Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica

Resumen

El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.

Resumen

La cobertura de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC). El BBB es mantenido dinámicamente por astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (CEC). Aquí se detallan métodos para evaluar la cobertura de BBB usando cultivos únicos de BECs humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario y un modelo de cultivo triple humanizado (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. Para resaltar la aplicabilidad de los ensayos a estados de enfermedad, describimos el efecto de la amiloide oligomérica-β (oAβ), que es un contribuyente importante a la progresión de la enfermedad de Alzheimer (AD), en la cobertura de BBB. Además, utilizamos el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para iluminar el potencial de detección de fármacos de las técnicas. Nuestros resultados muestran que los BECs cultivados individuales y triples forman estructuras tipo malla bajo condiciones basales y que oAβ altera esta formación de malla celular y degenera las estructuras de malla preformadas,Pero EGF bloquea esta interrupción. Por lo tanto, las técnicas descritas son importantes para diseccionar procesos fundamentales y relacionados con la enfermedad que modulan la cobertura de BBB.

Introducción

La barrera hematoencefálica (BBB) ​​de los capilares cerebrales es la mayor interfase de contacto entre sangre y desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) ^{1 , 2} . Los procesos dinámicos en el BBB evitan la absorción de moléculas no deseadas de la sangre, eliminan los productos residuales del SNC, suministran nutrientes esenciales y señalan moléculas al SNC, y modulan la neuroinflamación ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} . El daño a la BBB es frecuente durante el envejecimiento y varios trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis múltiple y el accidente cerebrovascular ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,}Ass = "xref"> 6. Por lo tanto, la disfunción de la BBB puede desempeñar un papel clave en los trastornos neurodegenerativos, incluso como objetivo terapéutico.

Mantener la cobertura del buque es importante para las funciones homeostáticas de la BBB. Sin embargo, los datos in vivo e in vitro contradicen si los procesos implicados en trastornos neurodegenerativos causan una cobertura BBB más alta o más baja ^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} , particularmente en AD. Por lo tanto, existe una fuerte justificación para el desarrollo de modelos in vitro utilizando tipos de células relevantes para evaluar y comprender de manera más completa la dinámica de la cobertura BBB. Los capilares cerebrales están compuestos de astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (BEC) ^{3. Todos los tipos de células contribuyen a la función de la BBB a través del soporte estructural ya través de la secreción de moléculas efectoras tales como factores de crecimiento angiogénicos, citoquinas y quimiocinas que actúan en forma parácrina y autocrina. Sin embargo, las principales células efectoras de la BBB son BECs 3 . En general, las técnicas de cultivo celular para evaluar la función de BBB son ensayos de permeabilidad realizados en células crecidas en insertos de filtro, o la evaluación de niveles de proteínas BEC claves, después de la adición de factores de estrés 14 , 15 , 16 . Aunque son importantes, estos ensayos no se centran en la cobertura cerebrovascular.}

Aquí, nuestros métodos anteriores ¹⁷ se detallan para evaluar la cobertura de BEC y estructuras de malla-como utilizando culturas únicas de BEC humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario, y una triple cultura humanizadaModelo (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. El objetivo era demostrar el efecto perjudicial de oAβ, que se considera un importante contribuyente a la progresión de AD, en la cobertura de BEC. El efecto protector del factor de crecimiento epidérmico (EGF) pone de relieve el potencial de la técnica como una herramienta de cribado terapéutico. La técnica tiene varias aplicaciones amplias para la investigación básica y aplicada, incluyendo: 1) delinear el papel de las vías específicas en la angiogénesis y la cobertura de los vasos, 2) evaluar los efectos de la enfermedad y los factores relacionados con el envejecimiento sobre la angiogénesis y la cobertura vascular; Objetivos.

Protocolo

Todos los experimentos siguen los protocolos del Comité Institucional de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Illinois, Chicago.

