Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

Zusammenfassung

In diesem Beitrag werden zwei neue ImageJ-Plugins für die "Clock Scan" -Bildanalyse beschrieben. Diese Plugins erweitern die Funktionalität des ursprünglichen Visual Basic 6 Programms und stellen vor allem das Programm einer großen Forschungsgemeinschaft zur Verfügung, indem sie es mit dem ImageJ Free Image Analysis Softwarepaket bündeln.

Zusammenfassung

Das Taktabtastprotokoll für die Bildanalyse ist ein effizientes Werkzeug, um die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb, an der Grenze und außerhalb (Hintergrund) eines geschlossenen oder segmentierten konvexen Bereichs von Interesse zu quantifizieren, was zur Erzeugung eines gemittelten integralen radialen Pixel- Intensitätsprofil. Dieses Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 als visuelles Basic 6-Skript entwickelt, aber als solches hatte es eine begrenzte Verteilung. Um dieses Problem zu lösen und ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen zu verknüpfen, haben wir den ursprünglichen Taktsuchprotokollcode in zwei Java-basierte Plugins umgewandelt, die mit NIH-gesponserten und frei verfügbaren Bildanalyseprogrammen wie ImageJ oder Fiji ImageJ kompatibel sind. Darüber hinaus haben diese Plugins mehrere neue Funktionen, die den Umfang der Fähigkeiten des ursprünglichen Protokolls weiter ausbauen, wie etwa die Analyse mehrerer interessanter Bereiche und Bildstapel. Das letztere Merkmal des Programms ist besonders nützlich bei Anwendungen, bei denen es wichtig ist, Änderungen zu ermittelnZu Zeit und Ort. So kann die Taktsuchanalyse von Stapeln biologischer Bilder potentiell auf die Ausbreitung von Na ⁺ oder Ca ⁺⁺ innerhalb einer einzelnen Zelle sowie auf die Analyse der Ausbreitungsaktivität ( z. B. Ca ^{++ -} Wellen) in Populationen synaptisch angewendet werden Zusammengesetzte oder spaltübergreifende Zellen. Hier beschreiben wir diese neuen Uhren-Scan-Plugins und zeigen einige Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

Einleitung

Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein Clock Scan-Protokoll zu präsentieren, das plattformfrei und frei verfügbar für jeden Forscher ist, der an dieser Art von Bildanalyse interessiert ist. Das Clock Scan-Protokoll wurde ursprünglich im Jahr 2006 entwickelt, mit dem Ziel, bestehende Methoden der Pixelintensitätsquantifizierung in konvex-förmigen Regionen von Interesse (ROI) zu verbessern, ein Verfahren, das eine bessere Integrationsfähigkeit und eine verbesserte räumliche Auflösung aufweist. Während der Erfassung sammelt das Protokoll sequentiell mehrere radiale Pixelintensitätsprofile, die vom ROI-Zentrum bis zu seinem Rand abgetastet werden, oder auf eine vorbestimmte Distanz außerhalb des ROI zum Zwecke der Messung der "Hintergrund" -Pixelintensität. Das Protokoll skaliert diese Profile nach dem Zellenradius, gemessen in Richtung des Scans. Somit ist der Abstand von der Mitte zur ROI-Grenze jedes einzelnen radialen Scans immer 100% der X-Skala. Schließlich übertrifft das Programm diese IndividuenAl-Profilen zu einem integralen radialen Pixel-Intensitäts-Profil. Wegen der Skalierung hängt das mittlere Pixel-Intensitätsprofil, das durch das "Clock Scan" -Protokoll erzeugt wird, weder von der ROI-Größe noch von vernünftigen Grenzen auf die ROI-Form ab. Diese Methode ermöglicht einen direkten Vergleich oder, falls erforderlich, Mittelwertbildung oder Subtraktion von Profilen unterschiedlicher ROIs. Das Protokoll erlaubt auch eine Korrektur der integralen Pixelintensitätsprofile, eines beliebigen Objekts für Hintergrundrauschen, durch eine einfache Subtraktion der durchschnittlichen Intensität von Pixeln, die sich außerhalb des Objekts befinden. Obwohl es nur in biologischen Proben getestet wurde, bietet unser Protokoll eine wertvolle Ergänzung zu anderen vorhandenen Bildanalyse-Werkzeugen, die in Studien von Bildern von physikalischen oder chemischen Prozessen verwendet werden, die um einen Ursprungsort herum angeordnet sind (wie die Diffusion von Substanzen aus einer Punktquelle ) ¹ .

