Protocolo de análisis de reloj para análisis de imagen: Plugins de ImageJ

Resumen

Este artículo describe dos nuevos plugins de ImageJ para el análisis de imágenes 'Clock Scan'. Estos plugins amplían la funcionalidad del programa visual basic 6 original y, lo que es más importante, ponen el programa a disposición de una gran comunidad de investigación al agruparla con el paquete de software de análisis de imágenes gratuito ImageJ.

Resumen

El protocolo de exploración de reloj para el análisis de imagen es una herramienta eficaz para cuantificar la intensidad media de píxel dentro, en el borde y fuera (de fondo) de una región de interés convexa en forma convexa cerrada o segmentada, que conduce a la generación de un píxel radial integral integral, Perfil de intensidad. Este protocolo se desarrolló originalmente en 2006, como un guión visual básico 6, pero como tal, tenía una distribución limitada. Para abordar este problema y unir esfuerzos recientes similares de otros, hemos convertido el código original del protocolo de análisis de reloj en dos complementos basados ​​en Java compatibles con programas de análisis de imágenes patrocinados por NIH como ImageJ o ImageJ de Fiji. Además, estos complementos tienen varias funciones nuevas, ampliando aún más el rango de capacidades del protocolo original, como el análisis de múltiples regiones de interés y pilas de imágenes. Esta última característica del programa es especialmente útil en aplicaciones en las que es importante determinar los cambios relacionadosA tiempo y lugar. Por lo tanto, el análisis de la sincronización del reloj de las pilas de imágenes biológicas puede aplicarse potencialmente a la difusión de Na ⁺ o Ca ⁺⁺ dentro de una sola célula, así como al análisis de la propagación de la actividad ( por ejemplo , ondas Ca ⁺⁺ ) en poblaciones de sináptica -conexiones conectadas o unidas a uniones de separación. Aquí, describimos estos nuevos plugins de exploración de reloj y mostrar algunos ejemplos de sus aplicaciones en el análisis de imágenes.

Introducción

El objetivo de este trabajo es presentar un protocolo Clock Scan que esté libre de plataforma y que esté libremente disponible para cualquier investigador interesado en este tipo de análisis de imagen. El protocolo Clock Scan se desarrolló originalmente en 2006 ¹ , con el objetivo de mejorar los métodos existentes de cuantificación de la intensidad de píxeles dentro de las regiones de interés convexas (ROI), un método que tiene una mejor capacidad de integración y una mejor resolución espacial. Durante la adquisición, el protocolo recoge secuencialmente múltiples perfiles radiales de intensidad de píxeles, escaneados desde el centro ROI hasta su borde, oa una distancia predeterminada fuera del ROI con el fin de medir la intensidad del píxel "de fondo". El protocolo escala estos perfiles según el radio de la célula, medido en la dirección de la exploración. Por lo tanto, la distancia desde el centro hasta el borde de ROI de cada exploración radial individual es siempre el 100% de la escala X. Por último, el programa promedia estosAl en un perfil integral radial de intensidad de píxeles. Debido a la escala, el perfil de intensidad de píxel medio, producido por el protocolo "Clock Scan", no depende del tamaño del ROI ni, dentro de límites razonables, de la forma de ROI. Este método permite la comparación directa o, si es necesario, el promedio o la sustracción de perfiles de diferentes ROI. El protocolo también permite la corrección de los perfiles integrales de intensidad de píxel, de cualquier objeto para el ruido de fondo, mediante una simple sustracción de la intensidad media de píxeles situados fuera del objeto. Aunque sólo ha sido probado en muestras biológicas, nuestro protocolo proporciona una valiosa adición a otras herramientas de análisis de imágenes existentes utilizadas en estudios de imágenes de procesos físicos o químicos que están dispuestos alrededor de un punto de origen (como la difusión de sustancias desde una fuente puntual ) ¹ .

