Protocole de numérisation de l'horloge pour l'analyse d'image: Plugins ImageJ

Résumé

Cet article décrit deux nouveaux plugins ImageJ pour l'analyse d'image 'Clock Scan'. Ces plugins élargissent la fonctionnalité du programme original de base visuelle 6 et, surtout, mettent le programme à la disposition d'une grande communauté de recherche en le regroupant avec le logiciel ImageJ.

Résumé

Le protocole de balayage de l'horloge pour l'analyse d'image est un outil efficace pour quantifier l'intensité moyenne des pixels à l'intérieur, à la frontière et à l'extérieur (arrière-plan) d'une région d'intérêt convexe fermée ou segmentée, ce qui conduit à la génération d'un pixel radial intégral moyen, Profil d'intensité. Ce protocole a été développé à l'origine en 2006, en tant que script visuel de base 6, mais en tant que tel, il avait une distribution limitée. Pour résoudre ce problème et rejoindre les efforts récents similaires d'autrui, nous avons converti le code du protocole d'analyse de l'horloge d'origine en deux plugins basés sur Java compatibles avec les programmes d'analyse d'image sponsorisés par NIH et librement disponibles comme ImageJ ou Fiji ImageJ. En outre, ces plugins ont plusieurs nouvelles fonctions, élargissant encore la gamme des fonctionnalités du protocole original, telles que l'analyse de multiples régions d'intérêt et les piles d'images. La dernière caractéristique du programme est particulièrement utile dans les applications dans lesquelles il est important de déterminer les changements liésÀ l'heure et à l'emplacement. Ainsi, l'analyse de l'analyse de l'horloge des piles d'images biologiques peut potentiellement être appliquée à l'épandage de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ dans une seule cellule, ainsi qu'à l'analyse de l'activité d'étalement ( par exemple , les ondes de Ca ⁺⁺ ) dans les populations synaptiquement Des cellules couplées à la jonction ou à l'intervalle. Ici, nous décrivons ces nouveaux plugins d'analyse de l'horloge et montrons quelques exemples de leurs applications dans l'analyse d'image.

Introduction

Le but de ce travail est de présenter un protocole de numérisation de l'horloge sans plateforme et accessible gratuitement à tout chercheur intéressé par ce type d'analyse d'image. Le protocole Clock Scan a été développé à l'origine en 2006 ¹ , dans le but d'améliorer les méthodes existantes de quantification de l'intensité des pixels dans des régions d'intérêt convexes (ROI), une méthode qui présente une meilleure capacité d'intégration et une meilleure résolution spatiale. Au cours de l'acquisition, le protocole collecte séquentiellement de multiples profils radiaux d'intensité de pixels, scannés du centre ROI à sa bordure ou à une distance prédéterminée en dehors du ROI afin de mesurer l'intensité du pixel "fond". Le protocole évolue ces profils selon le rayon de la cellule, mesuré dans le sens de la numérisation. Ainsi, la distance entre le centre et le ROI de chaque balayage radial individuel est toujours de 100% de l'échelle X. Enfin, le programme s'approche de cet individuAl dans un profil d'intensité de pixel radial intégral. En raison de la mise à l'échelle, le profil moyen d'intensité de pixel, produit par le protocole "Clock Scan", ne dépend ni de la taille du ROI ni, dans des limites raisonnables, sur la forme du ROI. Cette méthode permet une comparaison directe ou, si nécessaire, une moyenne ou une soustraction de profils de ROI différents. Le protocole permet également de corriger les profils d'intensité des pixels intégrés, de n'importe quel objet pour le bruit de fond, par une simple soustraction de l'intensité moyenne des pixels situés à l'extérieur de l'objet. Bien qu'il ne soit testé que dans des échantillons biologiques, notre protocole fournit un ajout précieux à d'autres outils d'analyse d'image existants utilisés dans les études d'images de processus physiques ou chimiques disposés autour d'un point d'origine (comme la diffusion de substances à partir d'une source ponctuelle ) ¹ .

