用于图像分析的时钟扫描协议:ImageJ插件

摘要

本文介绍了用于"时钟扫描"图像分析的两个新颖的ImageJ插件。这些插件扩展了原始视觉基础6程序的功能，最重要的是，通过将其与ImageJ免费图像分析软件包捆绑在一起，使程序可用于大型研究团体。

摘要

用于图像分析的时钟扫描协议是量化在边界内部和外部（背景）在关闭或分段的凸起的感兴趣区域内的平均像素强度的有效工具，导致产生平均的整体径向像素 - 强度分布。该协议最初是在2006年开发的，作为一个视觉基本的6脚本，但是它的分布有限。为了解决这个问题，并加入其他人近期的类似工作，我们将原始的时钟扫描协议代码转换为与NIH赞助和免费提供的图像分析程序（如ImageJ或Fiji ImageJ）兼容的两个基于Java的插件。此外，这些插件具有几个新功能，进一步扩展了原始协议的功能范围，如分析多个感兴趣区域和图像堆栈。程序的后一个特征在确定相关变更很重要的应用中特别有用到时间和位置。因此，生物图像堆叠的时钟扫描分析可能潜在地应用于单个细胞内Na ⁺或Ca ⁺⁺的扩散，以及对突触群体中扩散活性（ 例如 ，Ca ⁺⁺波）的分析连接或间隙结耦合电池。在这里，我们将描述这些新的时钟扫描插件，并在图像分析中展示其应用的一些示例。

引言

这项工作的目标是提供一个无平台的时钟扫描协议，并可免费向任何对这种图像分析感兴趣的研究人员提供。时钟扫描协议最初是在2006年开发的，目的是改进现有的凸型感兴趣区域（ROI）中的像素强度量化方法，一种具有更好的综合能力和改进的空间分辨率的方法。在采集期间，为了测量"背景"像素强度，协议顺序地收集从ROI中心扫描到其边界或ROI外的预定距离的多个径向像素强度分布。协议根据扫描方向测量的单元格半径来缩放这些轮廓。因此，从每个单独径向扫描的中心到ROI边界的距离总是X刻度的100％。最后，程序平均这些个人al轮廓成一个整体的径向像素强度分布。由于缩放，由"时钟扫描"协议产生的平均像素强度分布不依赖于ROI大小，也不在合理的限度内取决于ROI形状。该方法允许直接比较，或者如果需要，可以平均或减去不同ROI的配置文件。该协议还允许通过简单减去位于对象外部的像素的平均强度来校正任何对象的背景噪声的整体像素强度分布。虽然它只在生物样品中进行了测试，但是我们的协议为其他现有的图像分析工具提供了有价值的补充，这些工具用于研究物理或化学过程的图像，这些图像分布在原点附近（如从点源扩散物质） ¹ 。

然而，原始图像分析方法的主要限制是协议是dev作为Visual Basic 6（VB6）（代码，因此它依赖于平台，难以分发（需要VB6）。为了解决这个问题，并加入了其他调查人员近期的类似工作，我们转换了VB6时钟扫描程序代码转换为两个基于Java的插件，与NIH赞助和免费提供的开源和平台无关的图像分析程序ImageJ ³和Fiji ImageJ ⁴兼容，此外，这些插件现在有几个新功能可扩展功能的原始协议来处理多个ROI和图像堆栈许多图像分析应用程序不是用户友好的，关于对多个对象进行统计分析，因此通常只显示代表性的数据。通过多时钟扫描ImageJ插件，可以同时促进多个物体的分析，对显微镜数据的鲁棒统计评估，关于单个单元/对象中的信号强度分布，现在可以通过该插件扩展。在这里，我们将描述时钟扫描插件，并在图像分析中显示其应用的示例。

研究方案

软件安装

1. 按照相应网站的推荐安装最新版本的捆绑Java和ImageJ或Fiji ImageJ（请参阅材料表，以获取相应网站的链接）。在下面的文本中，这两个程序都被称为"ImageJ"。
2. 使用材料表中提供的链接复制"Clock_Scan-1.0.1。jar"和"Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar"插件文件，并将其粘贴到ImageJ插件目录中。或者，使用"插件|安装插件"菜单选项将它们保存在计算机硬盘驱动器上之后安装这些文件。

