评估血脑屏障网状血管形成和破坏的体外测定

摘要

维持血脑屏障覆盖是中枢神经系统稳态的关键。该方案描述体外技术来描绘调节血脑屏障覆盖的基础和病理过程。

摘要

血脑屏障（BBB）覆盖在中枢神经系统（CNS）的体内平衡中起着核心作用。 BBB由星形胶质细胞，周细胞和脑内皮细胞（BEC）动态维持。在这里，我们详细介绍使用永生化人类BEC的单一培养物，原代小鼠BEC的单一培养物和BBB的人源化三联培养模型（BEC，星形胶质细胞和周细胞）评估BBB覆盖率的方法。为了突出测定对疾病状态的适用性，我们描述了低聚淀粉样蛋白β（oAβ）对阿尔茨海默病（AD）进展的重要影响，对BBB覆盖的影响。此外，我们利用表皮生长因子（EGF）来阐明该技术的药物筛选潜力。我们的研究结果表明，单一和三重培养的BEC在基础条件下形成网状结构，并且oAβ破坏了这种细胞网状结构，并使预成型的网状结构退化，但EGF阻止了这种中断。因此，描述的技术对于解剖调节BBB覆盖的基础和疾病相关过程是重要的。

引言

大脑毛细血管的血脑屏障（BBB）是血液与脑接触的最大界面，在中枢神经系统（CNS） ^1,2的稳态中起着核心作用。 BBB的动态过程阻止从血液中吸收不需要的分子，从CNS中除去废物，向CNS提供必需的营养物质和信号分子，并调节神经炎症^1,2,3,4,5 。 BBB损伤在老化过程中是普遍存在的，并且包括阿尔茨海默病（AD），多发性硬化和中风^{1，2，3，4，5 ，}ass ="xref"> 6。因此，BBB功能障碍可能在神经变性疾病中起关键作用，包括作为治疗靶点。

保持血管覆盖对于BBB的稳态功能是重要的。然而， 在体内和体外数据上是否涉及神经退行性疾病的过程引起更高或更低的BBB覆盖度6,7,8,9,10,11,12,13，特别是在AD中。因此，使用相关细胞类型的体外模型的发展有很强的理由来评估和更全面地了解BBB覆盖的动态。脑毛细血管由星形胶质细胞，周细胞和脑内皮细胞（BECs）组成， ^{3。所有细胞类型通过结构支持和通过分泌效应分子（如血管生成生长因子，细胞因子和趋化因子）有助于BBB的功能，其作用在旁分泌和自分泌样的方式。然而，BBB的主效应细胞是BEC3。通常，用于评估BBB功能的细胞培养技术是在加入应激物14,15,16之后对在滤器插入物上生长的细胞进行渗透性测定，或评估关键BEC蛋白的水平。虽然重要的是，这些检测不集中在脑血管覆盖。}

这里，我们以前的方法¹⁷是详细的，以评估使用永生化人类BEC的单一培养物，原代小鼠BEC的单一培养物和人源化三重培养物的BEC覆盖和网状结构BBB的模型（BECs，星形胶质细胞和周细胞）。目标是证明对于BEC覆盖，被认为是AD进展的重要因素的oAβ的有害作用。表皮生长因子（EGF）的保护作用突出了该技术作为治疗筛选工具的潜力。该技术对于基础和应用研究具有几个广泛的应用，包括:1）描述特定途径对血管生成和血管覆盖的作用，2）评估疾病和衰老相关因素对血管生成和血管覆盖的影响，以及3）鉴定药理学目标。

研究方案

所有实验均遵循伊利诺斯大学芝加哥体育动物护理和使用委员会协议。

一般准备

注意:脑微血管内皮细胞系（hCMEC / D3）是广泛表达的永生化人类BEC细胞系14,15,16,18,19。在基底内皮生长基础培养基中培养hCMEC / D3细胞在包被I型胶原（小牛皮，Hank的含有Ca ²⁺和Mg ^2+的 Hank平衡盐溶液（HBSS）中的0.1％溶液1:20稀释）的组织培养瓶上培养（EBM-2），每500 mL培养基中含有2-5％胎牛血清（FBS），10％抗坏血酸，10％硫酸庆大霉素，25％氢化可的松和提供的生长因子补充剂总体积的1/4，血管内皮细胞（VEGF），表皮生长因子（EGF），胰岛素样生长因子1（IGF-1）和人类碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），参见材料表 。
注意:具有FBS和生长因子的EBM-2培养基称为"EBM-2完整"。没有FBS和补充剂的EBM-2被称为"EBM-2基础"。在完全融合时，hCMEC / D3细胞为〜1×10 ^5个细胞/ cm ² 。