1. Preparación General

NOTA: La línea celular endotelial microvascular del cerebro (hCMEC / D3) es una línea BEC humana inmortalizada extensamente caracterizada ^{14 , 15 , 16 , 18 , 19} . Cultivo de las células hCMEC / D3 en frascos de cultivo de tejidos recubiertos con colágeno tipo I (piel de ternero, dilución 1:20 de solución al 0,1% en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene Ca2 ⁺ y Mg2 ⁺ ) en basal Endothelial Growth Basal Medium (EBM-2) que contiene 2-5% de suero bovino fetal (FBS), 10% de ácido ascórbico, 10% de sulfato de gentamicina, 25% de hidrocortisona y 1/4 del volumen total de los suplementos de factor de crecimiento suministrados por 500 mL de medio [ Endotelio vascularFactor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) y factor de crecimiento fibroblástico básico humano (bFGF), véase Tabla de Materiales ].
NOTA: El medio EBM-2 con FBS y factores de crecimiento se conoce como "EBM-2 completo". EBM-2 sin FBS y suplementos se conoce como "EBM-2 basal". En la confluencia completa, las células hCMEC / D3 son ~ 1 x 10 ^ { ^5} células / cm ^ { ^2} .

1. Pasar las células hCMEC / D3 a una relación de 1: 5 incubando primero con HBSS durante 3 min sin Ca2 ⁺ y Mg2 ⁺ seguido de separación con 5 mL de tripsina / EDTA (0,25%) durante 5 min. Neutralizar la tripsina usando EBM-2 completa (neutralización 1: 1), y centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C; Desechar el sobrenadante. Resuspender el sedimento en EBM-2 completo y volver a planchar a razón de 1: 5.
2. Cultivo de los principales pericitos humanos y astrocitos según el protocolo del proveedor [ Tabla de Materiales ]. CulturE los pericitos en medio basal pericítico con FBS y suplemento de crecimiento pericítico.
3. Cultivar los astrocitos humanos en medio astrocito con factores de crecimiento de astrocitos. El cultivo tanto de los pericitos como de los astrocitos en matraces de cultivo de tejidos recubiertos con 3 ml de poli-L-lisina (PLL) para la adherencia celular y utilizan las células entre los pasos 2 y 5.
4. Euthanize 7 ratones y quitar los tallos del cerebro y el cerebelo con fórceps; Separar las meninges cuidadosamente rodando los cerebros en gasa. Picar el tejido cerebral restante en una placa de Petri en medio esencial mínimo (MEM) con HEPES (5 ml por cerebro) con una cuchilla de afeitar estéril. Aislar el ratón primario BEC de 2 meses de edad C57BL / 6J ratones de acuerdo con el protocolo de referencia ²⁰ .
5. Transferir el tejido cerebral picada a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante e incubar el tejido en una papaína (833,33 μ l por cerebro) y DNasa (41,7 μ l por cerebro), En un baño de agua a 37 ° C durante 1 h, para digerir el tejido.
6. Triturar el homogeneizado secuencialmente a través de agujas de calibre 19 y 21, mezclar a una relación 1: 1 con una solución de 22% de albúmina de suero bovino (BSA), y centrifugar a 1360 xg durante 10 min a 4ºC.
7. Resuspender el sedimento resultante en 1 mL EBM-2 completo y centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender nuevamente en 1 mL de EBM-2 completo y planchar las células (1 mL / pocillo) en placas de 6 pocillos recubiertas con colágeno (~ 1 cerebro por pocillo).
8. Sustituir el medio 24 h después con EBM-2 completo que contiene 4 μg / mL de clorhidrato de puromicina; Reemplazar con EBM-2 completo después de 2 días. Los BEC primarios se cultivan como para las células hCMEC / D3 y están en confluencia completa a 1 x 105 células / cm2.
9. Preparar un 100 μM de oAβ, 24 h antes del ensayo.
   NOTA: oAβ se considera la forma relevante para la enfermedad de A. Para el oAβ, utilice las preparaciones bien caracterizadas descritas por DahlgreN et al. ²¹ .
10. Descongele la solución madre de membrana basal durante la noche a 4 ° C y alícuota en tiras de tubo de PCR estériles (8 tubos) a 140 μL de membrana basal por tubo. Volver a congelar cada tira y almacenar a -20 ° C. Descongelar una tira por placa de 96 pocillos a 4 ° C, 24 h antes del ensayo. Pre-enfriar las puntas de la pipeta para evitar la solidificación.
    NOTA: Toda manipulación de la matriz de la membrana basal debe realizarse en hielo para evitar una rápida solidificación. Como 10 μL por pocillo de membrana basal se utiliza el día del ensayo, cada tira es suficiente para una placa de 96 pocillos.
11. Incubar BECs totalmente confluentes en EBM-2 basal, 24 h antes del ensayo.
    NOTA: La justificación es: EBM-2 completo contiene factores suplementados y FBS con el propósito de promover el crecimiento celular óptimo; Sin embargo, las mismas vías moleculares que promueven el crecimiento celular son también importantes para la cobertura y dinámica de células endoteliales cerebrales, tanto en presencia como en abseDe un factor de estrés. Por lo tanto, el suero y el suplemento privan a los CEB para reducir el efecto de confusión de la activación residual de las vías de señalización celular. De nota, las células se exponen brevemente (5 min) a FBS durante la neutralización de células tripsinizadas antes del ensayo. En contraste con los CEB, los pericitos y astrocitos no son sueros de hambre, debido a la necesidad de diferentes factores de crecimiento y la relativa inestabilidad de estos tipos de células en respuesta a la inanición de suero (Tai laboratorio, observaciones no publicadas).
    NOTA: La EBM-2 basal se utiliza durante el ensayo para ensayos de formación de malla de cultivo único y triple y de interrupción. Esto es crítico para prevenir la confusión del estrés o la señalización dependiente del tratamiento.