Allerdings war die Hauptbeschränkung der ursprünglichen Bildanalyse Methode, dass das Protokoll dev warAls ein Visual Basic 6 (VB6) (Code, und daher war es plattformabhängig und schwer zu verteilen (erfordern VB6). Um dieses Problem zu lösen und um ähnliche jüngsten Bemühungen von anderen Forschern ² beitreten, konvertierten wir die VB6 Clock Scan Programmcode in zwei Java-basierte Plugins, kompatibel mit den NIH-geförderten und frei verfügbaren Open-Source- und plattformunabhängigen Bildanalyseprogrammen, ImageJ ³ und Fiji ImageJ ^4. Darüber hinaus haben diese Plugins nun mehrere neue Funktionen, die die Leistungsfähigkeit erweitern Des ursprünglichen Protokolls, um mehrere ROIs und Bildstapel zu verarbeiten Viele Bildanalyseanwendungen sind nicht benutzerfreundlich, was die statistische Auswertung mehrerer Objekte anbelangt und so werden oft nur repräsentative Daten angezeigt. Mit dem Multi Clock Scan ImageJ Plugin, Es ist möglich, die Analyse mehrerer Objekte gleichzeitig zu erleichtern. Eine robuste statistische Auswertung von Mikroskopiedaten,In Bezug auf die Signalintensitätsverteilung in einzelnen Zellen / Objekten ist nun mit dieser Plugin-Erweiterung möglich. Hier beschreiben wir die Clock Scan Plugins und zeigen Beispiele für ihre Anwendungen in der Bildanalyse.

Protokoll

1. Software-Installation

1. Installieren Sie die neuesten Versionen von gebündeltem Java und entweder ImageJ oder Fiji ImageJ wie auf den jeweiligen Webseiten empfohlen (siehe Materialtabelle für Links zu den entsprechenden Websites). Im folgenden Text werden beide Programme als "ImageJ" bezeichnet.
2. Kopiere die Plugin-Dateien "Clock_Scan-1.0.1. Jar" und "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" mit dem in der Materialtabelle enthaltenen Link und füge sie in das ImageJ-Plugin-Verzeichnis ein. Alternativ verwenden Sie bitte die Option "Plugins | Install Plugin", um diese Dateien zu installieren, nachdem sie auf der Festplatte des Computers gespeichert wurden.