Sin embargo, la principal limitación del método de análisis de imagen original era que el protocolo era devEloped como un Visual Basic 6 (VB6) (código, y por lo tanto, era dependiente de la plataforma y difícil de distribuir (que requieren VB6). Para abordar este problema y unirse a esfuerzos recientes similares por otros investigadores ² , convertimos el VB6 Clock Scan Código de programa en dos complementos basados ​​en Java, compatibles con los programas de análisis de imágenes open-source y independiente de plataforma patrocinados por NIH, ImageJ ³ y Fiji ImageJ ^4. Además, estos plugins tienen ahora varias funciones nuevas que expanden la capacidad Del protocolo original para procesar múltiples ROIs y pilas de imagen.Muchas aplicaciones de análisis de imágenes no son fáciles de usar, con respecto a la realización de análisis estadístico de objetos múltiples, y por lo tanto, a menudo sólo los datos representativos se muestran.Con el complemento de Clock Clock ScanJim, Es posible facilitar el análisis de objetos múltiples simultáneamente.Una evaluación estadística robusta de los datos de microscopía,Con respecto a la distribución de la intensidad de señal en células / objetos individuales, ahora es posible con esta extensión de complemento. Aquí describimos los plugins de la exploración de reloj y mostramos ejemplos de sus aplicaciones en el análisis de imágenes.

Protocolo

1. Instalación del software

1. Instale las últimas versiones de Java y ImageJ o Fiji ImageJ como se recomienda en los respectivos sitios web (vea la tabla de materiales para los enlaces a los sitios web correspondientes). En el texto a continuación, ambos programas se denominan "ImageJ".
2. Copie los archivos de plugins "Clock_Scan-1.0.1. Jar" y "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" utilizando el enlace proporcionado en la tabla de materiales y péguelos en el directorio de plugins de ImageJ. Como alternativa, use la opción de menú "Plugins | Install plugin" para instalar estos archivos después de haberlos guardado en el disco duro del ordenador.