1. 通过首先用HBSS孵育3分钟，不含Ca ²⁺和Mg ^2+，然后用5mL胰蛋白酶/ EDTA（0.25％）分离5分钟，以1:5的比例通过hCMEC / D3细胞。使用EBM-2（1:1中和）中和胰蛋白酶，并在4℃下以290 xg离心5分钟;丢弃上清液。将EBM-2中的沉淀物重新悬浮，并以1:5的比例重新平板化。
2. 根据供应商的协议[ 材料表 ]培养主要的人周细胞和星形胶质细胞。文化视角e周围细胞在周边细胞基础培养基中与FBS和周细胞生长补充。
3. 在包含星形胶质细胞生长因子的星形胶质细胞培养人星形胶质细胞。培养包被3mL聚-L-赖氨酸（PLL）的组织培养瓶中的细胞周围细胞和星形细胞，用于细胞粘附，并利用第2代和第5代之间的细胞。
4. 安乐死7只小鼠，用镊子去除脑干和小脑;通过仔细地滚动大脑在纱布上分离脑膜。用无菌剃刀刀片将HEPES（每脑5 mL）在最小基本培养基（MEM）中培养皿中的剩余脑组织。根据参考方案²⁰从2个月大的C57BL / 6J小鼠分离主要小鼠BEC。
5. 将切碎的脑组织转移到15 mL锥形管中。在4℃下以290xg离心5分钟。去除上清液并孵育木瓜蛋白酶（每脑833.33μL）和DNase（每脑41.7μL）的组织溶液，在37℃水浴中1小时，消化组织。
6. 将匀浆依次通过19和21号针头，用22％牛血清白蛋白（BSA）溶液与1:1比例混合，并在4℃下以1360×g离心10分钟。
7. 将所得沉淀重悬于1mL EBM-2中，并在4℃以290×g离心5分钟。再次重悬在1mL EBM-2中，并在涂有胶原蛋白的6孔板（每孔1个脑）上平板培养细胞（1mL /孔）。
8. 24小时后用含4μg/ mL嘌呤霉素盐酸盐的EBM-2更换培养基; 2天后用EBM-2替换完成。对于hCMEC / D3细胞培养初级BEC，并以1×10 ^5个细胞/ cm ²完全汇合。
9. 在测定前24小时准备100μM的oAβ。
   注意:oAβ被认为是A的疾病相关形式。对于oAβ，使用Dahlgre描述的良好表征的制剂n et al。 ²¹ 。
10. 在4℃下将基底膜储存溶液解冻过夜，并将其等分成无菌PCR管条（8管），每管140μL基底膜。每个条带重新冻结，并在-20°C储存。在测定前24小时，在4℃下，每96孔板解冻一条。预先冷却移液器吸头以避免凝固。
    注意:所有处理基底膜基质必须在冰上进行，以避免快速凝固。由于在测定当天使用10μL/孔的基底膜，每个条带对于一个96孔板是足够的。
11. 在分析前24小时，在EBM-2基础中孵育完全汇合的BEC。
    注意:理由是:EBM-2完整包含补充因子和FBS，目的是促进最佳细胞生长;然而，促进细胞生长的相同分子途径对于脑内皮细胞的覆盖和动力学也是重要的，无论是在存在还是脱落一个压力源。因此，我们血清和补充剂使BECs减少细胞信号通路残留激活的混杂效应。值得注意的是，在测定之前，胰蛋白酶化细胞的中和期间细胞短暂（5分钟）暴露于FBS。与BEC相反，由于需要不同的生长因子和这些细胞类型对血清饥饿的反应的不稳定性（Tai实验室，未发表的观察），周细胞和星形胶质细胞不是血清饥饿。
    注意:EBM-2基础在测定期间用于单次和三次培养的网状物形成和破碎测定。这对于防止混淆压力或依赖治疗信号至关重要。