2. Ensayos de Formación y Disrupción similar a la malla

1. Ensayos individuales de cultivo BEC:
   NOTA: En la Figura 1A se muestran tres paradigmas diferentes para los cultivos únicos de BEC
2. En el día del ensayo, pipetear la matriz de la membrana basal a 10 μl / pocillo en el fondo de placas de 96 pocillos y dejar reposar durante 1 h a 37 ° C.
3. Suspender el colorante de rastreo de células verdes liofilizado (ver Tabla de Materiales ) en 10 μL de DMSO para generar una solución madre 10 mM y diluir hasta 10 μM (1: 1000) en EBM-2 basal. Eliminar el medio del matraz completamente confluente y sustituir con EBM-2 basal que contiene el colorante de seguimiento de células verdes (5 ml para un matraz de 75 cm ² ). Preload BECs con el colorante de seguimiento de células verdes, 20 min antes del inicio del ensayo.
4. Incubar las células durante 20-30 min a 37 ° C, eliminar el medio con el colorante de seguimiento de células, y separar las células como se describe en el paso 1.1. Neutralizar el medio con EBM-2 que contenga FBS al 10% y centrifugar a 240 xg durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el gránulo en 1 mL de EBM-2 basal.
5. Placa de los BECs en la placa de 96 pocillos a 10.000 células / pocillo en EBM-2 basal (0 h de tiempo en todos los paradigmas).
   NOTA: Dependiendo del paradigma que se esté utilizando, los tratamientos, factores de estrés o controles del vehículo se añaden en los puntos de tiempo especificados. En todos los paradigmas, el medio se recoge para su análisis posterior ( por ejemplo, análisis ELISA) y las células se fijan a las 24 horas con paraformaldehído 4% recién preparado en suero tamponado con fosfato (PBS). Como un enfoque alternativo para determinar el término efectos de oAβ en la formación de malla, el protocolo podría ser modificado para preincubar frascos de cultivo celular confluentes con oAβ, y luego realizar los paradigmas de formación de malla (+/- oAβ).
   NOTA: El volumen final en cada pozo para todos los paradigmas es de 70 μl. Todos los tratamientos (oAβ, EGF, etc. ) se añaden a sus pocillos respectivos a una dilución de 1:20, es decir, 3,5 μL por tratamiento. Para el Paradigma 1, las células se añaden en una solución de suspensión celular a 63 mu L / wana. Inmediatamente oAβ, los tratamientos deseados, y los controles se añaden a 3,5 μL / pocillo cada uno, dando un total de 70 μl. Para Paradigm 2, se añaden 63 μl de suspensión celular y 3,5 μl de tratamiento ( por ejemplo, 100 ng / ml de EGF) al instante de 0 h. Después de 4 h de incubación, se a~naden 3,5 μl de una reserva de oAβ ( por ejemplo, para 100 nM de concentración final de oAβ, 3,5 μl de 2 μM de material oAβ). Para Paradigm 3, se añaden 63 μl de suspensión celular al punto de tiempo 0 h ya las 4 h, se añaden oAβ y se añaden los tratamientos deseados a 3,5 μl / pocillo cada uno, dando un total de 70 μl. Estos volúmenes se pueden ajustar según los tratamientos. Por ejemplo, si sólo se requiere un tratamiento, el volumen de suspensión celular puede ajustarse a 66,5 μl (manteniendo 10.000 células / pocillo) y el volumen de tratamiento puede permanecer en 3,5 μl.

