JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yazı, 'Saat Tarama' görüntü analizi için iki yeni ImageJ eklentisini açıklamaktadır. Bu eklentiler orijinal görsel temel 6 programının işlevselliğini genişletir ve daha da önemlisi, programı büyük bir araştırma topluluğunda ImageJ ücretsiz resim analizi yazılım paketi ile paketleyerek kullanılabilir hale getirir.

Özet

Görüntü analizi için saat tarama protokolü, sınırdaki ve dışındaki (arka plan) kapalı veya bölmeli dışbükey biçimli bir bölge içindeki ortalama piksel yoğunluğunu ölçmek için etkili bir araçtır ve bu da ortalama bir radyal piksel- Yoğunluk profili. Bu protokol aslen 2006'da görsel bir temel 6 senaryo olarak geliştirildi, ancak öyle olduğu gibi dağılımı sınırlıydı. Bu soruna hitap etmek ve başkaları tarafından benzer yeni çabalara katılmak için orijinal saat tarama protokol kodunu, NIH sponsorluğunda ve ImageJ veya Fiji ImageJ gibi özgürce mevcut görüntü analiz programlarıyla uyumlu olan iki Java tabanlı eklentiye dönüştürdük. Ayrıca, bu eklentilerin, birkaç farklı bölgenin analizi gibi orijinal protokolün yeteneklerini daha da genişleten birkaç yeni işlevi vardır. Programın ikinci özelliği, özellikle ilgili değişiklikleri belirlemenin önemli olduğu uygulamalarda yararlıdır.Zamana ve yere. Bu nedenle, biyolojik görüntü yığınlarının saat tarama analizi, tek bir hücre içerisinde Na + veya Ca ++ ' nin yayılmasının yanı sıra, sinaptik popülasyonlarda yayılma aktivitesinin ( örn. , Ca ++ dalgaları) analizine de uygulanabilir Bağlantılı veya boşluk birleşim bağlantılı hücreler. Burada, bu yeni saat tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının bazı örneklerini gösteriyoruz.

Giriş

Bu çalışmanın amacı, bu tür bir görüntü analiziyle ilgilenen herhangi bir araştırmacıya platformdan bağımsız ve serbestçe erişilebilen bir Saat Tarama protokolü sunmaktır. Saat Tarama protokolü, daha iyi bütünleştirici kapasiteye ve gelişmiş mekansal çözünürlüğe sahip bir yöntem olan, konveks biçimli ilgi alanı (ROI) içindeki mevcut piksel yoğunluğu niceleme yöntemlerini geliştirmeyi amaçlayan, orijinal olarak 2006'da geliştirildi. Satın alma işlemi sırasında, protokol, "arka plan" piksel yoğunluğunu ölçmek amacıyla ROI merkezinden kenara veya taramalı ROI dışındaki önceden belirlenmiş bir mesafeye taranan ardışık radyal piksel yoğunluğu profillerini toplar. Protokol, tarama yönünde ölçülen hücre yarıçapına göre bu profilleri ölçeklendirir. Böylece, merkezden her bir radyal taramanın ROI sınırına olan uzaklığı daima X ölçeğinin% 100'üdür. Son olarak, program bu kişileri ortalama olarakAl profillerini tek bir radyal piksel yoğunluğu profiline dönüştürür. Ölçekleme nedeniyle, "Saat Tarama" protokolü tarafından üretilen ortalama piksel yoğunluğu profili, ne ROI boyutu ne de makul sınırlar içinde ROI şekline bağlı değildir. Bu yöntem, doğrudan ROI'lerin profillerinin doğrudan karşılaştırılmasını veya gerekirse ortalamasını veya çıkarılmasını sağlar. Protokol, nesnenin dışında bulunan piksellerin ortalama yoğunluğunun basit bir çıkarılmasıyla arka plan gürültüsü için herhangi bir nesnenin integral piksel yoğunluğu profillerinin düzeltilmesine de olanak tanır. Sadece biyolojik örneklerde test edilmiş olsa da, protokolümüz orijinal bir noktanın etrafında düzenlenmiş fiziksel veya kimyasal süreç görüntüleri çalışmalarında kullanılan diğer mevcut görüntü analiz araçlarına değerli bir katkı sağlar (maddelerin bir nokta kaynaktan difüzyonu ) 1 .