2.时钟扫描分析

1. 标准时钟扫描插件（ 图1 ）:
   1. 使用ImageJ"File | Open"菜单命令打开感兴趣的图像。
   2. 点击"多边形"工具，或"分割行选择"工具，然后绘制图像以概述整个投资回报率或该区域的一段。有关多边形选择（内部虚线轮廓）的示例，请参见图1A 。
      注意:也可以使用软件中提供的其他选择工具（矩形，椭圆形和手绘线选择）。
   3. 从菜单中选择"插件|时钟扫描"，打开标准时钟扫描协议弹出选项窗口。请注意，此命令还将打开ROI Manager窗口，其大纲自动添加到该窗口。
   4. 使用插件选项窗口执行以下操作。
      1. 检查并更改ROI中心的X和Y坐标（自动计算为物理质量中心的坐标），方法是使用滚动条或更改相应输入框中的值。 见图 1B 。
      2. 取决于对象sho之外的背景区域的多少扫描时可以覆盖，使用"扫描极限"滚动条调整扫描限制。参见图 1A 。
         注意:扫描限制是表示扫描在任何给定方向上超出物体边界超出距离的分数;默认值为1.20，表示扫描长度比扫描方向上物体半径长20％; 见图 1A ，外部虚线）。
      3. 使用"实际半径"，"减去背景"，"极坐标变换"和/或"带标准偏差的绘图"复选框修改插件的输出。
      4. 点击"确定"运行插件。 见图1 C-H 。
         注意:具有"带标准偏差"和"极坐标变换"或"实际半径"和"极坐标传感器"的协议输出示例选择的"orm"选项分别如图1C和1D以及图 1E和1F所示 ，请注意，计算出的标准偏差（SD）值表示物体的各个径向像素强度扫描之间的变化，还要注意"ROI选择长度"行，显示以像素为单位测量的ROI轮廓长度的信息。
   5. 在生成的"时钟扫描配置文件图"中，使用"列表"命令绘制灰度图像的两个X和Y列数据以及RGB图像的X和四个Y列数据中显示的值，其中Y0， Y1，Y2和Y3列将填充积分和个体（红色，绿色和蓝色）颜色通道像素强度值。
2. 多个ROI时钟扫描插件 - 使用多个ROI（ 图2 ）:
   1. 打开包含多个投资回报率的图像。
   2. 点击"分析|工具|投资回报率管理器"打开ROI管理器。
   3. 按照轮廓（参见步骤2.1.2），并通过点击ROI Manager窗口中的"添加"将每个ROI添加到ROI管理器中;为图像中的所有ROI执行此操作。如果感兴趣的ROI指标是使用"分析|测量"命令。
      1. 有关多个分割线选择的示例，请参见图 2A， 图2为多边形选择示例。
   4. 在"插件"菜单中选择"多时钟扫描"，打开协议选项弹出窗口。
   5. 使用协议选项窗口执行以下操作。
      1. 如果需要，按照步骤2.1.4.2重置扫描限制;默认值为1.20。
      2. 如果需要，请选择选项离子通过检查"带有标准偏差的绘图"框来绘制具有SD条的平均时钟扫描轮廓。 见图2 C和D。
         注意:计算的SD值将表示不同对象的积分时钟扫描配置文件之间的变化。另外，请注意插件窗口中显示"所选ROI数量"信息的行。
      3. 单击"确定"运行协议。
   6. 在生成的"时钟扫描配置文件图"中，使用"列表"命令绘制"绘图值"窗口中显示的值。请参阅"多时钟扫描配置文件图"窗口图例，用于通过颜色通道进行列标识。
   7. 请注意，投资回报率是编号的，并且任何给定颜色通道的时钟扫描配置文件按相同的顺序绘制，其中ROI被概述并添加到"投资回报率管理器"中。
3. 穆尔tiple ROI时钟扫描插件 - 使用图像堆栈（ 图3 ）:
   1. 打开一个感兴趣的图像堆栈。
   2. 点击"分析|工具|投资回报率管理器"打开ROI管理器。
   3. 概述堆栈中图像的ROI，并将其添加到ROI管理器中，如步骤2.1.2和2.2.3所述。如果感兴趣的ROI指标是使用"分析|测量"命令。
   4. 在"插件"菜单中选择"多时钟扫描"，打开协议选项弹出窗口。
   5. 使用协议选项窗口执行以下操作。
      1. 如步骤2.1.4.2所述重置扫描限制;默认值为1.20。
      2. 选择使用SD条绘制平均时钟扫描配置文件的选项，方法是选中"带标准偏差的绘图"框。
         注意:计算的SD值将表示在图像状态中选择的对象的不同实例之间的变化CK。另外，请注意插件窗口中的行显示"堆叠中图像数量"的信息。
      3. 单击"确定"运行协议。
   6. 在"时钟扫描配置文件图"窗口中，单击"列表"，绘制"绘图值"窗口中显示的值，其中Y列编号表示堆栈中的图像位置。

结果

这里用于说明目的的图像取自我们之前的细胞和组织生物学研究^5,6,7和从Allen Mouse Brain Atlas ^8中创建的数据库。这两个插件都使用ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77，ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66和Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66程序环境成功测试。

图1显示了使用标准时钟扫?...

讨论

时钟扫描协议:时钟扫描协议是一种快速简单的图像分析工具。与现有的图像分析方法（例如线性像素强度扫描或ROI的平均像素强度的计算）相比，该协议的优点已经在先前的出版物1,9中进行了详细描述。简而言之，该协议允许通过量化位于与ROI中心不同距离（例如对象的边界）或物体外部的预定位置（背景）的像素的强度来生成整体的径向像素强度分布。由于后者，每个ROI的时钟扫...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function