Ensayo de cultivo triple:
NOTA: Además de los ensayos de cultivo único de BECs, hemos desarrollado( Figura 1B ) para determinar la respuesta de BECs, pericitos y astrocitos dentro de las redes preformadas a factores de estrés relevantes ( por ejemplo, oAβ). Los BEC se sembraron en placas en presencia de los tratamientos deseados a 0 h. A las 4 h, los pericitos se añaden suavemente a la placa. A las 7 h, se añaden astrocitos a la placa, seguido por la adición de un factor de estrés a las 11 h. Las células se incuban a continuación hasta el punto de tiempo de 24 h.
NOTA: Para los ensayos de cultivo triple, es importante considerar el tiempo para asegurar que todas las células son confluentes al mismo tiempo. Los astrocitos y pericitos humanos deben cultivarse 1 semana antes del ensayo, mientras que las células hCMEC / D3 necesitan ser colocadas o pasadas 4-5 días antes de la fecha del ensayo. Además, es importante utilizar células de paso bajo (2-5) primarias para evitar la deriva fenotípica.

1. Añadir la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células verdes a las células hCMEC / D3 20 min antes de iniciar el ensayo. Placa las células hCMEC / D3 a 10ºC, 000 células / pocillo en EBM-2 basal (punto de tiempo 0 h). Los volúmenes utilizados son 45 μL de suspensión celular y 3,5 μL de tratamiento ( es decir, concentraciones finales de EGF de 50 ng / ml, 100 ng / ml, o 1.000 ng / ml de las poblaciones que son 20 veces más concentradas).
2. Después de la incubación de 3,5 h a 37ºC, añadir la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células azules (10 mu M de rastreador de células azul en EBM - 2 basal) a los pericitos primarios humanos. En el punto de tiempo de 4 h (~ 30 min de incubación con colorante de seguimiento de células), suavemente añadir 2.000 pericitos / pocillo a la placa que contiene el hCMEC / D3 en un volumen de 6 μ l / pozo.
3. Después de una incubación adicional de 2,5 h (total 6,5 h a partir de 0 h de tiempo), a~nadir a los astrocitos primarios humanos la solución de trabajo de colorante de seguimiento de células anaranjadas (naranja de 10 μM de células en naranja EBM-2 basal). En el punto de tiempo de 7 h, añadir suavemente 10.000 astrocitos / pocillo a la placa en volumen de 12 μL. Por lo tanto, la relación celular total para las células endoteliales: pericitos: astrocitos iS 5: 1: 5. Además, el volumen alcanzado hasta este punto es de 66,5 μl.
4. Añadir oAβ (3,5 μl de stock 100 μM) 4 h después (total 11 h desde 0 h de tiempo).
5. Fijar las células 13 h más tarde en 4% de paraformaldehído recién preparado en PBS.
   Precaución: Use guantes, guantes y gafas protectoras mientras manipula paraformaldehído.