Bununla birlikte, orijinal görüntü analiz yönteminin en büyük kısıtlılığı protokolün devBir Visual Basic 6 (VB6) (kod ve bu nedenle, platforma bağımlı ve dağıtmak zordu (VB6 gerektiren) idi.) Bu soruna hitap etmek ve diğer araştırmacılar tarafından benzer yeni çabalara katılmak için 2 , VB6 Saat Taramasını Program kodunu NIH destekli ve serbestçe temin edilebilir açık kaynak ve platformdan bağımsız görüntü analiz programlarıyla uyumlu ImageJ 3 ve Fiji ImageJ 4'e sahip iki Java tabanlı eklentiye dönüştürür.Ayrıca bu eklentiler, Birden fazla ROI ve görüntü yığınını işlemek için orijinal protokolün birçoğu.Birçok görüntü analizi uygulaması, birden çok nesnenin istatistiksel analizini gerçekleştirmek açısından kullanıcı dostu değildir ve bu nedenle genellikle sadece temsili veriler gösterilmektedir .. Çok Saatli Tarama ImageJ eklentisi ile, Aynı anda birden çok nesnenin analizini kolaylaştırmak mümkündür Mikroskopi verilerinin sağlam istatistiksel değerlendirmesi,Tekli hücreler / nesnelerdeki sinyal yoğunluğu dağılımı ile ilgili olarak, artık bu eklenti uzantısı ile mümkündür. Burada, Saat Tarama eklentilerini açıklıyor ve görüntü analizindeki uygulamalarının örneklerini gösteriyoruz.

Protokol

1. Yazılım Kurulumu

  1. Paketlenmiş Java ve ImageJ veya Fiji ImageJ'in ilgili web sitelerinde önerilen en son sürümlerini yükleyin (ilgili web sitelerine bağlantılar için malzeme tablosuna bakın). Aşağıdaki metinde her iki programa "ImageJ" denir.
  2. Malzeme tablosunda verilen bağlantıyı kullanarak "Clock_Scan-1.0.1. Jar" ve "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" eklenti dosyalarını kopyalayıp bunları ImageJ eklenti dizinine yapıştırın. Alternatif olarak, bu dosyalar bilgisayarın sabit disk sürücüsüne kaydedildikten sonra yüklemek için "Eklentiler | Yükleme eklentisi" menü seçeneğini kullanın.