网格化形成和中断测定

1. 单次BEC培养测定:
   注意:BEC的单一培养物的三种不同范例如图1A所示。每个范例旨在评估BEC在不同船舶覆盖范围内的响应。范式1是网格形成。该范例旨在检查压力源和/或治疗对血管生成和网状形成的影响。 BECs，oAβ和处理均在0小时时间内加入板中。范式2是预防网络中断。在生长因子或药物存在下接种细胞并孵育4小时以形成网状结构。在这种情况下，应激者oAβ在4小时后加入。这种范例评估了治疗预防压力引起的预成形网状结构损伤的能力。范例3同时处理网状物的破裂。将细胞电镀并允许形成网状结构4小时。然后在4小时时间点同时加入治疗和oAβ，评估预先形成的细胞网络响应各种治疗的能力。所有范例除了相似的常规步骤，除了治疗时间的差异添加。
   1. 在测定当天，将基底膜基质以10μL/孔移液到96孔板的底部，并允许在37℃下放置1小时。
   2. 将冻干的绿色细胞跟踪染料（ 参见表材料 ）悬浮于10μLDMSO中以产生10mM储备溶液，并在EBM-2基础中稀释至10μM（1:1000）。从完全汇合的烧瓶中取出培养基，并用含有绿色细胞跟踪染料的EBM-2基底代替（对于75cm ^2的烧瓶为5mL）。在开始测定前20分钟，用绿色细胞跟踪染料预加载BEC。
   3. 在37℃下孵育细胞20-30分钟，用细胞追踪染料除去培养基，并如步骤1.1所述分离细胞。用含有10％FBS的EBM-2中和培养基，并在4℃以240xg离心5分钟。将沉淀重悬于1mL的EBM-2基础中。
   4. 在EBM-2基底（所有范例的0小时时间点）以10,000个细胞/孔将96孔板中的BEC平板化。
      注意:根据正在使用的范例，在指定的时间点添加治疗，压力源或车辆控制。在所有范例中，收集培养基用于随后的分析（ 例如 ELISA分析），并将细胞在PBS缓冲液（PBS）中用新鲜制备的4％多聚甲醛固定24小时。作为确定oAβ对网格形成的术语影响的替代方法，可以修改方案以用oAβ预孵育汇合的细胞培养瓶，然后进行网格形成范例（+/-oAβ）。
      注意:所有范例的每个孔的最终体积为70μL。所有处理（oAβ，EGF 等 ）以1:20的稀释度加入其各自的孔中， 即每次处理3.5μL。对于范例1，将细胞以63μL/ w加入细胞悬液中埃尔。立即将oAβ，所需处理和对照加入3.5μL/孔，共计70μL。对于范例2，在0小时时间点加入63μL细胞悬浮液和3.5μL处理（ 例如 100ng / mL EGF）。孵育4小时后，加入3.5μL的oAβ原液（ 例如，对于100nM的最终的oAβ浓度，3.5μL的2μM的oAβ原液）。对于范例3，在0小时时间点加入63μL细胞悬浮液，并在4小时时加入oAβ，并以3.5μL/孔加入所需的处理，共计70μL。这些体积可以根据治疗进行调整。例如，如果只需要一个处理，则可以将细胞悬液体积调节至66.5μL（维持10,000个细胞/孔），并且处理体积可以保持在3.5μL。
2. 三重培养试验:
   注意:除了BEC的单一培养测定，我们已经开发（ 图1B ），以确定预先形成的网络中BECs，周细胞和星形胶质细胞对相关压力因子（ 如 oAβ）的反应。在0 h时，BECs需要进行所需的治疗。 4小时后，将周细胞轻轻加入板中。在7小时后，将星形胶质细胞加入板中，然后在11小时加入应激物。然后将细胞孵育至24小时时间点。
   注意:对于三重培养测定，重要的是考虑时间以确保所有细胞同时融合。人星形胶质细胞和周细胞应在测定前1周进行培养，而hCMEC / D3细胞需要在测定日期前4-5天铺板或传代。此外，使用低通（2-5）原代细胞以避免表型漂移是重要的。
   1. 在开始测定前20分钟，将绿色细胞跟踪染色工作溶液加入到hCMEC / D3细胞中。将10cm的hCMEC / D3细胞平板化，000个细胞/孔在EBM-2基底（0小时时间点）。使用的体积是45μL细胞悬浮液和3.5μL处理（ 即最终EGF浓度为50ng / mL，100ng / mL或1,000ng / mL，浓度为20倍）。
   2. 在37℃下孵育3.5小时后，将蓝细胞跟踪染料工作溶液（EBM-2基质中的10μM细胞追踪蓝）加入到人类初级周细胞中。在4小时的时间点（用细胞追踪染料孵育〜30分钟），以6μL/孔的体积轻轻加入含有hCMEC / D3的平板上的2,000个周细胞/孔。
   3. 在另外2.5小时孵育（从0小时时间开始总共6.5小时）后，将橙色细胞跟踪染料工作溶液（EBM-2基础中的10μM细胞追踪器橙色）添加到人类原始星形胶质细胞。在7小时的时间点，轻轻地以12μL的体积向板中加入10,000个星形胶质细胞/孔。因此，内皮细胞的总体细胞比例:周细胞:星形胶质细胞s 5:1:5。此外，达到此目的的体积是66.5μL。
   4. 加入oAβ（3.5μL100μM储备液）4小时后（从0小时时间开始共11小时）。
   5. 在新鲜制备的4％多聚甲醛PBS中，13小时后将细胞固定。
      小心:在处理多聚甲醛时，戴防护服，手套和眼镜。