3. Cuantificación

1. Captura las imágenes de fluorescencia del pozo entero de la placa de 96 pocillos a una ampliación de 1,6X con un tiempo de exposición de 2 s al 50% de potencia máxima usando un microscopio de disección.
   NOTA: Se pueden utilizar microscopios equivalentes; Sin embargo, es crítico capturar el pozo entero para el análisis comprensivo.
2. Para el análisis cuantitativo, procese las imágenes usando el complemento ^{22 del} analizador de angiogénesis de ImageJ para cuantificar el número de ramas, el número de mallas y la longitud total de la célula (estas lecturas son tabuladas automáticamente por la softwaRe) como se describe a continuación. En la Figura 2 se proporciona un protocolo visual detallado de este paso.
   1. Abra fiji ImageJ haciendo clic en el icono del software.
   2. Haga clic en las flechas de doble rojo hacia adelante ubicadas al final de la barra de herramientas, luego haga clic en "Angiogenesis Analyzer".
   3. Seleccione la carpeta con archivos de imagen, haga clic en "Abrir".
   4. Cuando aparezca el cuadro "Configuración para el análisis", haga clic en "Aceptar".
   5. Cuando aparezca el cuadro "Procesar imágenes", que indica el número de imágenes a procesar, haga clic en "Aceptar".
   6. Cuando aparezca la ventana "ventana de progreso por lotes", que indica el tiempo de procesamiento estimado. Durante este tiempo, el programa cuantifica las salidas incluyendo el número de ramas, el número de mallas y la longitud total de la célula.
      NOTA: Una vez que todas las imágenes se cuantifican, el archivo de resultados aparecerá en la carpeta de imagen original como un documento de hoja de cálculo.
   7. SeleccionarEl archivo de hoja de cálculo que contiene los resultados y comparar el número de ramas, mallas y la longitud total de la celda entre los grupos.
      NOTA: En el ensayo de cultivo triple ImageJ se utiliza además para analizar la cobertura y el número de pericitos / astrocitos. Las imágenes son marcadas por un experimentador ciego y la función "analizar partículas" utilizada para generar lecturas. Las células fijas y las estructuras similares a tubos pueden también inmunomarcarse para Aβ17 u otros marcadores.

Resultados

En cultivos únicos, tanto las células hCMEC / D3 ( Figura 3A ) como las BECs primarias de ratón ( Figura 3B ) forman estructuras tipo malla en todo el pozo. Las estructuras se caracterizan por una red de nodos interconectados ( Figura 3 ). En todos los paradigmas descritos ( Figura 1 ), las estructuras tipo malla son similares después de 24 h en los grupos de contro...

Discusión

Los métodos descritos pueden ser utilizados para abordar varias cuestiones biológicas fundamentales en torno a la cobertura cerebrovascular [ ^24] . Específicamente, pueden identificar qué receptores y vías de señalización desempeñan un papel en la angiogénesis, la cobertura vascular en el tejido canceroso y las células endoteliales periféricas relevantes para el cerebro. Los ejemplos incluyen receptores del factor de crecimiento angiogénico, óxido nítrico, señalización de proteín...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
hCMEC/D3 cells	Milipore	SCC066
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156
Collagen Type 1	ThermoFisher	A1064401
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14025092
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher	14175095
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media	Lonza	CC-4147
5% FBS	Lonza	CC-4147
10% Ascorbic acid	Lonza	CC-4147
10% Gentamycin sulphate	Lonza	CC-4147
25% Hydrocortisone	Lonza	CC-4147
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor	Lonza	CC-4147
Puromycin hydrochloride	VWR	80503-312
MEM-HEPES	Thermo Scientific	12360-038
Papain cell dissociation system (papain and DNase1)	Worthington Biochemical	LK003150
Human pericytes	Sciencell	1200
Pericyte basal media	Sciencell	1201
Pericyte growth supplement	Sciencell	1252
Human Astrocytes	Sciencell	1800
Astrocyte media	Sciencell	1801
Astrocyte growth supplement	Sciencell	1852
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)	Corning	356231
Angiogenesis m-plates (96-well)	ibidi	89646
Human Epidermal growth factor	Shenendoah Biotechnology	100-26
CellTracker green	ThermoFisher	C7025
CellTracker orange	ThermoFisher	C34551
CellTracker blue	ThermoFisher	C2110
Poly-l-lysine	Sciencell	0403
10% Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT5012-60ML
C57BL mice	Jackson Laboratory	na
PCR tube strips	GeneMate	T-3014-2
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope	Zeiss	na