Cependant, la principale limitation de la méthode d'analyse d'image originale était que le protocole était devA évolué en tant que Visual Basic 6 (VB6) (code et, par conséquent, il était dépendant de la plate-forme et difficile à distribuer (nécessitant VB6). Pour résoudre ce problème et rejoindre les efforts récents similaires d'autres enquêteurs ² , nous avons converti l'analyse de l'horloge VB6 Code de programme dans deux plugins basés sur Java, compatibles avec les programmes d'analyse d'image open-source et indépendant de la plate-forme, NIJ et libre de disponibilité, ImageJ ³ et Fiji ImageJ ^4. De plus, ces plugins ont maintenant plusieurs nouvelles fonctions qui augmentent la capacité Du protocole d'origine pour traiter de multiples ROI et des piles d'images. De nombreuses applications d'analyse d'image ne conviennent pas, en ce qui concerne l'analyse statistique de plusieurs objets, et souvent, seules des données représentatives sont affichées. Avec le plugin Multi Clock Scan ImageJ, Il est possible de faciliter l'analyse simultanée d'objets multiples. Une évaluation statistique robuste des données microscopiques,En ce qui concerne la distribution de l'intensité du signal dans des cellules / objets individuels, est maintenant possible avec cette extension de plugin. Ici, nous décrivons les plugins Clock Scan et montrons des exemples de leurs applications dans l'analyse d'image.

Protocole

1. Installation du logiciel

1. Installez les dernières versions de Java groupé et ImageJ ou Fiji ImageJ comme recommandé sur les sites respectifs (voir la table des matériaux pour les liens vers les sites Web correspondants). Dans le texte ci-dessous, les deux programmes sont appelés «ImageJ».
2. Copiez les fichiers "Clock_Scan-1.0.1. Jar" et "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" en utilisant le lien fourni dans la table des matériaux et collez-les dans le répertoire de plugins ImageJ. Vous pouvez également utiliser l'option "Plugins | Installer le plugin" pour installer ces fichiers après avoir été enregistrés sur le disque dur de l'ordinateur.

