Translating mount
Plano convex lensThorlabsLA1951Collimating lens
Conical lens AltechnaAPX-2-B254Ring shape beam
Translation stageThorlabsCT1Translating stage
Optical condenserHome made
Ultrasonic transducerOlympus-NDTV214-BB-RM50MHz transducer
Plano concave lensThorlabsLC4573Acoustic lens
Pulser/ReceiverOlympus-NDT5073PRPulse echo amplifier 
Mounted standard irisThorlabsID12/MBeam shaping
Plano convex lensThorlabsLA4327Condenser lens
Mounted precision pinholeThorlabsP50SSpatial filtering
Single mode fiber patch cableThorlabsP1-460B-FC-1Single mode fiber
Fiber couplerNewportF-91-C1Single mode coupling
Achromatic doublet lensEdmund Optics32-317Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirrorThorlabsPFE10-P01Mirror
Right angle kinematic mirror mountThorlabsKCB1Mirror mount
Z-Axis Translation MountThorlabsSM1Zz translator
Lens tubeThorlabsSM05L10
UV Fused Silica Right-Angle PrismThorlabsPS615Right angle prism
Rhomboid prismEdmund Optics47-214Shear wave
DimethylpolysiloxaneSigma AldrichDMPS1MSilicon oil
AmplifierMini CircuitsZFL-500LNAmplifier
16 bit high speed digitizerSpectrumM4i.4420Data acquisition card
OscilloscopeAgilent TechnologiesDS06014A
Mice InVivos Pte.LtdICRAnimal model
Ultrasound gel Progress/parker acquasonic gelPA-GEL-CLEA-5000Acoustic coupling
Water tankHome made
Translation stageHomemadeSwitching AR-OR
Gold nanoparticlesSigma Aldrich742031Lateral resolution
Sterile ocular ointmentAlconDuratearsAnimal imaging
1951 USAF resolution test targetEdmund Optics38257Confocal alignment
Data acquisition softwareNational InstrumentLabviewHome made software using Labview
Image Processing softwareMathworksMatlabHome made program using Matlab

References

  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
  33. . ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124In vivoAR PAMOR PAM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved