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요약

이 논문은 'Clock Scan'이미지 분석을위한 두 가지 새로운 ImageJ 플러그인을 설명합니다. 이 플러그인은 원본 Visual Basic 6 프로그램의 기능을 확장하고, 가장 중요한 것은 ImageJ 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지와 함께 번들로 제공하여 대규모 연구 커뮤니티에 프로그램을 제공 할 수있게합니다.

초록

이미지 분석을위한 클록 스캔 프로토콜은 클로즈 또는 세그먼트 화 된 볼록한 관심 영역을 테두리, 내부 및 외부 (배경) 내에서 평균 픽셀 강도를 정량화하는 효율적인 도구로서, 평균 적분 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일. 이 프로토콜은 원래 Visual Basic 6 스크립트로 2006 년에 개발되었지만 배포가 제한적이었습니다. 이 문제를 해결하고 다른 사람들의 비슷한 노력에 동참하기 위해 원본 시계 스캔 프로토콜 코드를 ImageJ 또는 피지 ImageJ와 같은 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 이미지 분석 프로그램과 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 변환했습니다. 또한 이러한 플러그인에는 관심 영역 및 이미지 스택의 여러 분석과 같은 원래 프로토콜의 기능 범위를 확장하여 몇 가지 새로운 기능이 추가되었습니다. 프로그램의 후자의 기능은 변경 사항을 결정하는 것이 중요합니다 응용 프로그램에서 특히 유용합니다시간과 위치. 따라서 생체 이미지 스택의 시계 스캔 분석은 단일 세포 내에서의 Na + 또는 Ca ++ 의 확산뿐 아니라 시냅스 집단에서의 확산 활동 ( 예 : Ca ++ 파도) 분석에 잠재적으로 적용될 수 있습니다 - 연결 또는 갭 접합 - 결합 된 전지. 여기에서는 이러한 새로운 클럭 스캔 플러그인에 대해 설명하고 이미지 분석에서 응용 프로그램의 몇 가지 예를 보여줍니다.

서문

이 작업의 목표는이 유형의 이미지 분석에 관심이있는 모든 연구원이 플랫폼없이 무료로 사용할 수있는 클록 스캔 프로토콜을 제시하는 것입니다. 클럭 스캔 프로토콜은 2006 년 1 월에 개발되었으며 볼록형 관심 영역 (ROI) 내에서 기존의 픽셀 강도 정량화 방법을 개선하기위한 목적으로 개발되었습니다.이 방법은보다 우수한 통합 용량과 향상된 공간 해상도를 제공합니다. 수집하는 동안 프로토콜은 "배경"픽셀 강도를 측정 할 목적으로 ROI 센터에서 경계까지 스캔 한 여러 방사형 픽셀 강도 프로파일 또는 ROI 외부의 미리 결정된 거리를 순차적으로 수집합니다. 프로토콜은 스캔 방향으로 측정 된 셀 반경에 따라 이러한 프로파일의 크기를 조정합니다. 따라서 각 개별 방사형 스캔의 중심에서 ROI 경계까지의 거리는 항상 X 축의 100 %입니다. 마지막으로,이 프로그램은이 Individualu1 개의 통합 된 방사형 픽셀 - 강도 프로파일로 프로파일 링된다. 스케일링 때문에 "클럭 스캔"프로토콜에 의해 생성 된 평균 픽셀 강도 프로필은 ROI 크기 나 ROI 모양에 대한 합리적인 범위 내에서도 결정되지 않습니다. 이 방법을 사용하면 다른 ROI의 프로파일을 직접 비교하거나 필요할 경우 평균화 또는 뺄셈을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 물체 외부에 위치한 픽셀의 평균 강도를 간단히 뺄셈하여 배경 잡음에 대한 모든 물체의 적분 픽셀 강도 프로파일을 수정할 수있게합니다. 그것은 생물학적 샘플에서만 테스트되었지만, 우리의 프로토콜은 원점 (point source)에서 물질의 확산과 같은 물리적 또는 화학적 프로세스의 이미지를 연구하는 데 사용되는 기존의 다른 이미지 분석 도구에 가치있는 추가 기능을 제공합니다 ) 1 .

그러나 원본 이미지 분석 방법의 주요 한계는 프로토콜이비주얼 베이직 6 (VB6) (코드, 따라서 플랫폼에 따라 다르고 배포하기가 어려웠습니다 (VB6 필요).)이 문제를 해결하고 다른 수사관 2 와 비슷한 최근의 노력에 동참하기 위해 VB6 클록 스캔 프로그램 코드를 NIH가 후원하고 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 및 플랫폼 독립적 인 이미지 분석 프로그램 인 ImageJ 3 및 Fiji ImageJ 4 와 호환되는 두 개의 Java 기반 플러그인으로 통합 할 수 있습니다. 여러 개의 ROI와 이미지 스택을 처리하기위한 원래의 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 많은 이미지 분석 애플리케이션은 여러 객체의 통계 분석을 수행하는 것과 관련하여 사용자 친화적이지 않으므로 종종 대표 데이터 만 표시됩니다. 다중 Clock Scan ImageJ 플러그인을 사용하면, 동시에 여러 객체의 분석을 용이하게 할 수 있습니다. 현미경 데이터의 견고한 통계적 평가,단일 셀 / 객체의 신호 강도 분포와 관련하여이 플러그인 확장을 사용하여 가능합니다. 여기에서는 클럭 스캔 플러그인을 설명하고 이미지 분석에서 해당 응용 프로그램의 예를 보여줍니다.