量化

1. 使用解剖显微镜以最大功率50％的2秒曝光时间以1.6倍放大倍数捕获96孔板的整个孔的荧光图像。
   注意:可以使用等效显微镜;然而，捕获整个井以进行综合分析至关重要。
2. 对于定量分析，使用ImageJ血管生成分析仪插件²²处理图像，以量化分支数，网格数和总细胞长度（这些读数由softwa自动列表re），如下所述。 图2中提供了此步骤的详细视觉协议。
   1. 点击软件图标打开fiji ImageJ。
   2. 单击位于工具栏末端的双红色向前箭头，然后单击"血管生成分析仪"。
   3. 选择带有图像文件的文件夹，单击"打开"。
   4. 当出现"分析设置"框时，单击"确定"。
   5. 出现"处理图像"框时，表示要处理的图像数，单击"确定"。
   6. 当出现"批量进度窗口"框时，表示预计处理时间。在此期间，程序对包括分支数，网格数和总细胞长度的输出进行量化。
      注意:一旦所有图像被量化，结果文件将作为电子表格文档显示在原始图像文件夹中。
   7. 选择电子表格文件包含结果并比较组之间的分支数，网格数和总细胞长度。
      注意:在三重培养测定中，ImageJ被进一步用于分析周细胞/星形胶质细胞的覆盖和数量。图像由盲人实验者和用于产生读数的"分析粒子"功能阈值。固定细胞和管状结构也可以用于Aβ17或其他标记物的免疫染色。

结果

在单个培养物中，hCMEC / D3细胞（ 图3A ）和主要小鼠BEC（ 图3B ）都在整个孔中形成网状结构。结构的特点是互连节点的网格（ 图3 ）。在所有描述的范例（ 图1 ）中，网状结构在对照组中24小时后相似，形成约20个网状结构，总细胞长度约为10,000个像素。

讨论

所描述的方法可用于解决围绕脑血管覆盖的几个基本生物学问题²⁴ 。具体来说，他们可以确定哪些受体和信号通路在血管发生，癌症组织中的血管覆盖以及与脑相关的外周内皮细胞中起作用。实例包括血管生成生长因子受体，一氧化氮，丝裂原活化蛋白激酶信号和钙信号传导^25,26,27 。 hCMEC / D3和主要BECs可修改为遗传敲打方法，以促进这一努力¹⁸

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cells	Milipore	SCC066
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156
Collagen Type 1	ThermoFisher	A1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media	Lonza	CC-4147
5% FBS	Lonza	CC-4147
10% Ascorbic acid	Lonza	CC-4147
10% Gentamycin sulphate	Lonza	CC-4147
25% Hydrocortisone	Lonza	CC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor	Lonza	CC-4147
Puromycin hydrochloride	VWR	80503-312
MEM-HEPES	Thermo Scientific	12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)	Worthington Biochemical	LK003150
Human pericytes	Sciencell	1200
Pericyte basal media	Sciencell	1201
Pericyte growth supplement	Sciencell	1252
Human Astrocytes	Sciencell	1800
Astrocyte media	Sciencell	1801
Astrocyte growth supplement	Sciencell	1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)	Corning	356231
Angiogenesis m-plates (96-well)	ibidi	89646
Human Epidermal growth factor	Shenendoah Biotechnology	100-26
CellTracker green	ThermoFisher	C7025
CellTracker orange	ThermoFisher	C34551
CellTracker blue	ThermoFisher	C2110
Poly-l-lysine	Sciencell	0403
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT5012-60ML
C57BL mice	Jackson Laboratory	na
PCR tube strips	GeneMate	T-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope	Zeiss	na