2. Análisis de la exploración del reloj

1. Plugin de exploración del reloj estándar ( Figura 1 ):
   1. Utilice el comando de menú "Archivo | Abrir" de ImageJ para abrir una imagen de interés.
   2. Haga clic en la herramienta 'polígono' o 'selección de línea segmentada', Y luego dibujar en la imagen para delinear el ROI completo o un segmento de esta región. Vea la Figura 1 A para un ejemplo de selección de polígonos (contorno interior discontinuo).
      NOTA: También se pueden usar otras herramientas de selección, disponibles en el software (selección de rectángulo, oval y de línea libre).
   3. Seleccione "Plugins | Clock Scan" en el menú para abrir la ventana de opciones emergentes del protocolo de análisis de reloj estándar. Tenga en cuenta que este comando también abrirá la ventana Administrador de ROI con el esquema agregado automáticamente a él.
   4. Utilice la ventana de opciones del complemento para hacer lo siguiente.
      1. Revise y cambie las coordenadas X e Y del centro de ROI (calculadas automáticamente como coordenadas del centro de masa física) utilizando barras de desplazamiento o cambiando los valores en los cuadros de entrada correspondientes. Vea la Figura 1 B.
      2. Dependiendo de la cantidad de la región de fondo fuera del objeto shoPuede ser cubierto por el escaneado, ajuste los límites de escaneado utilizando la barra de desplazamiento "límite de escaneado". Vea la Figura 1 A.
         NOTA: El límite de exploración es el número fraccionario que representa hasta qué punto el escaneo debe proceder más allá del borde de los objetos en cualquier dirección dada; El valor predeterminado es 1.20, lo que indica que la longitud de la exploración será 20% más larga que el radio del objeto en la dirección de la exploración; Ver Figura 1 A , línea punteada externa).
      3. Modifique la salida del complemento utilizando las casillas de verificación "radio real", "substraer fondo", "transformar polar" y / o "trazar con desviación estándar".
      4. Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el complemento. Véase la figura 1 C-H .
         NOTA: Ejemplos de la salida del protocolo con "gráfico con desviación estándar" y "transformada polar" o "radio real" y "transf polar"Orm "seleccionadas se muestran en la Figura 1 C y 1D y Figura 1 E y 1 F. Obsérvese que los valores calculados de desviación estándar (SD) representan la variación entre las exploraciones de intensidad de píxeles radiales individuales del objeto.También tenga en cuenta la" selección ROI Longitud "en la ventana del complemento, que muestra la información sobre la longitud del esquema ROI medida en píxeles.
   5. En el "Trazado de perfil de exploración de reloj" generado, utilice el comando "Listar" para trazar valores mostrados en dos columnas X e Y de datos para imágenes en escala de grises y en X y cuatro columnas Y de imágenes RGB, Las columnas Y1, Y2 e Y3 se llenarán con valores de intensidad de píxeles de canal de color integrales e individuales (rojo, verde y azul).
2. Múltiples ROI Clock Scan plugin - trabajando con múltiples ROI ( Figura 2 ):
   1. Abra una imagen que contenga varios ROI.
   2. Abra el Administrador de ROI haciendo clic en "Analyze | Tools | ROI Manager".
   3. Haga un bosquejo secuencial (consulte el paso 2.1.2) y añada cada ROI al Gestor de ROI haciendo clic en "Agregar" en la ventana Administrador de ROI; Haga esto para todos los ROI dentro de la imagen. Utilice el comando "Analyze | Measure" si las métricas ROI son de interés.
      1. Vea la Figura 2 A para un ejemplo de selecciones de líneas segmentadas múltiples y la Figura 2 E para un ejemplo de múltiples selecciones de polígonos.
   4. Seleccione "Multi Clock Scan" en el menú "Plugins" para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo.
   5. Utilice la ventana de opciones de protocolo para hacer lo siguiente.
      1. Si es necesario, restablezca el límite de escaneo según el paso 2.1.4.2; El valor predeterminado es 1,20.
      2. Si es necesario, seleccione la opciónIon para trazar el perfil de barrido de reloj medio con barras SD marcando la casilla "Trazar con desviación estándar". Véase la figura 2 C y D.
         NOTA: Los valores de SD calculados representarán la variación entre los perfiles de exploración de reloj integrales de diferentes objetos. Además, anote la línea en la ventana del complemento mostrando información sobre el "número de ROIs seleccionados".
      3. Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el protocolo.
   6. En el "Trazado del perfil de exploración de reloj" generado, utilice el comando "Listar" para trazar los valores mostrados en la ventana "Valores de trazado". Vea la leyenda de la ventana "Trazado del perfil de exploración de varios relojes" para la designación de columnas por canal de color.
   7. Tenga en cuenta que los ROI están numerados y sus perfiles de exploración de reloj para cualquier canal de color dado se representan en la misma secuencia en la que se describieron los ROI y se agregaron al "ROI Manager".
3. MulTiple ROI Plugin de exploración de reloj - trabajando con una pila de imágenes ( Figura 3 ):
   1. Abra una pila de imágenes de interés.
   2. Abra el Administrador de ROI haciendo clic en "Analyze | Tools | ROI Manager".
   3. Describa el ROI de las imágenes dentro de la pila y agréguelas al administrador de ROI como se describe en los pasos 2.1.2 y 2.2.3. Utilice el comando "Analyze | Measure" si las métricas ROI son de interés.
   4. Seleccione "Multi Clock Scan" en el menú "Plugins" para abrir la ventana emergente de opciones de protocolo.
   5. Utilice la ventana de opciones de protocolo para hacer lo siguiente.
      1. Restablezca el límite de exploración como se describe en el paso 2.1.4.2; El valor predeterminado es 1,20.
      2. Seleccione la opción para trazar el perfil de barrido de reloj medio con barras SD marcando la casilla "Trazar con desviación estándar".
         NOTA: Los valores de SD calculados representarán la variación entre diferentes instancias del objeto seleccionado en la imagen staCk Además, tenga en cuenta la línea en la ventana de complemento que muestra información sobre el "número de imágenes en la pila".
      3. Haga clic en "Aceptar" para ejecutar el protocolo.
   6. En la ventana "Trazado de perfil de exploración de reloj", haga clic en "Listar" para trazar los valores mostrados en la ventana "Valores de trazado", donde el número de columna Y representa la posición de la imagen dentro de la pila - 1.

Resultados

Las imágenes que se utilizan aquí con fines ilustrativos, se toman de las bases de datos creadas durante nuestros anteriores estudios biológicos de células y tejidos ^{5 , 6 , 7} y de Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Ambos plugins se probaron con éxito utilizando el entorno de programa ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 y Fiji ImageJ 2.0...

Discusión

Clock Scan Protocol: El protocolo Clock Scan es una herramienta rápida y sencilla de análisis de imágenes. Las ventajas de este protocolo, en comparación con los enfoques comunes existentes de análisis de imágenes (tales como exploraciones de intensidad de píxeles lineal o cálculo de la intensidad media de píxel del ROI), se han descrito en detalle en publicaciones anteriores ^{1 , 9} . En pocas palabras, este protocolo permite la generaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function