프로토콜

1. 소프트웨어 설치

  1. 번들로 제공되는 Java 및 ImageJ 또는 Fiji ImageJ의 최신 버전을 각 웹 사이트에 권장대로 설치하십시오 (해당 웹 사이트 링크는 자료 표 참조). 아래 텍스트에서 두 프로그램을 모두 "ImageJ"라고합니다.
  2. Materials 테이블에 제공된 링크를 사용하여 "Clock_Scan-1.0.1. jar"및 "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar"플러그인 파일을 복사하여 ImageJ 플러그인 디렉토리에 붙여 넣으십시오. 또는 "플러그인 | 플러그인 설치"메뉴 옵션을 사용하여 파일을 컴퓨터 하드 드라이브에 저장 한 후에 설치하십시오.

2. 클록 스캔 분석

  1. 표준 클럭 스캔 플러그인 ( 그림 1 ) :
    1. ImageJ "File | Open"메뉴 명령을 사용하여 관심있는 이미지를 엽니 다.
    2. '다각형'도구 또는 '세그먼트 선 선택'을 클릭하십시오.도구를 선택한 다음 이미지 위에 그려 전체 ROI 또는이 영역의 세그먼트를 윤곽으로 나타냅니다. 다각형 선택의 예는 그림 1A 를 참조하십시오 (내부 파선 테두리).
      참고 : 소프트웨어에서 사용할 수있는 기타 선택 도구 (직사각형, 타원형 및 프리 핸드 라인 선택)도 사용할 수 있습니다.
    3. 메뉴에서 "Plugins | Clock Scan"을 선택하여 표준 클럭 스캔 프로토콜 팝업 옵션 창을 엽니 다. 이 명령은 개요가 자동으로 추가 된 ROI 관리자 창을 엽니 다.
    4. 플러그인 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
      1. 스크롤 막대를 사용하거나 해당 입력 상자의 값을 변경하여 ROI 센터의 X 및 Y 좌표 (물리적으로 매스 센터의 좌표로 자동 계산 됨)를 검토하고 변경하십시오. 그림 1B 참조.
      2. 객체의 바깥 쪽 배경 영역의 양에 따라스캔으로 덮히려면 "스캔 제한"스크롤 막대를 사용하여 스캔 제한을 조정하십시오. 그림 1A를 참조하십시오.
        참고 : 스캔 제한은 주어진 방향에서 개체의 경계를 넘어서 스캔이 진행되어야하는 거리를 나타내는 분수입니다. 기본값은 스캔 길이가 스캔 방향의 오브젝트 반경보다 20 % 길다는 것을 나타내는 1.20입니다. 도 1a , 바깥 쪽 점선 참조).
      3. "실제 반지름", "배경 빼기", "극좌표 변환"및 / 또는 "표준 편차가있는 플롯"확인란을 사용하여 플러그인의 출력을 수정하십시오.
      4. "확인"을 클릭하여 플러그인을 실행하십시오. 그림 1 C-H를 참조하십시오.
        참고 : "표준 편차"및 "극좌표 변환"또는 "실제 반경"및 "극좌표 변환"을 사용하는 프로토콜 출력의 예(SD) 값은 대상의 방사형 픽셀 강도 스캔 사이의 차이를 나타냅니다. 또한 "ROI 선택"에 유의하십시오. 또한 "ROI"선택 사항은 그림 1C 및 1D 와 그림 1E 및 1F 에 각각 표시됩니다. 픽셀 단위로 측정 된 ROI 개요 길이에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 "길이"행을 선택합니다.
    5. 생성 된 "Clock Scan Profile Plot"에서 "List"명령을 사용하여 그레이 스케일 이미지의 X, Y 열 두 개와 RGB 이미지의 X 및 Y 열 데이터에 표시된 값을 플롯합니다.이 중 Y0, Y1, Y2 및 Y3 열은 정수 및 개별 (빨강, 녹색 및 파랑) 색상 채널 픽셀 강도 값으로 채워집니다.
  2. 다중 ROI 클록 스캔 플러그인 - 다중 ROI ( 그림 2 ) :
    1. ROI가 여러 개인 이미지를 엽니 다.
    2. "Analyze | Tools | ROI Manager"를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다.
    3. 순차적으로 개요 (단계 2.1.2 참조)하고 ROI 관리자 창에서 "추가"를 클릭하여 ROI 관리자에 각 ROI를 추가하십시오. 이미지 내의 모든 ROI에 대해이 작업을 수행하십시오. ROI 메트릭이 중요한 경우 "Analyze | Measure"명령을 사용하십시오.
      1. 다중 분할 라인 선택의 예는 그림 2A 를, 다중 다각형 선택의 예는 그림 2E를 참조 하십시오.
    4. "Plugins"메뉴에서 "Multi Clock Scan"을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다.
    5. 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
      1. 필요한 경우 단계 2.1.4.2에 따라 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다.
      2. 필요한 경우 opt를 선택하십시오.표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation) "상자를 선택하여 SD 막대를 사용하여 평균 클록 스캔 프로파일을 플롯합니다. 그림 2 C 와 D를 참조하십시오.
        참고 : 계산 된 SD 값은 서로 다른 물체의 적분 클럭 스캔 프로파일 간의 편차를 나타냅니다. 또한 플러그인 창에서 "선택한 ROI 수"에 대한 정보가 표시된 행을 기록하십시오.
      3. "확인"을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오.
    6. 생성 된 "Clock Scan Profile Plot"에서 "List"명령을 사용하여 "Plot Values"창에 표시된 값을 플로팅하십시오. 컬러 채널 별 열 지정에 대해서는 "멀티 클록 스캔 프로파일 플롯"창 범례를 참조하십시오.
    7. ROI에는 번호가 매겨지고 주어진 컬러 채널에 대한 클록 스캔 프로파일은 ROI가 윤곽이 그어지고 ROI 관리자에 추가 된 순서와 동일한 순서로 그려집니다.
  3. 멀ROI 클럭 스캔 플러그인 - 이미지 스택 작업 ( 그림 3 ) :
    1. 관심있는 이미지 스택을 엽니 다.
    2. "Analyze | Tools | ROI Manager"를 클릭하여 ROI 관리자를 엽니 다.
    3. 스택 내의 이미지의 ROI를 요약하고 2.1.2 및 2.2.3 단계에서 설명한대로 ROI 관리자에 추가하십시오. ROI 메트릭에 관심이 있다면 "Analyze | Measure"명령을 사용하십시오.
    4. "Plugins"메뉴에서 "Multi Clock Scan"을 선택하여 프로토콜 옵션 팝업 창을 엽니 다.
    5. 프로토콜 옵션 창을 사용하여 다음을 수행하십시오.
      1. 단계 2.1.4.2에서 설명한대로 스캔 제한을 재설정하십시오. 기본값은 1.20입니다.
      2. '표준 편차로 플롯 (Plot with Standard Deviation)'상자를 선택하여 SD 막대가있는 평균 시계 스캔 프로파일을 플롯하는 옵션을 선택하십시오.
        참고 : 계산 된 SD 값은 이미지 sta에서 선택한 오브젝트의 서로 다른 인스턴스 간 차이를 나타냅니다ck. 또한, "스택의 이미지 수"에 대한 정보를 표시하는 플러그인 창에서 라인을 주목하십시오.
      3. "확인"을 클릭하여 프로토콜을 실행하십시오.
    6. "Clock Scan Profile Plot"창에서 "Plot Values"창에 표시된 값을 플롯하려면 "List"를 클릭하십시오. 여기서 Y 열 번호는 스택 내의 이미지 위치를 나타냅니다 (1).