2. Analyse de l'analyse de l'horloge

1. Plugin d'analyse de l'horloge standard ( Figure 1 ):
   1. Utilisez la commande de menu "Fichier | Ouvrir" ImageJ pour ouvrir une image d'intérêt.
   2. Cliquez sur l'outil «polygone» ou «sélection de ligne segmentée»Outil, puis dessinez sur l'image pour décrire l'ensemble du ROI ou un segment de cette région. Voir la figure 1 A pour un exemple de sélection de polygone (contour pointillé interne).
      REMARQUE: D'autres outils de sélection, disponibles dans le logiciel (sélection rectangulaire, ovale et ligne droite) peuvent également être utilisés.
   3. Sélectionnez "Plugins | Clock Scan" dans le menu pour ouvrir la fenêtre d'option pop-up du protocole d'analyse de l'horloge standard. Notez que cette commande ouvrira également la fenêtre ROI Manager avec le contour ajouté automatiquement.
   4. Utilisez la fenêtre d'option du plugin pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Examinez et modifiez les coordonnées X et Y du centre ROI (calculé automatiquement en tant que coordonnées du centre de masse physique) en utilisant des barres de défilement ou en changeant les valeurs dans les cases de saisie correspondantes. Voir la figure 1 B.
      2. Selon la quantité de la région de fond en dehors de l'objet shoVous devez être couvert par la numérisation, régler les limites de numérisation en utilisant la barre de défilement "limite de numérisation". Voir la figure 1 A.
         REMARQUE: la limite de numérisation est le nombre fractionnaire représentant la distance à parcourir dans la direction de l'objet dans une direction donnée; La valeur par défaut est 1.20, indiquant que la longueur de balayage sera 20% plus longue que le rayon de l'objet dans la direction de balayage; Voir la figure 1 A , ligne pointillée extérieure).
      3. Modifiez la sortie du plugin à l'aide des cases à cocher "rayon réel", "soustraire l'arrière-plan", "polar transform" et / ou "trame avec déviation standard".
      4. Cliquez sur "OK" pour exécuter le plugin. Voir la figure 1 C-H .
         REMARQUE: Des exemples de la sortie du protocole avec "tracé avec écart type" et "transformée polaire" ou "rayon réel" et "polar transfLes options "orm" sélectionnées sont représentées respectivement dans la Figure 1 C et 1D et Figure 1 E et 1F . Notez que les valeurs de l'écart type (SD) calculé représentent la variation entre les balayages individuels de l'intensité des pixels radiaux de l'objet. Notez également "la sélection ROI Longueur "dans la fenêtre du plugin, qui affiche les informations sur la longueur de contour ROI mesurée en pixels.
   5. Dans le «Parcours de profil de balayage de l'horloge» généré, utilisez la commande «Liste» pour tracer les valeurs affichées dans deux colonnes de données X et Y pour les images à échelle de gris et dans les colonnes de données X et quatre Y pour les images RVB dont Y0, Les colonnes Y1, Y2 et Y3 seront remplies avec des valeurs d'intensité de pixel de canal de couleur intégrales et individuelles (rouge, vert et bleu).
2. Multiple ROI Clock Scan plugin - travail avec plusieurs ROI ( Figure 2 ):
   1. Ouvrez une image contenant plusieurs ROI.
   2. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser | Outils | Gestionnaire de ROI".
   3. Déterminer séquentiellement (voir l'étape 2.1.2) et ajouter chaque ROI au gestionnaire de ROI en cliquant sur "Ajouter" dans la fenêtre du gestionnaire de ROI; Faites ceci pour tous les ROI dans l'image. Utilisez la commande "Analyser | Mesurer" si les mesures de ROI sont intéressantes.
      1. Voir la figure 2 A pour un exemple de sélections de lignes segmentées multiples et la figure 2 E pour un exemple de sélections multiples de polygones.
   4. Sélectionnez "Multi Clock Scan" dans le menu "Plugins" pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole.
   5. Utilisez la fenêtre d'option de protocole pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Si nécessaire, réinitialiser la limite de numérisation selon l'étape 2.1.4.2; La valeur par défaut est 1.20.
      2. Si nécessaire, sélectionnez l'optionPour tracer le profil moyen de balayage de l'horloge avec des barres SD en cochant la case "Parcourir avec écart type". Voir la figure 2 C et D.
         REMARQUE: Les valeurs SD calculées représenteront une variation entre les profils intégrés d'analyse de l'horloge des différents objets. Aussi, notez la ligne dans la fenêtre du plugin affichant des informations sur le "nombre de ROI sélectionnés".
      3. Cliquez sur "OK" pour exécuter le protocole.
   6. Dans le «Trace de profil de numérisation d'horloge» généré, utilisez la commande «Liste» pour tracer les valeurs affichées dans la fenêtre «Valeurs de tracé». Voir la légende de la fenêtre "Multi Clock Scan Profile Tram" pour la désignation de la colonne par canal couleur.
   7. Notez que les ROI sont numérotés et que leurs profils de numérisation d'horloge pour un canal de couleur donné sont tracés dans la même séquence dans laquelle les ROI ont été décrits et ajoutés au «Gestionnaire de ROI».
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - travail avec une pile d'images ( Figure 3 ):
   1. Ouvrez une image-pile d'intérêt.
   2. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser | Outils | Gestionnaire de ROI".
   3. Décrivez le ROI des images dans la pile et ajoutez-la au gestionnaire de ROI comme décrit aux étapes 2.1.2 et 2.2.3. Utilisez la commande "Analyse | Mesurer" si les paramètres de ROI sont intéressants.
   4. Sélectionnez "Multi Clock Scan" dans le menu "Plugins" pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole.
   5. Utilisez la fenêtre d'option de protocole pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Réinitialiser la limite de numérisation comme décrit à l'étape 2.1.4.2; La valeur par défaut est 1.20.
      2. Sélectionnez l'option pour tracer le profil d'analyse de l'horloge moyenne avec les barres SD en cochant la case "Parcourir avec l'écart type".
         NOTE: Les valeurs SD calculées représenteront une variation entre les différentes instances de l'objet sélectionné dans l'image staCk. Notez également la ligne dans la fenêtre du plugin affichant des informations sur le "nombre d'images dans la pile".
      3. Cliquez sur "OK" pour exécuter le protocole.
   6. Dans la fenêtre "Traçage de balayage de l'horloge", cliquez sur "Liste" pour tracer les valeurs affichées dans la fenêtre "Valeurs de tracé", où le numéro de colonne Y représente la position de l'image dans la pile - 1.

Résultats

Les images utilisées ici à titre d'illustration sont tirées des bases de données créées lors de nos précédentes études biologiques sur les cellules et les tissus ^{5 , 6 , 7} et de l'Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Les deux plugins ont été testés avec succès à l'aide de l'environnement ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java ...

Discussion

Protocole de numérisation d'horloge: le protocole de numérisation d'horloge est un outil rapide et simple d'analyse d'image. Les avantages de ce protocole, par rapport aux approches communes existantes de l'analyse d'image (telles que les analyses linéaires d'intensité de pixels ou le calcul de l'intensité moyenne des pixels du ROI) ont été décrits en détail dans les publications précédentes ^{1 , 9} . En ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function