2. Saat Tarama analizi

  1. Standart Saat Tarama eklentisi ( Şekil 1 ):
    1. İlgi çekici bir resmi açmak için ImageJ "Dosya | Aç" menü komutunu kullanın.
    2. 'Çokgen' aracını veya 'bölümlü çizgi seçimi'ni tıklayınAracı seçin ve ardından ROI'nin tamamını veya bu bölgenin bir bölümünü anahatlamak için görüntüyü çizin. Çokgen seçimi örneği (iç kesikli çizgi) için bkz. Şekil 1A.
      NOT: Yazılımda bulunan diğer seçim araçları (dikdörtgen, oval ve serbest el çizgisi seçimi) de kullanılabilir.
    3. Standart saat tarama protokolü açılır pencere seçenek penceresini açmak için menüden "Eklentiler | Saat Taraması" nı seçin. Bu komutun ROI Yöneticisi penceresini otomatik olarak eklenen anahatla birlikte açacağını unutmayın.
    4. Aşağıdakileri yapmak için eklenti seçenek penceresini kullanın.
      1. Kaydırma çubuklarını kullanarak veya ilgili giriş kutularındaki değerleri değiştirerek ROI merkezinin X ve Y koordinatlarını gözden geçirin ve değiştirin (fiziksel kütle merkezinin koordinatları olarak otomatik olarak hesaplanır). Şekil 1 B'ye bakın.
      2. Nesne dışındaki arka plan bölgesinin ne kadarına bağlı olarakTarama kapsamına girmek için "tarama limiti" kaydırma çubuğunu kullanarak tarama sınırlarını ayarlayın. Bakınız Şekil 1 A.
        NOT: Tarama sınırı, taramanın belirli bir yönde nesne sınırının ötesine ne kadar ilerleyeceğini gösteren kesirli sayıdır; Varsayılan değer 1.20 olup tarama uzunluğu tarama yönünde nesne yarıçapından% 20 daha uzun olacağını belirtir; Bakınız Şekil 1A, dışa kesik çizgi).
      3. "Gerçek yarıçap", "arka plan çıkar", "kutup dönüşümü" ve / veya "standart sapma ile çizim" onay kutularını kullanarak eklentinin çıktısını değiştirin.
      4. Eklentiyi çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın. Bakınız Şekil 1 C-H .
        NOT: "Standart sapma ile çizim" ve "kutupsal dönüşüm" ya da "gerçek yarıçap" ve "kutupsal transfüzyon" protokollerinin çıktı örnekleriOrm "seçenekleri seçildiğinde, sırasıyla Şekil 1C ve 1D ve Şekil 1E ve 1F'de gösterilmiştir Hesaplanan standart sapma (SD) değerleri, nesnenin radyal piksel yoğunluk taramaları arasındaki değişimi göstermektedir Not Ayrıca" ROI seçimi Piksel olarak ölçülen ROI anahat uzunluğu hakkındaki bilgileri görüntüleyen eklenti penceresinde "uzunluk" satırı içerir.
    5. Oluşturulan "Saat Tarama Profili Çizimi" nde, Gri tonlama görüntüleri için iki, X ve Y veri sütunlarında ve RGB görüntüler için X ve dört Y veri sütununda gösterilen değerleri çizmek için "Liste" komutunu kullanın; bunlardan Y0, Y1, Y2 ve Y3 sütunları, integral ve bireysel (kırmızı, yeşil ve mavi) renk kanalı piksel yoğunluk değerleri ile doldurulacaktır.
  2. Çoklu ROI Saat Tarama eklentisi - birden fazla ROI ile çalışma ( Şekil 2 ):
    1. Birden fazla ROI içeren bir resim açın.
    2. "Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi" yi tıklayarak ROI Yöneticisi'ni açın.
    3. Ardışık olarak özetleyin (adım 2.1.2'ye bakın) ve ROI Yöneticisi penceresine "Ekle" düğmesini tıklatarak ROI Yöneticisine her bir ROI'yi ekleyin; Bunu görüntüdeki tüm ROI'ler için yapın. ROI metrikleri ilgileniyorsa, "Analyze | Measure" komutunu kullanın.
      1. Birden çok parçalı çizgi seçimi örneği için Şekil 2A'ya ve çoklu çokgen seçimlerine örnek olarak Şekil 2E'ye bakınız.
    4. Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için "Eklentiler" menüsünden "Çoklu Saat Taraması" nı seçin.
    5. Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın.
      1. Gerekirse, tarama sınırını adım 2.1.4.2'ye göre sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20'dir.
      2. Gerekirse opt'ı seçinStandart sapma ile çiz "kutusunu işaretleyerek SD çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizmek için kullanın. Bakınız Şekil 2 C ve D.
        NOT: Hesaplanan SD değerleri, farklı nesnelerin ayrılmaz saat tarama profilleri arasındaki değişimi temsil edecektir. Ayrıca eklenti penceresindeki "seçilen ROI'lerin sayısı" ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın.
      3. Protokolü çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın.
    6. Oluşturulan "Saat Tarama Profili Plotu" nda, "Plot Values" penceresinde görüntülenen değerleri çizmek için "List" komutunu kullanın. Renk kanalına göre sütun atanması için "Multi Clock Scan Profile Plot" penceresi göstergesine bakın.
    7. ROI'lerin numaralandırıldığına ve belirli bir renk kanalı için saat tarama profillerinin, ROI'lerin ana hatlarıyla çizildiği ve "ROI Yöneticisi" ne eklendiği sırayla çizildiğine dikkat edin.
  3. MulTiple ROI Saat Tarama eklentisi - bir görüntü yığınıyla çalışmak ( Şekil 3 ):
    1. İlgilenilen bir görüntü yığını açın.
    2. "Çözümle | Araçlar | ROI Yöneticisi" yi tıklayarak ROI Yöneticisi'ni açın.
    3. 2.1.2 ve 2.2.3 adımlarında açıklandığı gibi, yığın içindeki görüntülerin ROI'sini özetleyip ROI yöneticisine ekleyin. ROI metrikleri ilgileniyorsa, "Analyze | Measure" komutunu kullanın.
    4. Protokol seçenekleri açılır penceresini açmak için "Eklentiler" menüsünden "Çoklu Saat Taraması" nı seçin.
    5. Aşağıdakileri yapmak için protokol seçenek penceresini kullanın.
      1. Tarama sınırını adım 2.1.4.2'de açıklandığı gibi sıfırlayın; Varsayılan değer 1.20'dir.
      2. 'Ortalama sapma ile çizim' kutusunu işaretleyerek, SD tarama çubuklarıyla ortalama saat tarama profilini çizme seçeneğini seçin.
        NOT: Hesaplanmış SD değerleri, görüntü stanasında seçilen nesnenin farklı örnekleri arasındaki değişimi temsil edecektirck. Ayrıca, eklenti penceresindeki "sayıdaki yığın sayısı" ile ilgili bilgileri gösteren satırı unutmayın.
      3. Protokolü çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın.
    6. "Saat Tarama Profili Çizimi" penceresinde, "Çizim Değerleri" penceresinde görüntülenen değerleri (Y sütun numarasının yığın içindeki görüntü konumunu temsil ettiği - 1) gösteren değerleri görüntülemek için "Liste" yi tıklayın.