결과

설명 목적으로 여기에 사용 된 이미지는 이전 세포 및 조직 생물학 연구 5 , 6 , 7 및 Allen Mouse Brain Atlas 8 에서 작성된 데이터베이스에서 가져온 것입니다. 두 플러그인 모두 ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 및 피지 ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 프로그램 환경을...

토론

클럭 스캔 프로토콜 : 클록 스캔 프로토콜은 이미지 분석의 빠르고 간단한 도구입니다. 선형 픽셀 강도 스캔 또는 ROI의 평균 픽셀 강도 계산과 같은 기존의 일반적인 이미지 분석 방법과 비교하여이 프로토콜의 이점은 이전 출판물 1 , 9 에 자세히 설명되어 있습니다. 간단히 말해서,이 프로토콜은 물체의 경계선과 같은 ROI 중심으로부터 다?...

공개

저자는 경쟁하는 금전적 이해 관계 또는 다른 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

Fuji ImageJ Clock Scan 플러그인 버전을 우리와 공유하고이 프로그램 버전을 개발하도록 고무시켜 준 Tanja Maritzen 박사와 Fabian Feutlinske 박사 (Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, Berlin, Germany)에게 감사드립니다. 우리는 또한 플 뢰즈 멜 처 박사 (Max Plck Institute for Infection Biology) 림프구 개발 부서 (Department of Fritz Melchers)에게 플러그인 테스트 및 개선 목적으로 그의 부서의 데이터베이스에서 이미지를 사용하는 것에 대한 허락감에 감사드립니다. 지원 : Translational Neurosciences 센터; NIH 교부금 : P30-GM110702-03.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ComputerAnycompatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan pluginsfreewarehttps://sourceforge.net/projects/clockscan/Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0OriginLabNorthampton, MA, USAThis program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function

참고문헌

  1. Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
  2. Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535 (2015).
  3. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  4. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  5. Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
  6. Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
  7. Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , 1 (2015).
  8. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
  10. Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142 (2014).
  11. Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500 (2015).
  12. Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81 (2015).

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