2. Clock Scan Analyse

1. Standard Clock Scan Plugin ( Abbildung 1 ):
   1. Verwenden Sie den Menübefehl ImageJ "File | Open", um ein interessantes Bild zu öffnen.
   2. Klicken Sie auf das Werkzeug 'Polygon' oder 'segmentierte Zeilenauswahl'Werkzeug, und zeichne dann auf das Bild, um den gesamten ROI oder ein Segment dieser Region zu skizzieren. Siehe Abbildung 1 A für ein Beispiel der Polygonauswahl (innere gestrichelte Kontur).
      HINWEIS: Andere Auswahlwerkzeuge, die in der Software (rechteckige, ovale und freihändige Zeilenauswahl) zur Verfügung stehen, können ebenfalls verwendet werden.
   3. Wählen Sie "Plugins | Clock Scan" aus dem Menü, um das Standard-Takt-Scan-Protokoll-Popup-Fenster zu öffnen. Beachten Sie, dass dieser Befehl auch das ROI Manager-Fenster öffnet, wobei die Gliederung automatisch hinzugefügt wird.
   4. Verwenden Sie das Plugin-Optionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Überprüfen und ändern Sie die X- und Y-Koordinaten des ROI-Zentrums (automatisch als Koordinaten des physikalischen Massenzentrums berechnet), indem Sie Bildlaufleisten verwenden oder die Werte in den entsprechenden Eingabefeldern ändern. Siehe Abbildung 1 B.
      2. Je nachdem, wie viel von der Hintergrundregion außerhalb des Objekts shoSollte durch das Scannen abgedeckt werden, die Scan-Limits anpassen, indem Sie die Scroll-Leiste "Scan-Limit" verwenden. Siehe Abbildung 1 A.
         HINWEIS: Scan-Limit ist die Bruchzahl, die angibt, wie weit der Scan über die Grenze der Objekte hinausgehen sollte. Der Standardwert ist 1,20, was anzeigt, dass die Scanlänge 20% länger als der Objektradius in Richtung des Scans ist; Siehe Abbildung 1 A , äußere gestrichelte Linie).
      3. Ändern Sie die Ausgabe des Plugins mit "Real Radius", "Subtrahieren Hintergrund", "Polare Transformation" und / oder die "Plot mit Standardabweichung" Kontrollkästchen.
      4. Klicken Sie auf "OK", um das Plugin auszuführen. Siehe Abbildung 1 C-H .
         HINWEIS: Beispiele für die Ausgabe des Protokolls mit "Plot mit Standardabweichung" und "Polare Transformation" oder "Realradius" und "Polar TransfOrm "-Optionen sind in Abbildung 1 C und 1D und Abbildung 1 E bzw. 1F dargestellt. Beachten Sie, dass die berechneten Standardabweichung (SD) die Veränderung zwischen einzelnen radialen Pixelintensitätsscans des Objekts darstellen. Beachten Sie auch die" ROI-Auswahl " Länge "im Plugin-Fenster, die die Informationen über die ROI-Gliederungslänge anzeigt, die in Pixeln gemessen wird.
   5. In dem erzeugten "Clock Scan Profile Plot" verwenden Sie den Befehl "List", um Werte anzuzeigen, die in zwei, X- und Y-Spalten von Daten für Graustufenbilder und in X- und vier Y-Spalten von Daten für RGB-Bilder dargestellt werden, von denen Y0, Y1, Y2 und Y3 werden mit integralen und individuellen (roten, grünen und blauen) Farbkanalpixelintensitätswerten gefüllt.
2. Mehrere ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit mehreren ROI ( Abbildung 2 ):
   1. Öffnen Sie ein Bild mit mehreren ROI.
   2. Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf "Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager" klicken.
   3. Sequenziell skizzieren (siehe Schritt 2.1.2) und füge jeden ROI dem ROI Manager hinzu, indem du im ROI Manager-Fenster auf "Hinzufügen" klickst. Tu das für alle ROIs im Bild. Verwenden Sie den Befehl "Analysieren | Messen", wenn ROI-Metriken von Interesse sind.
      1. Siehe Abbildung 2 A für ein Beispiel für mehrere segmentierte Zeilenauswahl und Abbildung 2 E für ein Beispiel für mehrere Polygonauswahl.
   4. Wählen Sie im Menü "Plugins" die Option "Multi Clock Scan", um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen.
   5. Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Falls erforderlich, setzen Sie den Scan-Grenzwert nach Schritt 2.1.4.2 zurück; Der Standardwert ist 1,20.
      2. Wenn nötig, wählen Sie das optIonen, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem man die "Plot mit Standardabweichung" -Kasten überprüft. Siehe Abbildung 2 C und D.
         HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen integrierten Taktsuchprofilen verschiedener Objekte dar. Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die "Anzahl ausgewählter ROIs".
      3. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll auszuführen.
   6. In der generierten "Clock Scan Profile Plot" verwenden Sie den Befehl "List", um die im Fenster "Plot Values" angezeigten Werte darzustellen. Siehe "Multi Clock Scan Profile Plot" Fenster Legende für Spaltenbezeichnung nach Farbkanal.
   7. Beachten Sie, dass die ROIs nummeriert sind und ihre Taktsuchprofile für einen beliebigen Farbkanal in der gleichen Reihenfolge aufgetragen sind, in der die ROIs skizziert und dem "ROI Manager" hinzugefügt wurden.
3. MulTip ROI Clock Scan Plugin - Arbeiten mit einem Bildstack ( Abbildung 3 ):
   1. Öffne einen Bildstapel von Interesse.
   2. Öffnen Sie den ROI Manager, indem Sie auf "Analysieren | Werkzeuge | ROI Manager" klicken.
   3. Planen Sie den ROI der Bilder im Stapel und fügen Sie ihn dem ROI-Manager hinzu, wie in den Schritten 2.1.2 und 2.2.3 beschrieben. Verwenden Sie den Befehl "Analysieren | Messen", wenn die ROI-Metriken von Interesse sind.
   4. Wählen Sie im Menü "Plugins" die Option "Multi Clock Scan", um das Popup-Fenster für die Protokolloptionen zu öffnen.
   5. Verwenden Sie das Protokolloptionsfenster, um Folgendes auszuführen.
      1. Setzen Sie die Scan-Grenze wie in Schritt 2.1.4.2 beschrieben zurück; Der Standardwert ist 1,20.
      2. Wählen Sie die Option, um das mittlere Takt-Scan-Profil mit SD-Balken zu markieren, indem Sie das Feld 'Plot mit Standardabweichung' markieren.
         HINWEIS: Die berechneten SD-Werte stellen eine Variation zwischen verschiedenen Instanzen des im Bild sta markierten Objekts darCk Beachten Sie auch die Zeile im Plugin-Fenster mit Informationen über die "Anzahl der Bilder im Stack".
      3. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll auszuführen.
   6. Im Fenster "Clock Scan Profile Plot" klicken Sie auf "List", um die im Fenster "Plot Values" angezeigten Werte darzustellen, wobei die Y-Spaltennummer die Bildposition innerhalb des Stacks darstellt - 1.

Ergebnisse

Die Bilder, die hier zur Veranschaulichung verwendet werden, stammen aus Datenbanken, die während unserer früheren Zelle und Gewebe biologischen Studien ^{5 , 6 , 7} und aus dem Allen Maus Gehirn Atlas ^{8 erstellt wurden} . Beide Plugins wurden erfolgreich mit ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 und Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1...

Diskussion

Clock Scan Protocol: Das Clock Scan Protokoll ist ein schnelles und einfaches Werkzeug der Bildanalyse. Die Vorteile dieses Protokolls im Vergleich zu bestehenden gemeinsamen Ansätzen der Bildanalyse (wie z. B. lineare Pixelintensitätsscans oder Berechnung der mittleren Pixelintensität des ROI) wurden in den vorangegangenen Publikationen ^{1 , 9} ausführlich beschrieben. Kurz gesagt ermöglicht dieses Protokoll die Erzeugung von integralen radi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function