Sonuçlar

Buraya illüstrasyon amacıyla kullanılan resimler, önceki hücre ve doku biyolojik çalışmalarımızda 5 , 6 , 7 ve Allen Mouse Brain Atlas 8'de oluşturulan veritabanlarından alınmıştır. Her iki eklenti de ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 ve Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 program ortamı kullanılarak ...

Tartışmalar

Saat Tarama Protokolü: Saat Tarama protokolü hızlı ve basit bir görüntü analizi aracıdır. Bu protokolün avantajları, görüntü analizinin mevcut yaygın yaklaşımları (doğrusal piksel yoğunluğu taramaları veya ROI'nin ortalama piksel yoğunluğunun hesaplanması gibi) ile karşılaştırıldığında önceki yayınlar 1 , 9'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Kısaca, bu protokol, nesnenin kenarlığı gibi ROI m...

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali çıkarları veya başka çıkar çatışması olmadıklarını beyan ettiler.

Teşekkürler

Fuji ImageJ Saat Tarama eklentisinin kendi versiyonunu bizimle paylaştığımız ve programın bu sürümünü geliştirmemiz için bize ilham verdiğiniz için Dr. Tanja Maritzen'e ve Dr. Fabian Feutlinske'ye (Berlin, Almanya, Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Ayrıca eklentiyi test etmek ve geliştirmek amacıyla bölümünün veri tabanındaki görüntüleri kullanmak için kendi izninizle Dr. Fritz Melchers'a (Lymphocyte Development Departmanı, Max Planck Enfeksiyon Biyolojisi Enstitüsü) teşekkür ediyoruz. Destek: Translasyonel Sinirbilim Merkezi; NIH hibe: P30-GM110702-03.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ComputerAnycompatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan pluginsfreewarehttps://sourceforge.net/projects/clockscan/Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0OriginLabNorthampton, MA, USAThis program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function

Referanslar

  1. Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
  2. Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  4. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  5. Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
  6. Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
  7. Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , 1 (2015).
  8. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
  10. Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).
  11. Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).
  12. Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Temel ProtokolSay 124G r nt analiziy ntemlerh cre biyolojisihistolojiimm nohistokimyaJAVAImageJ eklentisi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır